Peroxidácia lyzozomálnych lipidov reguluje imunitu nádoru

Lysozomálna inhibícia vyvolaná inhibítormi palmitoyl-proteíntioesterázy 1 (PPT1), ako je DC661, môže spôsobiť bunkovú smrť, ale mechanizmus tohto nie je úplne známy. Na dosiahnutie cytotoxického účinku DC661 neboli potrebné programované dráhy bunkovej smrti (autofágia, apoptóza, nekroptóza, feroptóza a pyroptóza). Inhibícia katepsínov alebo chelatácia železa alebo vápnika nezachránila cytotoxicitu indukovanú DC661-. Inhibícia PPT1 indukovala peroxidáciu lyzozomálnych lipidov (LLP), ktorá viedla k permeabilizácii lyzozomálnej membrány a bunkovej smrti, ktorú bolo možné zvrátiť antioxidantom N-acetylcysteínom (NAC), ale nie inými antioxidantmi peroxidácie lipidov. Na intralyzozomálny transport NAC a záchranu LLP bol potrebný lyzozomálny cysteínový transportér MFSD12. Inhibícia PPT1 vyvolala bunkovú vnútornú imunogenicitu s povrchovou expresiou kalretikulínu, ktorú bolo možné zvrátiť iba pomocou NAC. Bunky ošetrené DC{11}} primovali naivné T bunky a zvýšili toxicitu sprostredkovanú T bunkami. U myší očkovaných bunkami ošetrenými DC661- sa vytvorila adaptívna imunita a odmietnutie nádoru v „imunitných horúcich“ nádoroch, ale nie v „imunitných studených“ nádoroch. Tieto zistenia ukazujú, že LLP riadi smrť lyzozomálnych buniek, jedinečnú imunogénnu formu bunkovej smrti, čo ukazuje cestu k racionálnym kombináciám imunoterapie a lyzozomálnej inhibície, ktoré možno testovať v klinických štúdiách.

Výhody cistanche tubulosa-Protinádorové

Úvod

S povzbudivou aktivitou v klinických štúdiách, ktoré zahŕňajú lyzozomálny inhibítor hydroxychlorochín (HCQ) (1), identifikáciou palmitoylproteínovej tioesterázy 1 (PPT1) ako molekulárneho cieľa derivátov chlorochínu (2) a uvedením nových inhibítorov PPT1 do klinickej praxe V štúdiách (3, 4) je potrebné pochopiť mechanizmus, ktorým lyzozomálne inhibítory indukujú bunkovú smrť a účinok lyzozomálnej inhibície na nádorovú imunitu. Kanonický mechanizmus smrti lyzozomálnych buniek opísaný pre HCQ zahŕňa permeabilizáciu lyzozomálnej membrány (LMP), únik katepsínov a aktiváciu apoptózy sprostredkovanej kaspázou (5, 6). Už sme predtým ukázali, že lyzozomálny inhibítor DC661 preniká do buniek v kyslom nádorovom mikroprostredí a lokalizuje sa do lyzozómu efektívnejšie ako HCQ (2, 7). DC661 spôsobuje silnú bunkovú smrť v mnohých rakovinových bunkových líniách (2). DC661 viaže a inhibuje PPT1, deacidifikuje lyzozóm a inhibuje autofágiu. DC661 tiež indukuje LMP a zvyšuje hladiny štiepenej kaspázy 3 (2, 7). V posledných rokoch boli definované nové mechanizmy bunkovej smrti, ktoré majú imunogénne dôsledky a zahŕňajú nekroptózu, feroptózu a pyroptózu (8). Ukázalo sa, že autofágia závislá od lyzozómov degraduje MHC triedy I (9), ako aj zložky imunoproteazómu (10), čo naznačuje, že inhibícia autofágy môže zvýšiť spracovanie antigénu. Avšak imunogénne účinky lyzozomálnej inhibície a následnej bunkovej smrti neboli úplne charakterizované. Aby sme vyriešili túto medzeru vo vedomostiach, skúmali sme účinky DC661 na kanonické mechanizmy bunkovej smrti, aby sme určili, či je smrť lyzozomálnych buniek jej formou bunkovej smrti alebo jednoducho prekurzorom jedného z ďalších zavedených mechanizmov. Zistili sme, že HCQ a DC661 vyvolali významné zvýšenie iba malého počtu proteínov v proteóme melanómu a väčšina z nich boli proteíny súvisiace s autofágiou a apoptózou. Inhibítory programovanej bunkovej smrti (apoptóza, nekroptóza, ferroptóza a pyroptóza) nezmiernili cytotoxické účinky po lyzozomálnom poškodení pomocou DC661. Lysozomálna lipidová peroxidácia (LLP) je hlavnou hnacou silou LMP-indukovanej bunkovej smrti spojenej s expresiou kalretikulínu (CALR) na bunkovom povrchu. Túto formu bunkovej smrti je možné zvrátiť iba použitím antioxidantu N-acetylcysteínu (NAC). Aktivita NAC bola narušená inhibíciou importéra lyzozomálneho cysteínu MFSD12. LLP vyvolalo imunogénne fenotypy podporujúce zabíjanie sprostredkované T bunkami. Tieto zistenia ukazujú, že smrť lyzozomálnych buniek je potenciálne jedinečná forma imunogénnej bunkovej smrti.

