Ochranný účinok tubulozidu B na Apoptózu vyvolanú TNFαom v neuronálnych bunkách

ABSTRAKTNÝ

CIEĽ: Na vyšetrenie neuroprotektívneho účinku tubulozidu B, jedného z fenyletanoidy izolované od stoniekCistanche salsa, na nádor nekrózový faktor-alfa (TNFα) vyvolaná apoptóza v neurónovej SH-SY5Y bunky.METÓDY: Životaschopnosť buniek bola analyzovaná pomocou testu MTT. Apoptotické bunky sú zistené pomocou Hoechst33342staining a potvrdené fragmentáciou DNA a prietoková cytometrická analýza. Aktivita kaspázy-3 bola meraná so špeciálnou testovacou súpravou. Koncentrácia voľného vnútrobunkového vápnik bol určený sondouIndo-1 spektrometrom. Úroveň intracelulárnych reaktívnych druhov kyslíka a potenciál mitochondriálna membrána bola určená laserovým skenovaním konfokálnych mikroskopia (LSCM) v kombinácii s fluorescenčnou sondouH2DCFDA alebo JC-1 resp. VÝSLEDKY: Bunky SH-SY5Y ošetrené TNFα 100 μg/L počas 36 hodín vykazovali typické morfologické zmeny apoptózy. Dna rebrík môže byť pozorované elektroforézou agarózového gélu. Najvyššie percento apoptotické bunky nahromadené na 37,5 %. Po 36 hodinách liečby TNFα, akumulácia intracelulárnych ROS a [Ca2+] I a zníženie pozoroval sa potenciál mitochondriálnej membrány a aktivita kaspázy-3 V porovnaní s kontrolami sa zvýšil približne päťnásobne. Však predúprava s tubulozidom B (1, 10 alebo 100 mg/l) počas 2 h oslabených apoptóza sprostredkovaná TNFαom. Antiapoptotický účinok tubulozidu Bbol čiastočne závislý od antioxidačných stresových účinkov, udržiavanie funkcia mitochondrií, zníženie koncentrácie voľného vnútrobunkového vápnik a inhibícia aktivity kaspázy-3. ZÁVER: Tubulozid B má neuroprotektívnu schopnosť znepriateliť si apoptózu vyvolanú TNFα v bunkách SH-SY5Y a môže byť užitočný pri liečbe niektorých neurodegeneratívnych Chorôb.

ZAVEDENIE

Apoptóza hrá dôležitú homeostatickú úlohu v niekoľkých bunkových procesoch, ako aj vo vývoji nervového systému[ 1]. Programovaná bunková smrť môže tiež prispieť k rôznym patologickým stavom, ako je mozgová ischémia[2,3], neurodegeneratívne poruchy, ako je Alzheimerova choroba, Parkinsonova choroba, Huntingtonova choroba a amyotrofická laterálna skleróza[4-7]; ako aj oneskorená encefalopatia po akútnej otrave oxidom uhoľnatým[8]. Niekoľko línií dôkazov silne naznačuje, že oxidačný stres, bunková nerovnováha medzi produkciou a elimináciou reaktívnych druhov kyslíka (ROS), viedla k neurónovej apoptóze anekróze[9-11]. Preto je cenné identifikovať zlúčeniny, ktoré si môžu znepriateliť škodlivé pôsobenie ROS a pôsobiť ako antioxidant na ochranu neurónov pred apoptózou.

Tubulozid B je jedným z fenyletanoidov izolovaných zo stoniekCistanche salsa, čínska bylinná medicína, ktorá je dôležitým surovým liekom používaným ako antiselén aj proti únavové činidlo[12]. Ukázalo sa, že niekoľkofenyletanoidov má vlastnosti zachytávania voľných radikálov a chráni toxické poranenia spôsobené oxidačným stresom[13-15]. Tumor nekróza faktor-alfa (TNFα) je toxicky interferujúce činidlo kvôli jeho dôležitej úlohe pri neurodegeneratívnych ochoreniach. Smrť nekrózou alebo apoptózou bola pozorovaná ako reakcia na TNFα[16]. Mnohé štúdie naznačujú, že oxidačný stres hrá rozhodujúcu úlohu v mechanizme bunkovej apoptózy sprostredkovanej TNFα. Zvýšené hladiny ROS boli zdokumentované v bunkách po liečbe TNFαom[17,18] a smrť sprostredkovaná TNFαom môže byť inhibovaná voľnými radikálmi[19]. Preto sme študovali, či tubulozid Bcanprotect proti apoptóze vyvolanej TNFα a oxidačnému stresu v kultivovaných neurónových bunkách SH-SY5Y.

MATERIÁLY A METÓDY

Reagenty

Modifikované orlie médium (MEM) a sérum hovädzieho dobytka plodu (FBS) boli zakúpené od spoločnosti GIBCO/BRL. Chromatínové farbivo bisbenzimid (Hoechst 33342), Poly-L-lyzín, 3-(4,5-dimetylthiazal-z-yl)-2,5-difenyltetrazolium (MTT), TNFα a 2,7-dichlorodihydrofluoresceín diacetát (H2DCFDA) boli získané od Spoločnosti Sigma Chemical Company (St Louis, MO, USA). Súprava na detekciu apoptózy fluoresceínu v fluoresceínu (FITC) bola zakúpená v spoločnosti Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN, Nemecko). 5,5',6,6'-Tetrachlorálne-1,1',3,3'-tetraetyl benzimidazol karburocyanín jodid (JC-1) a Indo-1/AM boli zakúpené z molekulárnych sond (Leiden, TheNetherlands). Testy Caspase-3 a extrakčné súpravy DNA boli získané z Promega (USA). Tubulozid B odCistanche salsaBol láskavý dodaný Dr. Peng-fei TU (Peking University Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine). Čistota zlúčenín bola viac ako 98 % pri vysokovýkonnej kvapalinovej chromatografii (HPLC). Všetky ostatné činidlá alebo lieky boli analytickej kvality.

Bunková kultúra a liečba

Neurónové SH-SY5Ycells získané z ATCC sa udržiavali v MEMsupplementovaných 10 % FBS, 100 KU/L benzylenicillínom a 100 mg/l streptomycínmi v poly-L-lyzínom potiahnutej kultivačnej banke vo zvlhčenom inkubátore s 5 % CO2 pri 37 °C. Kultivačné médium sa obnovovalo každé 2 až 3d. Bunky boli predtreté rôznymi koncentráciami tubulozidu B (1, 10 alebo 100 mg/l) počas 2 h a potom sa pred analýzou ošetrili 100 μg/L TNFαom počas 36 hodín. Normálne bunky boli považované za kontrolu.

Analýza životaschopnosti buniek

Životaschopnosť buniek bola určená použitím testu MTT[20]. Bunky boli nasadené do 96-jamkových dosiek pri 1×104 bunkách na jamku a pestované na 70 % sútoku v kultivačných médiách. Médium bolo nahradené médiom obsahujúcim rôzne koncentrácie tubulozidu B počas 2 hodín a potom TNFα počas 36 hodín. Celkom 5 g / l MTT sa pridalo do každej jamky po 36 hodinách a kultúra pokračovala v inkubácii ďalších 4 h pri 37 ° C. Po odstránení média boli bunky a kryštály farbiva solubilizované 200 μL dimetylzulfoxidom (Me2SO) a absorbancia bola meraná pri 570 nm pomocou modelovej čítačky mikroplatne ELX-800 (One Lambda Inc).

Hoechst 33342 farbenie

Po ošetrení tubulozidom B a/alebo TNFα sa bunky zozbierali a upevnili 4 % paraformaldehydom na 30 minút pri teplote 25 °C, potom sa trikrát umyli predchladeným fyziologickým roztokom fosforečnanového tlmivého roztoku (PBS) a trikrát sa vystavili 10 mg/l Hoechst33342 pri izbovej teplote v tme počas 10 minút. Vzorky sa pozorovali pri fluorescenčnej mikroskopii (Olympus RX 400)[21].

Analýza fragmentácie DNA

DNA bola extrahovaná pomocou súpravy na extrakciu DNA (Promega) podľa pokynov výrobcu. Stručne povedané, vzorka DNA s objemom 10 μl bola naložená na 1,5 % horizontálnych agarózových gélov obsahujúcich emidbromid etidudu. Gély sa bežali pri teplote 60 V po dobu 1 h a fragmenty DNA boli vizualizované pomocou UV osvetlenia[22].