cistanche rastlina zvyšujúca imunitný systém

Výsledky

Lysozomálna inhibícia indukuje významné zmeny v proteóme spojené s autofágiou a apoptózou. Na stanovenie cytotoxických účinkov lyzozomálnych inhibítorov sme hodnotili životaschopnosť A375P melanómu, RKO karcinómu hrubého čreva a MIA PaCa-2 bunkových línií rakoviny pankreasu liečených vakuolárnym inhibítorom H+-ATPázy bafilomycínom-A1 (1 00 nM); inhibítory PPT1 DC661 (3 uM) alebo HCQ (10 uM alebo 30 uM); palmitátový mimetický hexadecylsulfonylfluorid (HDSF; 60 uM); inhibítory katepsínu pepstatín A (PepA; 10 ug/ml), E64 (PepA; 10 ug/ml) alebo PepA+E64; a hydrobromid metylesteru Leu-Leu narušujúceho lyzozomálnu membránu (20 uM) počas 48 hodín. Iba bafilomycín-A1 a DC661 spôsobili významné zníženie životaschopnosti buniek v rakovinových bunkových líniách (obrázok 1A a doplnkový obrázok 1A; doplnkový materiál dostupný online v tomto článku; https://doi.org/10.1172/JCI164596DS1), pričom DC661 produkuje výraznejšie zníženie životaschopnosti buniek ako bafilomycín-A1. Na základe týchto údajov a farmakologických vlastností derivátov chlorochínu podobných liekom sme našu štúdiu zamerali na deriváty chlorochínu ako nástroje na pochopenie smrti lyzozomálnych buniek. Nezaujatá globálna proteómová analýza bola aplikovaná na bunky melanómu A375P ošetrené DC661 (3 uM) alebo menej potentným HCQ (10 uM alebo 30 uM) počas 24 hodín. Zo 4 264 vysoko spoľahlivých kvantifikovaných proteínov bolo iba 87 a 55 proteínov významne zvýšených s DC661 (3 μM) a HCQ (30 μM), v uvedenom poradí; okrem toho sa 14 a 15 proteínov významne znížilo s DC661 (3 μM) a HCQ (30 μM), v tomto poradí (absolútna násobná zmena väčšia ako 2; q < 0,05) s DC661 (3 μM) alebo HCQ (30 μM). v porovnaní s ovládaním vozidla. Nižšia dávka HCQ (10 μM) nevykazovala žiadne významné zmeny proteínov v porovnaní s kontrolou s vehikulom. 50 najlepších proteínov, ktoré boli významne zvýšené po liečbe DC661, bolo spojených hlavne s autofágiou a apoptózou a podobné zmeny boli pozorované pri vyššej dávke HCQ (obrázok 1B). Z týchto dôvodov sme sa rozhodli zamerať ďalšie štúdie na silnejší DC661. Príklady niektorých z najväčších zmien proteínov spojených s autofágiou a apoptózou boli proteín 1 viažuci tax1- (TAX1BP1; zvýšený 15-násobne); BCL2-interagujúci proteín 3 (BNIP3; zvýšený 6-násobne); sused proteínu génu 1 BRCA1 (NBR1; zvýšené 12--násobne); sekvestozóm-1 (SQSTM1/p62; zvýšené 5-násobne); koaktivátor jadrového receptora 4 (NCOA4; zvýšený 3--násobne); a LC3B (MAP1LC3B; zvýšené 3--násobne). Apolipoproteín B-100 (APOB; zvýšený 66-násobne) bol odvodený z fetálneho teľacieho séra a ďalej sa neštudoval. Imunoblotting potvrdil, že liečba DC661 alebo vyššími koncentráciami HCQ spôsobila výrazné zvýšenie expresie autofágových nákladných receptorov NBR1, TAX1BP1, SQSTM1/p62 a NCOA4 spôsobom závislým od dávky a času (doplnkový obrázok 1, B a C). CRISPR / Cas9 KO PPT1 v bunkách A375P fenokopíroval účinky DC661 na tieto proteíny v porovnaní s ich náprotivkami WT (doplnkový obrázok 1D). Expresia autofagických cargo receptorov a relatívne zvýšenia indukované liečbou DC661 však boli variabilné v rámci rakoviny hrubého čreva, rakoviny pankreasu a iných melanómových bunkových línií, v ktorých DC661 vykazuje cytotoxicitu (doplnkový obrázok 1E). To naznačuje, že samotné autofágne cargo receptory, aj keď sú zvýšené na proteínovej úrovni, pravdepodobne nebudú zodpovedné za bunkovú smrť po liečbe DC661. Aby sme to potvrdili, zamerali sme sa na autofágne cargo receptory TAX1BP1 a BNIP3, pretože majú známe proapoptotické účinky v rakovinových bunkách (obrázok 1C). TAX1BP1 je autofagický nákladný adaptér (11) a tiež reguluje apoptózu indukovanú inhibítormi syntézy proteínov alebo činidlami poškodzujúcimi DNA v rakovinových bunkách (12). Knockdown TAX1BP1 pomocou siRNA (obrázok 1D) neovplyvnil DC{119}}indukovanú cytotoxicitu v krátkodobých (obrázok 1E) a dlhodobých testoch životaschopnosti (obrázok 1F). Tieto výsledky ukázali, že TAX1BP1 nehrá zásadnú úlohu v cytotoxicite sprostredkovanej DC{126}}. BNIP3 je proapoptotický proteín, ktorý poškodzuje mitochondriálnu bioenergetiku a reguluje mitofágiu (13). Efektívny knockdown BNIP3 (obrázok 1G) neovplyvnil DC{131}}indukovanú cytotoxicitu (obrázky 1, H a I). Tieto výsledky ukázali, že cytotoxické účinky DC661 sú nezávislé od expresie BNIP3. Ďalej sme študovali účinky deplécie buniek kanonických autofágových génov potrebných na produkciu autofagozómov na účinnosť DC661 zrazením unc{136}}, ako je autofágia aktivujúca kináza 1 (ULK1) a gén 7 súvisiaci s autofágiou (ATG7). Efektívny knockdown ULK1 alebo ATG7 (doplnkový obrázok 2, A a B) inhiboval autofagický tok (doplnkový obrázok 2C), ale neovplyvnil cytotoxicitu indukovanú DC 661- (obrázok 1, J–M). Tieto výsledky ukázali, že neprítomnosť základného mechanizmu autofágie nezruší cytotoxické účinky DC661. Lysozomálna inhibícia pomocou DC661 indukuje viaceré dráhy programovanej bunkovej smrti. Kanonické hľadisko je, že smrť lyzozomálnych buniek je spôsobená apoptózou (5). Imunoblotting odhalil, že liečba DC661 viedla k aktivácii kaspázy-3, -7 a -9 a štiepeniu PARP-1, čo potvrdzuje, že DC661 aktivoval apoptózu (obrázok 2A). Inhibítor pan-kaspázy Z-VAD-FMK zabránil aktivácii kaspázy pomocou DC661, ale neinhiboval akumuláciu LC3B a p62, čo dokazuje, že aktivácia apoptózy a blokáda autofágy sú oddeliteľné po lyzozomálnej inhibícii (obrázok 2B). Blokovanie apoptózy pomocou ZVAD-FMK nezvýšilo ani neobmedzilo cytotoxicitu DC661, čo naznačuje, že apoptóza je pre smrť lyzozomálnych buniek nevyhnutná (obrázok 2, C a D). Cytotoxické účinky DC661 boli podobné v Bax/Bak double-KO primárnych bunkách kostnej drene neschopných podstúpiť apoptózu a WT bunkách (obrázok 2E). Blokáda apoptózy neovplyvnila DC{171}}indukovanú cytotoxicitu v bunkách rakoviny hrubého čreva a rakoviny pankreasu (doplnkový obrázok 2, D–F). Pretože sme zistili, že apoptóza je nevyhnutná pre bunkovú smrť indukovanú DC{173}}, skúmali sme, či DC661 indukuje nekroptózu, inú formu programovanej bunkovej smrti regulovanú proteínkinázou interagujúcou s receptorom (RIPK) a proteínom podobným kinázovej doméne zmiešanej línie ( MLKL). Hladiny fosforylovaných a aktivovaných foriem RIPK a MLKL sa zvýšili po liečbe DC661 z 0, 1–1 μM (obrázok 2F). Pri 3 μM DC661 bola absencia fosforylovaného RIPK1, ale perzistentný fosforylovaný MLKL, čo naznačuje, že pri tejto vyššej koncentrácii by sa mohli zapojiť ďalšie formy bunkovej smrti. Predbežná liečba inhibítormi RIPK1 nekrostatínmi{186}} alebo nekrostatínmi{187}} alebo inhibítorom MLKL nekrosulfónamidom zabránila fosforylácii RIPK1 po liečbe DC661 (1 μM) v melanómových bunkách (obrázok 2G), ale nepodarilo sa zachrániť DC{192 }} indukovala cytotoxicitu v bunkách melanómu (obrázok 2H) alebo rakovine hrubého čreva alebo rakovinových bunkách pankreasu (doplnkový obrázok 2G). Tieto zistenia naznačujú, že nekroptóza je aktivovaná, ale je nevyhnutná pre bunkovú smrť sprostredkovanú DC{195}}.

Obrázok 1. Inhibícia lyzozomálnej autofágie indukuje významné zmeny v apoptóze a autofágových proteínoch. (A)

Lyzozómy sú jedným z hlavných miest na ukladanie železa. Dysregulovaný intracelulárny metabolizmus železa spojený so zníženou redukčnou kapacitou môže spustiť neapoptotickú bunkovú smrť známu ako ferroptóza. Charakteristickým znakom feroptózy je upregulácia prostaglandín-endoperoxid syntázy 2 (PTGS2), homológu 1 regulátora transportu katiónu (CHAC1) a cysteinyl-tRNA syntetázy (CARS) (14). Všetky 3 tieto markery ferroptózy boli transkripčne upregulované liečbou DC661 (obrázok 3A), čo naznačuje, že lyzozomálna inhibícia indukuje ferroptózu. DC661 vyvolal posun fluorescencie v bunkách A375P ošetrených C11–BODIPY, čo naznačuje peroxidáciu lipidov, charakteristickú pre ferroptózu. Tento DC661-indukovaný posun bol významne zvrátený v prítomnosti inhibítorov ferroptózy ferrostatínu-1 alebo liproxstatínu-1 podávaných v účinnej koncentrácii (obrázok 3B a doplnkový obrázok 3A), čo ďalej naznačuje, že DC661 indukovaná feroptóza. Inhibícia ferroptózy však nezachránila cytotoxicitu spojenú s DC661 (obrázok 3, C a D). Spoločné ošetrenie rakovinových buniek chelátorom železa deferoxamínom (DFO) a DC661 nezachránilo cytotoxicitu DC661 (obrázok 3E). Liečba ferostatínom-1, roxstatínom na pery-1 alebo DFO nezachráni DC661 inhibíciu krátkodobej životaschopnosti alebo dlhodobého klonogénneho rastu v bunkách rakoviny melanómu, hrubého čreva a pankreasu (doplnkový obrázok 3, B –E a doplnkový obrázok 4, A–D). Tieto údaje dokazujú, že ferroptóza je aktivovaná, ale je nevyhnutná pre bunkovú smrť sprostredkovanú DC{31}}. Pyroptóza je forma programovanej bunkovej smrti spojenej so zápalovou odpoveďou, ktorá zahŕňa aktiváciu kaspáz, ktoré spracovávajú gastrín (GSDM), čo umožňuje tvorbu pórov na plazmatickej membráne a následné uvoľnenie molekulárnych vzorcov spojených s poškodením, ako je vysoká pohyblivosť. skupinový box 1 (HMGB1). Liečba DC661 vo viacerých melanómových bunkových líniách (A375P, A375, WM35 a WM793) viedla k aktivácii iniciačnej kaspázy-8 a -9 a popravnej kaspázy-7, ktorá je typická pre pyroptózu, a produkovala štiepenie GSDME s plnou dĺžkou, podobného rozsahu ako známy induktor pyroptózy PLX4720 a PD0325901 (doplnkový obrázok 5A). DC661 produkoval silnejšie extracelulárne uvoľňovanie HMGB1 ako známy induktor pyroptózy, BRAF a inhibícia MEK v 1% FBS (15), čo odráža funkčný dôsledok aktivovanej pyroptózy. Ďalej sme testovali, či by inhibícia pyroptózy pomocou GSDME KO zlepšila cytotoxické účinky DC661. Liečba DC661 vyvolala akumuláciu LC3II a SQSTM1 / p62 a aktiváciu kaspázy, ale uvoľňovanie HMGB1 bolo takmer úplne zrušené v ľudských bunkách GSDME-KO WM35, čo dokazuje, že sa dosiahol funkčný dôsledok inhibície pyroptózy (obrázok 3F). Ošetrenie DC661 však vyvolalo rovnakú cytotoxicitu v YUMM1.7 WT, prázdnom vektore (EV) a bunkách Gsdme KO1 a KO2 v podmienkach 10% aj 1% FBS (obrázok 3G a doplnkový obrázok 5B). Jedným bežným výsledkom viacerých foriem bunkovej smrti je uvoľnenie LDH. DC661 spôsobil významné zvýšenie uvoľňovania LDH, čo sa nedalo zvrátiť apoptózou, nekroptózou alebo inhibíciou ferroptózy (doplnkový obrázok 5C). Tieto výsledky ukázali, že DC661 indukuje viaceré spôsoby bunkovej smrti, vrátane apoptózy a pyroptózy, ako aj nekroptózy a ferroptózy, ale žiadny z týchto spôsobov bunkovej smrti nie je potrebný na bunkovú smrť indukovanú DC{73}}. Inhibícia katepsínu alebo chelatácia vápnika nezabráni bunkovej smrti v dôsledku permeabilizácie lyzozomálnej membrány. Po preukázaní, že aktivácia kaspázy (ktorá je potrebná pre apoptózu a pyroptózu) je nevyhnutná pre bunkovú smrť indukovanú DC{74}}, predpokladali sme, že uvoľňovanie katepsínu z lyzozómov by mohlo spôsobiť bunkovú smrť závislú od kaspázy. Chemická (DC661) alebo genetická (PPT1 siRNA [siPPT1]) inhibícia PPT1 spôsobila permeabilizáciu lyzozomálnej membrány (LMP), zatiaľ čo HDSF, menej účinný ireverzibilný inhibítor PPT1, ktorý sa rýchlo vyčerpáva v bunkovej kultúre, nemohol indukovať LMP, ako bolo merané galektínom-3-pozitívnou puncta (obrázok 4A). LMP vedie k uvoľňovaniu katepsínov a iného lyzozomálneho obsahu do cytoplazmy a považuje sa za kľúčový proximálny znak bunkovej smrti založenej na lyzozómoch. LMP indukovaná DC661 bola spojená s významným zvýšením aktivity cytoplazmatického katepsínu-L, ktorá bola významne blokovaná inhibítorom cysteínovej proteázy E64 (obrázok 4B). Predchádzajúce správy naznačujú, že uvoľňovanie katepsínu z zlomených lyzozómov podporuje aktiváciu kaspázy, čo vedie k apoptotickej bunkovej smrti (16–18). Úplná inhibícia katepsínu nezabránila štiepeniu kaspázy (obrázok 4C) a nezachránila DC{92}}indukovanú cytotoxicitu v krátkodobých a dlhodobých testoch životaschopnosti pri melanóme (obrázok 4, D a E), rakovine hrubého čreva a pankreasu rakovinové bunky (doplnkový obrázok 6, A–C). Tieto výsledky sú v rozpore s kanonickým pohľadom na smrť lyzozomálnych buniek spôsobenú katepsínom sprostredkovanou bunkovou smrťou. Okrem uvoľňovania katepsínu z netesných lyzozómov sa uvoľňovanie vápnika z lyzozómov podieľa na bunkovej dysfunkcii, keď je PPT1 narušený (19). Liečba DC661 viedla k rozsiahlemu uvoľňovaniu vápnika, ktoré bolo zrušené predbežnou úpravou bunkového permanentného vápnikového (Ca{101}}) chelátora BAPTA-AM. (Obrázok 4F). Je pozoruhodné, že BAPTA-AM nezabránil DC{105}}indukovanému LMP (obrázok 4G) alebo štiepeniu kaspázy (doplnkový obrázok 6, D a E) a čo je najdôležitejšie, nezachránil DC{108}}indukovanú cytotoxicitu ( Obrázok 4H). Tieto zistenia boli tiež pozorované v bunkových líniách RKO a MIA PaCa{110}}, v ktorých neboli pozorované žiadne významné rozdiely v hodnotách IC50 s BAPTA-AM a DC661 (doplnkový obrázok 6F), čo naznačuje, že bunková smrť spojená s LMP je nezávisí od vápnika alebo katepsínov.

Obrázok 2. DC661-indukovaná apoptóza a nekroptóza. (A)

Obrázok 3. Ferroptóza a pyroptóza indukovaná DC661-. (A)