Experiment s väzbou Annexin-V

Súprava na detekciu apoptózy AnnexinV-FITC bola použitá na viazanie anexínu-V, ktorý má silnú afinitu k fosfatidylserínu a môže sondovať apoptózu[23]. Stručne povedané, bunky boli zozbierané a suspendované v viažucom pufri pri konečnej koncentrácii buniek 1×106 buniek/ml. Približne 1×105cells bolo inkubovaných v tme s annexin-V a propidium jodid po dobu 15 minút. Potom bola suspenzia analyzovaná pomocou cytometra skenného prietoku FACS (Becton Dickinson, Heidelberg, Nemecko). Fluorescencia súvisiaca s lagin-VFITC a propidium jodidom boli zaznamenané na fl1-H (525 nm) a FL2-H (575 nm) filtroch.

Skúška aktivity Caspase-3

Aktivita Caspase-3 bola zistená použitím skúšobnej súpravy Apo-ONETM HomogeneousCaspase-3 (Promega). Stručne povedané, bunky boli nasadené do 96-jamkových dosiek pri 1×104 bunkách / jamke. Po vystavení rôznym koncentráciám tubuloziduB a/alebo TNFα sa bunky umyli ľadovo studenou PBS. Potom sa zmiešali 1 μL Z-DEVD-R110 a 99 μL kaskápového tlmivého roztoku, aby sa vytvorila homogénna kaspáda-3reagentná. Do každej jamky sa pridalo celkom 100 μL homogénneho činidla caspázy-3. Obsah sa jemne premiešal a inkuboval 4 hodiny pri izbovej teplote v tme. Intenzita fluorescencie substrátu Z-DEVD-R110 bola meraná pri excitačnej vlnovej dĺžke 498 nm a emisnej vlnovej dĺžke 521 nm s použitím mikroplatňového spektrfluorometra (Wallac Victor2) TM 1420 Multilabel Counter, USA).

Stanovenie intracelulárnej hladiny ROS intracelulárnej

Hladiny ROS sa merali použitím metódy farbenia fluorescenčného farbiva H2DCFDA[24]. H2DCFDA je nepolárna zlúčenina, ktorá sa po zapracovaní do buniek premieňa na nefluorescenčnú polárnu deriváciu (H2DCF) bunkovými esterázami. H2DCF je membrána nepriepustná a rýchlo oxidovaná na vysoko fluorescenčný 2,7-dichlórofluoresceín (DCF) v prítomnosti intracelulárneho ROS[25]. Bunky kultivované na sklenených krytoch v každej skupine boli inkubované počas 30 minút pri teplote 37 °C, pričom H2DCFDA 20 μmo/L sa rozpustil v PBS. Kryty boli potom trikrát umyté PBS a analyzované konfokálnou laserovou mikroskopiou (Leica, Nemecko). DCF bol nadšený pri 488 nm a emisný filter bol 510 nm bariérový filter. Fluorescenčná intenzita a konfokálne laserové mikroskopické snímky boli konštantné, aby sa umožnilo porovnanie relatívnej fluorescenčnej intenzity medzi kontrolnými a experimentálnymi bunkami.

Test potenciálu mitochondriálnej membrány

Potenciál mitochondriálnej membrány buniek som si bol istý použitím sondy JC-1[26]. JC-1 môže vstúpiť do mitochondrií selektívne, čo sa javí ako zelené pri nízkych koncentráciách alebo nízkom membránovom potenciáli ako monomér. Pri vysokých koncentráciách sa však mitochondrie prejavujú ako červené fluorescenčné agregáty. JC-1 je citlivý na potenciál mitochondriálnej membrány a zmeny pomeru medzi zelenou a červenou fluorescenciou môžu poskytnúť informácie o potenciáli mitochondriálnej membrány. Po naložení ošetrených buniek JC-1 1 μmol/L počas 10 minút pri teplote 37 °C bolo fluorescenčné farbivo vzrušené pri 490 nm a fluorescenčná intenzita monomérnych aj agregovaných molekúl bola zaznamenaná pri 590 nm pod konfekčnou skenovacou laserovou mikroskopiou.