LLP poháňa LMP. Po zistení, že inhibítory hlavných dráh bunkovej smrti (apoptóza, nekroptóza, feroptóza a pyroptóza), katepsíny (PepA a E64) a chelátory iónov (BAPTA-AM [Ca2+] a DFO [Fe{{3} }]) nezabránilo bunkovej smrti pomocou DC661 a pri zistení dôkazov o peroxidácii lipidov pomocou C-11-BODIPY sme vykonali globálnu lipidómovú analýzu 2 a 4 hodiny po liečbe DC661. DC661 indukoval skoré a trvalé 3- až 10-násobné zvýšenie v každej triede lyzofosfolipidov (obrázok 5A). Na rozdiel od toho boli pozorované minimálne alebo žiadne zmeny vo fosfolipidových triedach, vrátane fosfatidylcholínu, fosfatidyletanolamínu, fosfatidylserínu, fosfatidylinozitolu, fosfatidylglycerolu a kyseliny fosfatidovej (doplnkový obrázok 7A). Lyzofosfolipidové druhy môžu byť generované ROS, ktorý oxiduje reťazec nasýtených mastných kyselín, ktorý je potom odštiepený fosfolipázami (20). Aby sme určili, či antioxidanty môžu zabrániť poškodeniu lipidov sprostredkovanému ROS, skúmali sme DC661-indukovanú cytotoxicitu v prítomnosti pan-ROS vychytávača N-acetylcysteínu (NAC) (21, 22) a predpokladaných inhibítorov peroxidácie lipidov Trolox (23 ) a vitamín C (kyselina askorbová) (24, 25). Na rozdiel od iných doteraz testovaných činidiel spoločná liečba s NAC zachránila cytotoxicitu spojenú s DC661- vo viacerých bunkových líniách (obrázok 5B a doplnkový obrázok 7B). Dlhodobé testy CFU ukázali, že NAC, na rozdiel od všetkých tu testovaných inhibítorov bunkovej smrti, chelátorov iónov a inhibítorov katepsínu, zabránil cytotoxickým účinkom DC661 v bunkách A375P, RKO, MIA PaCa-2, B16F10 a MC38 ( Obrázok 5C a doplnkový obrázok 7C). Je zaujímavé, že Trolox a vitamín C nezachránili cytotoxicitu DC661 u ľudského melanómu, kolorektálneho karcinómu, buniek rakoviny pankreasu a myších buniek melanómu a kolorektálneho karcinómu (obrázok 5D a doplnkový obrázok 7, D–H). Tento rozdiel nás podnietil otestovať, či NAC, Trolox a vitamín C ovplyvňujú LMP. Naše výsledky ukázali, že NAC bol jediný antioxidant, ktorý významne znížil LMP indukovaný DC661-(obrázok 5E). Predpokladali sme, že LLP riadi produkciu LMP pomocou DC661, čo môže byť zvrátené pomocou NAC, ale nie pomocou Troloxu a vitamínu C. Na štúdium procesu LLP sme použili fluorescenčnú sondu FOAM-LPO (26), ktorá sa špecificky lokalizuje do lyzozómu a produkuje spektrálny posun z 586 na 512 nm (červená na zelenú) pri vystavení lipidovým peroxidom. Zistili sme, že DC661 indukoval LLP v porovnaní s kontrolou (obrázok 5F). NAC znížil peroxidáciu lipidov v lyzozómoch buniek melanómu ošetrených DC{48}}, zatiaľ čo Trolox a vitamín C nedokázali znížiť LLP (obrázok 5F). NAC, Trolox a vitamín C samotné nemali významný vplyv na peroxidáciu lipidov. Knockdown PPT1 (doplnkový obrázok 8A) alebo ošetrenie vysokými koncentráciami HCQ (doplnkový obrázok 8B) tiež vyvolalo LMP, ktoré by sa dalo zvrátiť pomocou NAC, zatiaľ čo chemická inhibícia ULK1 nevyvolala LMP (doplnkový obrázok 8C). Dôležité je, že knockdown siPPT1 zahŕňal aj LLP, ktorý by sa dal zvrátiť pomocou NAC (doplnkový obrázok 8D) Tieto výsledky ukázali, že inhibícia PPT1 indukuje LLP, ktorú môže NAC zachrániť, a je pravdepodobne príčinou LMP vyvolanej inhibíciou PPT1-. Ďalej tieto zistenia naznačujú, že LLP je kritický pre smrť lyzozomálnych buniek.

Čínska bylina cistanche rastlina-Protinádorová

Import cysteínu do lyzozómov pomocou MFSD12 zmierňuje smrť lyzozomálnych buniek. Z 3 inhibítorov peroxidácie lipidov iba NAC zabránil LLP. Nedávna správa ukázala, že hlavná doména superrodiny facilitátora obsahujúca 12 (MFSD12) je základnou zložkou dovozcu cysteínu pre lyzozómy a melanozómy (27). Usúdili sme, že NAC alebo jeho metabolit cysteín sa transportuje do lyzozómu cez MFSD12, kde sa cysteín oxiduje na svoj disulfid, cysteín. Na testovanie tejto hypotézy sme porovnali schopnosť NAC zachrániť cytotoxicitu DC661 v bunkách siNT a siMFSD12 A375P-hGal3-EGFP. Naše výsledky ukázali, že NAC zachránila DC661-indukovanú LMP v bunkách siNT, ale nezachránila LMP v bunkách siMFSD12 (obrázok 6A). NAC znížil LLP buniek siNT-A375P ošetrených DC{14}}, ale nie buniek siMFSD12. Bunky siMFSD12 ošetrené DMSO alebo NAC mali zvýšený bazálny LLP (obrázok 6B) v porovnaní s bunkami siNT. Zatiaľ čo NAC zachránil DC661 cytotoxicitu v siNT bunkách, schopnosť NAC zachrániť DC661 cytotoxicitu bola úplne zrušená v siMSFD12 bunkách (obrázok 6C). To ukázalo, že knockdown MFSD12 blokuje cytoprotektívne účinky NAC proti DC661. NAC je deacetylovaný acylázou v cytosóle (28). Aby sme určili, či liečba NAC spôsobuje akumuláciu cysteínu alebo cystínu v lyzozómoch, použili sme techniku ​​lyzozomálnej imunoprecipitácie (Lyso-IP) (29) na čistenie lyzozómov z buniek A375P ošetrených DMSO a NAC (obrázok 6D a doplnkový obrázok 9A) a vykonali sme cielená metabolomika na kvantifikáciu NAC a súvisiacich metabolitov. Ako sa očakávalo, NAC sa detegoval v lyzáte celých buniek ošetrenom NAC a súvisiacich neviazaných frakciách. Hladiny L-cysteínu boli podstatne zvýšené v lyzozómoch ošetrených NAC. L-cystín bol detekovateľný iba v lyzozómoch ošetrených NAC. Prekvapivo sme nenašli významné zvýšenie glutatiónu (redukovaného) v skupinách liečených NAC (obrázok 6E); to bolo prekvapujúce, pretože sa bežne verí, že ošetrenie NAC indukuje zvýšenú produkciu glutatiónu, čím sa upravuje redoxná rovnováha. Tieto výsledky naznačujú, že cysteín importovaný do lyzozómov prostredníctvom importéra MFSD12 je rozhodujúci pre záchranu LLP, LMP a smrti lyzozomálnych buniek. LLP je imunogénny. Niektoré formy regulovanej bunkovej smrti indukovanej DC661 (pyroptóza, nekroptóza, feroptóza) boli identifikované ako imunogénne. V minulosti bola imunogénna bunková smrť opísaná pre chemoterapeutické lieky na základe charakteristických znakov, ktoré zahŕňajú zobrazenie molekulárnych vzorov spojených s poškodením, vrátane expresie CALR na bunkovom povrchu a uvoľňovania proteínu HMGB1 a adenozíntrifosfátu (ATP) (30). CALR pôsobí ako signál „jedz ma“, keď je vystavený bunkovým povrchom počas bunkového stresu. Extracelulárne uvoľňovanie HMGB1 a ATP pôsobí ako signál „nájdi ma“ rozpoznávaný fagocytárnymi bunkami. Porovnali sme dva modely: bunky B16F10, ktoré v modeloch syngénnych nádorov takmer úplne nemajú lymfocyty infiltrujúce nádor, a bunky MC38, ktoré v modeloch syngénnych nádorov majú lymfocyty infiltrujúce nádor. Najprv sme demonštrovali, že ošetrenie DC661 alebo siPpt1 významne indukuje povrchovú expresiu CALR, ktorú možno úplne zrušiť spoločnou liečbou NAC v bunkách MC38 (obrázky 7, A a B). Podobné nálezy boli pozorované v bunkách B16F10 (obrázok 7C). Inhibítory hlavných dráh bunkovej smrti (apoptóza, nekroptóza, feroptóza a pyroptóza) nedokázali zabrániť povrchovej expresii CALR (obrázok 7D). Aby sa určilo, či je imunogénna bunková smrť indukovaná DC661 spôsobená upreguláciou MHC I. triedy, bunky B16F10 a MC38 boli ošetrené DC661 (3 uM) alebo DMSO počas 24 hodín. Zistili sme, že liečba DC661 nezvýšila expresiu MHC triedy I a upreguláciu imunoproteazómu (obrázok 7E a doplnkový obrázok 9, B a C).

Obrázok 4. Inhibícia katepsínu alebo chelatácia vápnika nezabráni bunkovej smrti indukovanej DC661-. (A)

Aby sme pochopili účinky autofágovej inhibície na aktiváciu T buniek, uskutočnili sme experiment in vitro priming a kokultivácie s použitím splenocytov C57BL6/J, ako už bolo opísané (31). Na priming sme vystavili splenocyty bunkám B16F10 alebo MC38 ošetreným DC661- alebo DMSO. Ďalej sa tieto aktivované splenocyty kultivovali so živými bunkami B16F10 alebo MC38 a merala sa cytotoxicita (obrázok 8A). Splenocyty primované bunkami B16F10 ošetrenými DC{12}}produkovali významné zvýšenie IFN- v porovnaní so splenocytmi vystavenými bunkám B16F10 ošetreným DMSO. Zabíjanie proliferujúcich B16F10 buniek sprostredkované aktivovanými T bunkami sa významne zvýšilo v splenocytoch aktivovaných DC661- v porovnaní so splenocytmi aktivovanými DMSO (obrázok 8, B a C). Bunky MC38 ošetrené DC661 produkovali ešte viac IFN- a primárnej cytotoxicity T buniek v porovnaní s bunkami B16F10 (obrázok 8, D a E). Spoločná liečba NAC s DC661 bola schopná úplne zrušiť uvoľňovanie IFN- zo splenocytov a otupiť primárnu cytotoxicitu T buniek (obrázok 8, F a G). Knockdown kalretikulínu pomocou siCalr v MC38 bunkách (doplnkový obrázok 9D) zrušil primárnu účinnosť liečby DC661 a významne znížil primárnu cytotoxicitu T-buniek (obrázok 8, H a I). Celkovo tieto údaje podporujú mechanickú úlohu upregulácie CALR spojenej s LLP pri podpore imunity protinádorových buniek T. Ďalej sme tieto zistenia in vitro rozšírili na štúdiu protinádorovej vakcinácie in vivo na modeloch imunokompetentných a imunodeficientných myší. Pre tento test boli in vitro zmrazené a rozmrazené bunky B16F10 alebo MC38 ošetrené in vitro subkutánne na ľavý bok na ochranu imunokompetentných myší C57BL/6 alebo NOD/SCID pred opätovným nasadením živých nádorových buniek rovnakého druhu. O 7 dní neskôr do pravého boku (obrázok 9A). Bunky B16F10 ošetrené DC661-zlyhali pri prevencii odmietnutia nádoru napriek in vitro testom, čo naznačuje, že DC661 indukoval imunogénnu bunkovú smrť (obrázok 9B a doplnkový obrázok 9E). Na rozdiel od toho, očkovanie jedného boku bunkami MC38 ošetrenými DC661- podporilo úplné odmietnutie živých buniek MC38 implantovaných na opačný bok (obrázok 9C a doplnkový obrázok 9F). Aby sme určili, či je adaptívna imunita kritická pre účinok vakcíny, ktorý sa zdá mať DC661 s nádormi MC38, zopakovali sme experiment na myšiach NOD/SCID. Prekvapivo sme zistili, že bunky MC38 ošetrené DC{61}} neindukovali odmietnutie nádorov opätovnej expozície u imunodeficientných NOD/SCID myší (obrázok 9D a doplnkový obrázok 9G), čo naznačuje, že pre pozorovaný účinok vakcíny bola potrebná adaptívna imunita. Aby sme otestovali robustnosť tohto zistenia, vybrali sme inú dobre známu bunkovú líniu imunogénnej myšacej rakoviny, CT26, a uskutočnili sme vakcinačný experiment, ako je uvedené vyššie. Ako sa očakávalo, implantácia buniek CT26 ošetrených DC661- do jedného boku myši vyvolala účinok podobný vakcíne a zabránila rastu živých buniek CT26 implantovaných do druhého boku (obrázok 9E a doplnkový obrázok 9H). Naše zistenia naznačujú, že DC661-indukovaný LLP je kritický pre imunogénnu bunkovú smrť sprostredkovanú LMP, ktorá je zvrátená importom cysteínu do lyzozómu lyzozomálnym transportérom MFSD12 (obrázok 9F).

Diskusia

Lysozomálna inhibícia sa v predklinických štúdiách javí ako sľubný terapeutický prístup a klinické štúdie HCQ priniesli povzbudivé, ale zmiešané výsledky (1, 32). PPT1 je molekulárnym cieľom HCQ a účinnejšie inhibítory PPT1, ako napríklad DC661 (2) a GNS561 (3), indukujú bunkovú smrť sprostredkovanú LMP in vitro. Presný mechanizmus smrti lyzozomálnych buniek a jeho úloha v imunogenicite nádoru nebola úplne objasnená. Protinádorová imunita sa zvyšuje, keď sa inhibícia autofágie kombinuje s imunoterapiou (9, 10, 31). Navrhované mechanizmy pre bunkovú vnútornú imunogenicitu po autofágovej inhibícii zahŕňajú MHC triedu I a upreguláciu imunoproteazómu, ktoré podporujú zlepšené spracovanie a prezentáciu antigénu. Okrem toho strata autofágových proteínov alebo autofágová inhibícia chlorochínom zosilnili odpoveď CD{13}} T buniek zvýšením povrchových hladín MHC triedy I v dendritických bunkách (33). Predtým sme ukázali, že systémová inhibícia PPT1 môže repolarizovať makrofágy z fenotypu M2 na M1. Inhibítory PPT1 môžu zvýšiť hladiny STING, čo vedie k uvoľňovaniu IFN a rozšíreniu zabíjania sprostredkovaného T bunkami v modeloch melanómu (31). Tu sme demonštrovali, že samotný LLP produkuje imunogénnu formu bunkovej smrti s vlastnou nádorovou bunkou. Zistili sme, že lyzozomálna inhibícia vyvolala len veľmi málo proteínových zmien v rakovinových bunkách a medzi najvýznamnejšie zvýšené proteíny patrili autofágne cargo receptory a regulátory apoptózy. Náš prístup zameraný na niektoré z týchto génov naprieč funkciami ukázal, že proteíny vyvolané liekmi neboli pravdepodobne hlavnými regulátormi bunkovej smrti. Genetická inhibícia ULK1 alebo ATG7 tiež nezachránila cytotoxicitu DC661. Preukázali sme, že lyzozomálna inhibícia aktivuje viaceré formy programovanej bunkovej smrti, vrátane apoptózy, nekroptózy, feroptózy a pyroptózy, ale každá z nich bola nevyhnutná pre cytotoxicitu vyvolanú liekom. Je potrebné poznamenať, že mechanizmy programovanej bunkovej smrti sa môžu prekrývať a spoločné zacielenie viacerých mechanizmov bunkovej smrti by mohlo poskytnúť cytoprotekciu proti bunkovej smrti po permeabilizácii lyzozomálnej membrány. Naša práca vylúčila mechanizmy lyzozomálnej bunkovej smrti závislé od katepsínu a vápnika a zdôraznila dôležitosť LLP ako kritického determinantu bunkovej smrti. Našli sme dôkaz o LLP, ktorý bol reverzibilný antioxidantom, ktorý bol transportovaný do lyzozómu, NAC a bol kritický pre permeabilizáciu lyzozomálnej membrány a cytotoxicitu. NAC bol jediným činidlom schopným zmierniť alebo zvrátiť bunkovú smrť indukovanú DC{27}}a táto kapacita bola závislá od prítomnosti lyzozomálneho cysteínového transportéra MFSD12. Nedostatok lyzozomálnej penetrácie je pravdepodobný dôvod, prečo iné predpokladané inhibítory peroxidácie lipidov, Trolox a vitamín C, neboli schopné zabrániť cytotoxicite DC661. NAC sa premieňa na cysteín, ktorý sa importuje do lyzozómov a oxiduje na svoju disulfidovú formu, cystín. Cystín je exportovaný do cytosolu ďalším lyzozomálnym transportérom, cystinózou, kde sa redukuje na cysteín, ktorý remobilizuje vnútorné zdroje živín, reaktivuje cieľ rapamycínového komplexu 1 a podporuje autofágiu (34). Tento oxidačno-redukčný cyklus cysteínu na cystín (lyzozómy) a späť na cysteín (cytosol) by mohol byť možným záchranným mechanizmom NAC proti cytotoxicite DC661 alebo všeobecnejšiemu lyzozomálnemu poškodeniu v iných kontextoch ochorenia, kde sa NAC ukázalo ako užitočné terapeuticky (35) . NAC nielenže zvrátil DC661-indukované LLP a LMP, ale aj povrchovú expresiu imunogénneho markera bunkovej smrti kalretikulínu. Expresia proteínu CALR na bunkovom povrchu bola potrebná pre zvýšenú cytotoxicitu sprostredkovanú T bunkami indukovanú splenocytmi aktivovanými DC661-, čo dokazuje, že lyzozomálna inhibícia produkuje špecifickú formu bunkovej imunogenicity.