[Ca2+]i merania

Voľná vnútrobunková koncentrácia vápnika ([Ca2+]i) buniek SHSYY bola stanovená sondou Indo-1 metódou opísanou Rego et al[27]. Po ošetrení TNFα (v prítomnosti alebo neprítomnosti tubulozidu B) boli bunky SHSYY naložené 3 μmolom Indo-1/AM v MEM počas 45 minút, pri teplote 37 °C a ďalej inkubované počas 15 minút v MEM, aby sa umožnila hydrolýza prekurzora acetoxymetyl esteru sondy. Po opláchnutí soľným roztokom sodným (s 1,5 mmol/l CaCl2) sa fluorescencia buniek merala pri teplote 37 °C v luminiscenčnom spektrometri s excitáciou pri 335 nm a emisiami pri 410 nm. [Ca2+] Bol som vypočítaný podľa rovnice:

[Ca2+]i=250 nmol/L×[(F-Fmin)/(Fmax-F)] (nmol/L),

kde 250 nmol/l zodpovedá disociačnej konštante komplexného Indo-1–Ca2+, Fmax je maximálna fluorescencia získaná pridaním 3 ¦Ìmol/Lionomycín a Fmin je minimálna fluorescencia stanovená podľa rovnice: Fmin=AF+1/12(Fmax-AF), kde AF je autofluorescencia získaná pridaním 3 mmol/L MnCl2.

Štatistická analýza

Výsledky boli vyjadrené akomean±SD troch hodnôt pre každý experiment. Štatistické porovnania zahŕňali použitie Student-S-testu. P<0.05 was="" considered="" to="" be="" statistically="">

VÝSLEDKY

Účinok tubulozidu B na bunkovú jadrovú morfológiu

Farbenie Hoechst 33342, ktoré je citlivé na DNA, sa použilo na posúdenie zmien v jadrovej morfológii po ošetrení tubulozidom B a TNFα. Jadrá v normálnych bunkách boli normálne a vykazovali rozptýlené sfarbenie chromatínu (obr. 1A). Po expozícii TNFα 100 μg/L počas 36 hodín však SH-SY5Ycells prešli typickými morfologickými zmenami apoptózy, ako je kondenzovaný chromatín a scvrknuté jadro (obr. 1B). Výrazný pokles bol pozorovaný v bunkách predtretých tubulozidom B (obr. 1C-1E).

Neuroprotektívny účinok tubulozidu B na životaschopnosť buniek

Po inkubácii TNFαom približne 45, 6 % buniek podstúpilo apoptózu smrťou. Predbežná liečba tubulozidom B (1, 10 alebo 100 mg/l) znížila úmrtnosť buniek spôsobom závislým od dávky (úmrtnosť buniek bola 30 %, 19,5 % a 6, 2 %; Obr. 2), ale samotný tubulozid B nespôsobil žiadnu zjavnú cytotoxicitu (údaje neukázali).

Účinok tubulozidu B na fragmentáciu DNA

Po expozícii buniek SH-SY5Y TNFα počas 36 hodín sa pozorovalo typicky výrazné rebríkovanie DNA. Avšak bunky pred liečbou tubulozidom B inhibovali rebríkovanie DNA sprostredkované TUBULOZIDom B, najmä v koncentrácii 100 mg/ l, ktoré úplne inhibujú fragmentáciu DNA (obr. 3).

Účinok tubulozidu B na expozíciu fosfolipid fosfatidylserínu

Antiapoptotický účinok tubulozidu B bol tiež potvrdený meraním prítomnosti fosfatidylserínu na vonkajšej bunkovej membráne. Pri kontrole je asi 96,3% buniek zdravých. Obr. 4 ukázal výsledky experimentov viažucich k annexín-V na meranie prítomnosti fosfatidylserínu na vonkajšej bunkovej membráne. Percento apoptózy bolo 37,5 % po liečbe TNFαom (obr. 4B), ale podiel klesol na 28,2 %,19,29 % a 7,9 % s predúpravkou 1, 10 alebo 100 mg/l tubuloziduB (obr. 4C- 4E).