Zatiaľ čo predchádzajúce štúdie preukázali, že lyzozomálna inhibícia môže zvýšiť protinádorovú aktivitu inhibície imunitného kontrolného bodu v etablovaných nádoroch na boku (9, 31), naša štúdia je prvou, o ktorej vieme, že demonštruje účinok podobný vakcíne na nádory MC38, ale nie na nádory B16 v nádorové bunky vopred ošetrené DC661 pred implantáciou. To demonštruje, že smrť lyzozomálnych buniek môže indukovať bunkovú vnútornú imunogenicitu, ale tieto zmeny samy osebe pravdepodobne nestačia na to, aby zvrátili „imunitne chladné“ nádorové mikroprostredie na „imunitne horúce“ nádorové mikroprostredie. Naše predchádzajúce štúdie na modeloch nádorového mikroprostredia „imunitného chladu“ B16 a BRafCA PtenloxP Tyr: CreERT2 geneticky upravené myšacie modely (31) preukázali, že systémová lyzozomálna inhibícia vyvolala účinky na makrofágy spojené s nádorom a supresorové bunky odvodené od myeloidných buniek, ktoré boli dostatočné na zvýšenie účinnosť imunoterapie. Môže sa stať, že bunková vnútorná imunogenicita tiež hrá úlohu v týchto imunitných studených nádoroch, ktoré sa stanú citlivejšími na ICD po lyzozomálnej inhibícii. Účinok lyzozomálnej inhibície podobný vakcíne pozorovaný v kontrolovanom laboratórnom prostredí sa môže, ale nemusí premietnuť do kliniky, ale mohol by vysvetliť, prečo niektorí pacienti liečení dabrafenibom, trametinibom a HCQ u predtým liečeného mutantného melanómu BRAF mali taký hlboký a trvalý reagovať na tento režim (32). Je potrebná ďalšia štúdia, aby sme pochopili, ako inhibícia PPT1 produkuje lyzozomálne ROS a peroxidáciu lipidov. PPT1-závislá regulácia V-ATPázy a acidifikácia lyzozómov nie je dostatočným vysvetlením, pretože bafilomycín inhibuje acidifikáciu lyzozómov, ale neprodukuje LMP (údaje nie sú uvedené). Dôsledky týchto zistení naznačujú, že lyzozomálne inhibítory, ktoré zvyšujú vnútornú imunogenicitu nádorových buniek, môžu byť racionálne kombinované s terapiami, ktoré zvyšujú aktiváciu T-buniek alebo infiltráciu do mikroprostredia nádoru, čo potenciálne prináša synergické účinky.

Obrázok 5. N-acetylcysteín zabraňuje bunkovej smrti indukovanej DC661-. (A)

Metódy

Bunková kultúra. Human A375P (CRL-3224), RKO (CRL-2577), DLD-1 (CCL- 221), MIA PaCa-2 (CRL-1420 ), A549 (CRM-CCL-185) a myšacie B16F10 (CRL-6475) bunkové línie boli zakúpené od ATCC. Ľudské línie A375 (CRL-1619, ATCC), WM35, WM793 a myšie YUMM1.7 (WT, Gsdme EV a Gsdme KO1 a KO2) sa získali interne. Myšie bunky MC38 a CT26 poskytol Andy Minn, University of Pennsylvania. Primárne bunky kostnej drene FL5.12 a IL-3-dependentné Bax−/−Bak−/− (Bax/Bak DKO) boli získané od Kathryn E. Wellen, University of Pennsylvania. Ľudskú bunkovú líniu Panc-1 (CRL-1469, ATCC) poskytol Ben Z. Stanger, University of Pennsylvania. Myšia bunková línia YUMMER 1.7 bola získaná od Xiaowei (George) Xu, University of Pennsylvania. Všetky bunkové línie boli dvakrát ročne testované na Mycoplasma zariadeniami University of Pennsylvania Core a overené pomocou krátkeho tandemového opakovania odtlačkov prstov jadrom Wistar Institute Genomics. Bunkové línie A375P, RKO, DLD-1, A549, CT26, FL5.12 a Bax/Bak DKO sa kultivovali v RPMI 1640 (Invitrogen, 11875); Bunkové línie A375, MIA PaCa-2, Panc{42}}, B16F10 a MC38 sa kultivovali v DMEM (Invitrogen, 11995); a YUMMER1.7, YUMM1.7 WT, Gsdme EV a Gsdme KO1 a KO2) bunky (15) boli kultivované v DMEM/F12 50/50 (Corning, 10-092-CV). Kultivačné médiá boli doplnené 10% fetálnym bovinným sérom (12306C, MilliporeSigma) a 1x antibiotickým antimykotickým roztokom (Gibco, 15140-122). Bunkové línie FL5.12 a Bax/Bak DKO sa udržiavali v kompletnom médiu RPMI doplnenom 50 uM merkaptoetanolu (Life Technologies, 21985-023), 10 mM HEPES (H3537, MilliporeSigma) a 0,35 ng/ml a 3,5 ng /ml IL-3. Bunkové línie YUMMER1.7 a YUMM1.7 (WT, Gsdme EV a Gsdme KO) sa udržiavali v kompletnom médiu doplnenom 1 x MEM NEAA (Gibco, 11140-050). Bunky WM35 a WM793 sa kultivovali v médiu MCDB 153 (MilliporeSigma, M7403), obsahujúcom 10 % FBS v 1× Leibovitz L-15 médiu (Corning, 10-045-CV), 7,5 % hmotn./obj. hydrogenuhličitanu sodného ( Corning, 25-035-CI), 1× antibiotický antimykotický roztok (Gibco, 15140-122) a 5 ug/ml inzulínu (MilliporeSigma, I0516). Bunky rástli pri 37 stupňoch v prítomnosti 5 % C02. Chemikálie a činidlá. Zakúpené chemikálie zahŕňali HCQ Sulfate (Spectrum Chemicals, 747-36-4) a DC661 (Selleckchem, S8808). Fluo{100}}, AM (Thermo Fisher Scientific, F14201) sa použil na farbenie buniek na vápnik podľa pokynov výrobcu. Zoznam protilátok a inhibítorov je uvedený v doplnkovej tabuľke 1 a doplnkovej tabuľke 2.