Inhibičný účinok tubulozidu B na tvorbu ROS

V tejto štúdii boli z buniek SH-SY5Y získané typické konfokálne laserové mikrografy počas 36 hodín v neprítomnosti alebo prítomnosti TNFα a tubuloziduB. Hladina ROS generovanej v bunkách indukovaných TNFαom sa v porovnaní s kontrolami výrazne zvýšila (obr. 5B). Intenzita fluorescencie v bunkách ošetrených tubulozidom B sa však znížila o 16,2 %, 56,4 % a o 89,7 % pri liečbe 1,10 alebo 100 mg/l tubulozidom B v porovnaní s bunkami ošetrenými TNFα (obr. 5C- 5E).

Účinok tubulozidu B na potenciál mitochondriálnej membrány

Neliečené kontrolné bunky vykazovali početné, jasne zafarbené mitochondrie, ktoré emitovali červeno-oranžovú fluorescenciu a pomer červenej/zelenej farby bol 5,97±0,21, čo naznačovalo normálny vysoký membránový potenciál (obr. 5A). TNFα-liečba-indukovala prechod v priepustnosti mitochondrií a významnú stratu membránového potenciálu (pomer červenej a zelenej bol 0,35±0,02) (obr. 5B). Liečba tubulozidom inhibovala kolaps potenciálu mitochondriálnej membrány vyvolaného TNFαom v SH-SY5Ycells so zvyšujúcim sa dávkovaním. Tubulozid B postupne obnovil potenciál mitochondriálnej membrány so zvyšujúcimi sa koncentráciami, ako je indikované opätovným objavením sa červeného mitochondriálneho zafarbenia (Obr6C-6E).Účinok tubulozidu B na aktivitu kaspázy-3

Aktivita Caspase-3 sa zvýšila asi päťnásobne v porovnaní s kontrolami po expozícii TNFα (obr. 7). Naproti tomu bunky SH-SY5Y, ktoré boli súčasne predtrené tubulozidom B 1, 10 alebo 100 mg/l, vykazovali významný pokles aktivity kaspázy-3 v porovnaní s bunkami vytvorenými TNFα v rovnakom časovom bode (obr. 7).

Účinok tubulozidu B na úrovni [Ca2+]i

Hladina [Ca2+] I v bunkách indukovaných TNFαom sa výrazne zvýšila v porovnaní s kontrolami (kontrola: 105,5±11,2nmol/L; 100 μg/L TNFα: 238,4±18,9 nmol/l), ktorá bola čiastočne znížená predtrením tubulozidom B(10 alebo 100 mg/L) (obr. 8).

DISKUSIA

CistanchesSalsa(Ca Mey) G Beck, jeden druhCistanchesktorá patrí do čeľade Orobanchaceae, je parazitická rastlina pôvodom zo severozápadu Číny. Stonka tejto rastliny je dôležitou tradičnou čínskou medicínou a používa sa na nedostatok obličiek, ženskú neplodnosť, morbídnu leucorrheu, neurasténiu a senilnú zápchu v dôsledku zotrvačnosti hrubého čreva. Hlavnými aktívnymi zložkami tejto byliny sú fenyletanoid glykozid[28]. V posledných rokoch výsledky niekoľkých štúdií poukázali na funkciu tubulozidu B pri podpore rôznych farmakologických a biologických aktivít[13-15]. Bunkové a molekulárne mechanizmy, ktoré sú základom činnosti, však nie sú úplne pochopené. Súčasná štúdia preukázala, že tubulozid B mal významné neuroprotektívne účinky na apoptózu vyvolanú TNFαom v bunkách SH-SY5Yneuronal tým, že udržiaval mitochondriálnu funkciu, znižoval tvorbu ROS, znižoval hladinu vnútrobunkového vápnika a inhiboval aktivitu kaspázy-3 prostredníctvom antioxidačného mechanizmu. Tieto mechanizmy môžu byť prostredníctvom individuálneho neuroprotektívneho účinku tubulozidu B alebo jeho interakcie s inými faktormi a potom môžu viesť k zníženiu pomeru apoptózy v bunkách.

Predchádzajúce štúdie ukázali, že oxidanty alebo prooxidanty sú dôležitými regulátormi apoptózy a môžu vyvolať apoptózu[29,30]. Oxidačný stres je bežným prvkom apoptózy vyvolanej rôznymi podnetmi, ako je TNFα a vystavenie toxínom v životnom prostredí, ktoré zvyčajne nevyvíjajú priamy oxidačný účinok. Ústredná úloha oxidačného stresu pri apoptóze je silne podporovaná schopnosťou rôznych bunkových antioxidantov blokovať apoptózu vyvolanú rôznymi činidlami[31]. Zlúčeniny s antioxidačnými vlastnosťami by mohli mať ochranný účinok v rôznych situáciách bunkovej dysfunkcie prostredníctvom zachytávania voľných radikálov[32]. Okrem toho bolo hlásené, že niekoľko fenylpropanoidných glykozidov má vlastnosti zachytávania voľných radikálov a chráni toxické poranenia spôsobené oxidačným stresom. V súlade s touto myšlienkou sme zistili, že tubulozid B znížil hladinu ROS indukovanej TNFαom, mohol by chrániť neuróny pred apoptózou priamym zachytávaním intracelulárnych reaktívnych druhov kyslíka.

Mnohé dôkazy naznačujú, že veľké zmeny v mitochondriálnych funkciách boli kriticky zapojené do apoptotického procesu[33]. Zistilo sa, že poruchy homeostázy vápnika a zmeny potenciálu mitochondriálnej membrány podporujú otvorenie prechodových pórov mitochondriálnej priepustnosti (MPTP) alebo indukujú uvoľňovanie cytochrómu c prostredníctvom mechanizmov nezávislých od MPTP, ktoré sú priamo zodpovedné za aktiváciu apoptotickej kaskády a môžu predchádzať jadrovým príznakom apoptózy[34]. Tieto biochemické zmeny môžu byť výsledkom striedania funkcie mitochondrií[35]. Fakty, že tubulozid B inhiboval zníženie potenciálu mitochondriálnej membrány a znížil nárast intracelulárneho vápnika vyvolaného TNFαom, naznačujú, že tubulozid B môže mať schopnosť pôsobiť proti toxicite TNFα tým, že inhibuje otvorenie MPTPandu potláčajúceho dysfunkciu mitochondrií.

Vonkajšie podnety môžu iniciovať apoptózu prostredníctvom vyššie uvedených mechanizmov a môžu sa zbiehať na kaskádovej dráhe, aby vykonali poslednú fázu apoptotického procesu[36]. Kaskádová rodina proteáz sa skladá z najmenej 14 členov cicavcov, ktoré sú konštitutívne vyjadrené takmer vo všetkých typoch buniek ako neaktívne proenzýmy (zymogeny), ktoré sa spracúvajú a aktivujú v reakcii na rôzne pro-apoptotické podnety[37]. Caspase-3 je následným členom kaskády kaskády a pôsobí ako centrálny efektor vo fáze vykonávania. Keď sa kaskápový-3 prekurzorový proteín CPP32 aktivuje protiprúdovými signálmi, ako je uvoľňovanie mitochondriálneho cytochrómu c, aktívna kaskáda-3kleaves špecifické aspartátové rezíduá v proteínoch s rôznymi štrukturálnymi, domácimi a regulačnými funkciami[38-40]. Tieto proteolytické udalosti môžu viesť k bunkovej apoptóze a prispieť k fragmentácii DNA a jadrovým morfologickým zmenám. Látky, ktoré môžu inhibovať aktivitu kaspázy-3, by teda mohli chrániť bunky pred apoptózou[2,31]. Keďže tubulozid B výrazne inhiboval aktivitu kaspázy-3 v bunkách liečených TNFαom, má neuroprotektívnu kapacitu.

Na záver, tubulozid B mal multifunkčný ochranný účinok na poškodené neuróny. Vzhľadom na svoju silnú anti-apoptózu a antioxidačné stresové aktivity môže byť na klinické použitie pri neurodegeneratívnych a neurologických postihnutiach zahŕňajúcich neurónovú apoptózu.