Obrázok 6. NAC obracia LLP spôsobom závislým od MFSD12-. (A – C)

Extrakcia a digescia proteínov pre analýzu kvapalinovou chromatografiou a tandemovou hmotnostnou spektrometriou pre proteomiku. {{0}}.7 × 106 buniek melanómu A375P sa kultivovalo v 60 mm kultivačných miskách. Bunky boli ošetrené DMSO (kontrola), DC661 (3 μM), HCQ (10 μM) alebo HCQ (3{{70}}} μM) počas 24 hodín pri približne 5{{ 112} % sútok. Zmrazené bunkové pelety sa lyžovali s 50 mM Tris pH 7,4, 1 % SDS, 150 mM NaCI, 1 mM EDTA, 0,15 mM PMSF, 1 ug/ml pepstatínu, a 1 ug/ml leupeptín. Vyčírené lyzáty (1 0 } ug každý) boli podrobené elektroforéze 0,5 cm do bis-tris gélu, nasledovala fixácia a farbenie koloidným Coomassie. Každý 0,5 cm pruh gélu bol vyrezaný, odfarbený, redukovaný tris (2-karboxyetyl)fosfínom, alkylovaný jódacetamidom a štiepený trypsínom, ako už bolo opísané (36). Digesty (1 ug) boli analyzované kvapalinovou chromatografiou – tandemovou hmotnostnou spektrometriou (LC-MS/MS) na hmotnostnom spektrometri Q-Exactive Plus (Thermo Fisher Scientific) v súlade s nanoAQUITY UPLC (Waters). Analytická separácia sa uskutočnila na 1,7 μm x 250 mm kolóne Peptide BEH C18 (Waters, 186003546) s použitím 245-minútového gradientu s 0,1 % kyselinou mravčou vo vode (mobilná fáza A) a acetonitrile (mobilná fáza B) nasledovne : 5 % – 30 % B počas 225 minút, 30 % – 80 % B počas 5 minút, 15-minútové podržanie na 80 % B a návrat do pôvodných podmienok. Úplné MS spektrá sa získali pri rozlíšení 70,{49}}, s rozsahom skenovania 400–2,000 m/z, automatickým cieľom riadenia zisku 3 × 106 iónov a maximálnou dobou vstrekovania 50 milisekúnd. Na dátach závislé MS2 spektrá boli získané pre 20 najhojnejších iónov s rozlíšením 17 500, so šírkou izolácie 1, 5 m / z, automatickým cieľom riadenia zisku 5 × 104 iónov a maximálnou dobou vstrekovania 50 milisekúnd. Peptid match bol nastavený na preferovaný a nepriradené a jednotlivo nabité ióny boli odmietnuté (37). Nespracované MS údaje boli analyzované pomocou MaxQuant 1.6.5.0 (https://maxquant.net/perseus/) s databázou ľudských sekvencií Uniprot (prístupná 10. októbra 2019) a spoločnou databázou kontaminantov, vrátane trypsínu, keratínov, hovädzích proteínov, a mykoplazmy (38). Pri hľadaní sa použila špecificita tryptického peptidu s maximálne 2 vynechanými štiepeniami, fixná modifikácia na cysteíne (karbamidometylácia) a variabilná oxidácia metionínu alebo N-terminálna acetylácia (39). Pre peptidy a proteíny sa použila hranica 1 % FDR. Zhoda medzi behmi bola povolená; proteíny boli kvantifikované pomocou kvantifikácie bez označenia (40). Štatistická analýza sa uskutočnila pomocou Perseus 1.6.2.3 (https://maxquant.net/perseus/) (41, 42). Proteíny museli byť identifikované aspoň 3 jedinečnými peptidmi a mali 3 platné hodnoty (nenulová kvantifikácia) v rámci skupiny vzoriek a kontaminanty a reverzné proteíny boli odfiltrované zo súboru údajov. Chýbajúce hodnoty boli pripočítané z normálneho rozdelenia. Párové porovnania medzi podmienkami sa uskutočňovali na úrovni proteínu s použitím 2-sledovaného Studentovho t-testu s FDR na základe permutácií s s{92}}}.1 a 250 randomizáciami. Významné zmeny boli definované ako FDR menšie ako 5 % a absolútny násobok zmeny väčší ako 1,5 alebo 2,0, ako je špecifikované. Lyso-IP. Bunky A375P boli infikované lentivírusom pLJC5-Tmem192-3xHA a selektované pomocou 1 mg/ml puromycínu (MilliporeSigma, P4512). Približne 3 x 106 buniek A375P označených HA sa ošetrilo buď 10 mM NAC alebo kontrolou s vodným vehikulom počas 24 hodín v kultivačných podmienkach opísaných vyššie. Po ošetrení boli bunky premyté v PBS, zozbierané v 0,5 ml studeného KPBS a jemne homogenizované použitím 20 úderov v 2 ml Dounceho homogenizátore. Asi 2,5 % homogenátu sa rezervovalo na analýzu lyzátu celých buniek a zvyšok sa 2 minúty centrifugoval pri 3,{120}} g pri 4 stupňoch, aby sa odstránili zvyšky bunkovej membrány. Homogenátový supernatant sa potom preniesol do čistej 1,5 ml skúmavky a inkuboval sa s 50 ul anti-HA guľôčkami (Pierce, 88836) alebo anti-DDK/Flag guľôčkami (OriGene, TA150042) počas 15 minút pri 4 stupňoch. Vzorky sa potom vyzrážali umiestnením skúmaviek na DynaMag (Thermo Fisher Scientific, 12321D) a jemne sa kývali 2 minúty pri teplote miestnosti. Supernatant bol rezervovaný na analýzu nenaviazaných frakcií. IP sa premyla 3-krát KPBS s obsahom 8 mM CaCl2. Lyso-IP sa extrahoval v 80 % MeOH na metabolomickú analýzu. Extrakcia a analýza lipidov pomocou LC-MS/MS pre globálny lipidóm. Bunky melanómu A375P sa vysiali do 60 mm misiek v množstve 0, 7 x 106 buniek na misku. Keď boli bunky na približne 50% konfluencii, boli ošetrené DMSO (kontrola), DC661 (3 uM) alebo HCQ (30 uM) počas 24 hodín. Bunky sa premyli 2-krát HBSS, zoškrabali sa do ľadovo chladného metanolu a preniesli sa do sklenených skúmaviek na extrakciu lipidov zmesou chloroform/metanol/0,88 % NaCl (2:1:1) obsahujúcou vnútorný lipidový štandard EquiSPLASH (Avanti Polar Lipids). Vzorky sa vortexovali a potom sa vodný kúpeľ sonikoval počas 5 minút na ľade. Po centrifugácii pri 500 g počas 15 minút pri 40 stupňoch sa spodná fáza preniesla do ďalšej sklenenej skúmavky. Horná fáza bola reextrahovaná použitím syntetickej spodnej fázy. Po sonikácii a odstredení sa spodná fáza spojila s prvou spodnou fázou odberu. Vzorky boli vysušené pod dusíkom, resuspendované v 10% chloroforme/90% metanole a prenesené do sklenených LTQ fľaštičiek. Vzorky lipidov sa analyzovali na hmotnostnom spektrometri Thermo Fisher Scientific QExactive HF-X a systéme Vanquish Horizon UHPLC. Na analytickú separáciu sa použila kolóna Accucore C30 (2,1 mm x 150 mm, Thermo Fisher Scientific) s 50:50 acetonitril/voda a 88:10:2 izopropanol/acetonitril/voda, pričom každá obsahovala 5 mM mravčanu amónneho a 0,1 % kyseliny mravčej. Dáta LC-MS/MS sa získali oddelene v kladnej a zápornej polarite s nasledujúcimi parametrami prístroja: MS1 sken 120, rozlíšenie 000; dátovo závislý MS2 na 20 najrozšírenejších iónoch s rozlíšením 15,{184}}; šírka izolácie 0,4 m/z; a stupňovitá normalizovaná kolízna energia 20:30:40 (43).

Obrázok 7. N-acetylcysteín bráni DC661-indukovanej povrchovej expresii kalretikulínu. (A–D)

Lipidy boli identifikované a kvantifikované pomocou LipidSearch 4.2 (Thermo Fisher Scientific). Identifikované druhy lipidov boli filtrované podľa očakávaných aduktov a stupňa identifikácie na základe triedy. Plochy píkov sa normalizovali podľa štandardov EquiSPLASH pre podporované triedy a ďalej sa normalizovali na základe celkovej plochy pre každú vzorku, aby sa korigovali odchýlky v počte buniek. Štatistická analýza bola vykonaná na log-transformovaných dátach pomocou Perseus 1.6.2.3 (https://maxquant.net/perseus/) (41, 42). Extrakcia a analýza metabolitov pomocou LC-MS/MS pre metabalón. Polárne metabolity sa extrahovali z celých buniek, Lyso-IP neviazaných frakcií a Lyso-IP viazaných vzoriek s použitím 80% metanolu a pred kvapalinovou chromatografiou sa skladovali pri -8{{30}} stupňoch – analýza hmotnostnej spektrometrie (LC-MS). Extrakty boli analyzované pomocou LC-MS s použitím Thermo Scientific Q-Exactive HF-X hmotnostného spektrometra so sondou HESI II v súlade so systémom Thermo Vanquish Horizon UHPLC. LC separácia sa uskutočnila pomocou kolóny ZIC-HILIC (2,1 mm x 150 mm, veľkosť častíc 5 μm, EMD Millipore) s ochrannou kolónou ZIC-HILIC (2,1 mm x 20 mm, EMD Millipore) udržiavanou pri 45 stupňoch s prietokovou rýchlosťou 0,2 ml/min. Chromatografia sa uskutočňovala za kyslých podmienok, aby sa znížila reaktivita tiolových skupín. Mobilná fáza A bola voda a B bol acetonitril, pričom obe obsahovali 0,1 % kyseliny mravčej. LC gradient bol 85 % B počas 2 minút, 85 % B až 20 % B počas 15 minút, 20 % B až 85 % B počas 0,1 minúty a 85 % B počas 8,9 minúty. Autosampler sa udržiaval pri 4 stupňoch a na analýzu sa vstrekli 4 ul každej vzorky. Boli použité nasledujúce MS parametre: prietoková rýchlosť plášťového plynu, 40 AU; prietok pomocného plynu, 10 AU; prietok čistiaceho plynu, 2 AU; teplota pomocného plynového ohrievača, 350 stupňov; rozprašovacie napätie, 3,75 kV pre kladný režim a 3,5 kV pre záporný režim; kapilárna teplota, 375 stupňov; a hladina RF lievika, 40 %. Všetky vzorky boli analyzované plnou MS s prepínaním polarity. Úplné MS skeny boli získané od 65 do 975 m/z pri 120, 000 rozlíšení s automatickým cieľom riadenia zisku 1 x 106 iónov a maximálnou dobou vstrekovania 100 milisekúnd. Nespracované údaje sa analyzovali pomocou TraceFinder 4.1 (Thermo Fisher Scientific). Cielené metabolity boli identifikované presnou hmotnosťou a retenčným časom v ich preferovanej polarite na základe analytických štandardov. Detekcia píku používala algoritmus ICIS s vyhladením 1. Relatívna kvantifikácia sa uskutočnila pomocou integrovanej plochy píku a tieto hodnoty sa korigovali na celkové množstvo na vzorku (definované ako celková plocha píku). Úprava PPT1-CRISPR/Cas9. A375P PPT1-necieľové a KO bunky boli pripravené tak, ako už bolo opísané (44). pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) bol dar od Feng Zhang (plazmid Addgene, 48139). Oligo vodiacej RNA (IDT) sa hybridizovali, fosforylovali a potom ligovali do plazmidu pX459 štiepeného a defosforylovaného BbsI podľa laboratórnych protokolov Zhang, dostupných prostredníctvom Addgene. Ligované plazmidy sa transformovali do buniek Stbl3 (Invitrogen). Sekvenovanie plazmidových preparátov potvrdilo prítomnosť požadovaných sekvencií vodiacej RNA. Bunky A375P boli transfekované použitím Lipofectamine 3000 (Invitrogen, L3000015), po čom nasledovala puromycínová selekcia. Testy prieskumníkov potvrdili úpravu génu PPT1 pomocou CRISPR/Cas9 a knockdown PPT1 potvrdil Western blot s protilátkou PPT1 (Origene). Sekvencie pre vodiace RNA oligo sú nasledovné: necieľová vodiaca RNA vpred (CACCGTAGCGAACGTGTCCGGCGT), necieľová vodiaca RNA reverzná (AAACACGCCGGACACGTTCGCTAC), ľudská PPT1 vodiaca RNA 1 vpred (CACCGTTTGGACTCCTCGATGCCC), humánna PPT1 vodiaca RNACCATCRNAG3 ľudská PPTAACRNAGG1 spätná PPTGACRNAGG1 dopredu (CAACCGCCTCGTGCAAGCCGAATAC) a ľudskú PPT1 vodiacu RNA 3 reverzne (AAACGTATTCGGCTTGCACGAGGC). Klony pestované z jednotlivých buniek použité v tomto dokumente zahŕňajú nasledujúce: klon C8 je ľudský sprievodca 1 a klon B5 je ľudský sprievodca 3. Imunoblotting. Jeden milión buniek bol nanesený na 10 cm misku a ošetrenia boli podané nasledujúci deň; bunky sa zbierali zoškrabaním. Celobunkové lyzáty boli pripravené s použitím SDS lyzačného pufra. Koncentrácia proteínu sa merala pomocou súpravy Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, 23225). 30–50 ug proteínu sa použilo na SDS-PAGE a prenieslo sa na membránu PVDF (Bio-Rad, 1620177). Membrána bola blokovaná použitím 5 % BSA alebo 5 % odstredeného mlieka podľa optimalizovaných podmienok a inkubovaná s primárnou protilátkou cez noc pri 4 stupňoch. PVDF membrány sa premyli 1 x TBS-T (Cell Signaling Technology Inc., CS{111}}) a inkubovali sa 1 hodinu pri teplote miestnosti s druhovo špecifickou sekundárnou protilátkou konjugovanou s HRP. Membrány sa následne premyli a vyvolali použitím substrátu Pierce ECL Western blotting (Thermo Fisher Scientific, 32106) a autorádiografických filmov (Lab Scientific Inc., XAR ALF 1318). Pre štúdie pyroptózy boli proteínové lyzáty separované pomocou SDS-PAGE a prenesené na PVDF membrány. Po blokovaní v 5% BSA boli PVDF membrány inkubované s uvedenými primárnymi protilátkami cez noc pri 4 stupňoch, premyté v PBS/Tween a inkubované so sekundárnymi protilátkami spojenými s peroxidázou. Imunoreaktivita bola detegovaná pomocou HRP-konjugovaných sekundárnych protilátok (CalBioTech), chemiluminiscenčného substrátu (Thermo Fisher Scientific) a zobrazovacieho systému ChemicDoc MP (Bio-Rad). Pre experimenty zahŕňajúce supernatant sa bunky kultivovali v médiu bez FBS, aby sa zabránilo skresleniu SDS-PAGE. Bunkové supernatanty sa zozbierali a centrifugovali 10 minút pri 500 g pri 4 stupňoch, aby sa odstránili bunkové zvyšky. Výsledné supernatanty sa skoncentrovali 10x použitím Amicon Ultra 10K (MilliporeSigma) centrifugáciou počas 30 minút pri 4500 g pri 4 stupňoch. Koncentráty sa zmiešali so vzorkovým pufrom a analyzovali sa pomocou Western blotu, ako je opísané vyššie. Farbenie proteínového gélu sa uskutočnilo pomocou farbenia Ponceauovou červenou. Test aktivity LMP a katepsínu L. Ľudský plazmid pEGFP-hGal3 bol dar od Tamotsu Yoshimori (plazmid Addgene, 73080) a použil sa na vytvorenie línie A375P-galektín{139}}. Bol zakúpený hlavný reťazec kontrolného plazmidového vektora pEGFP-C1 (novo prolabs, V012024). Plazmidy sa transfekovali (1 ug/ml) do buniek A375P použitím Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668019) podľa protokolu výrobcu; transfekované bunky boli stabilne selektované pomocou G418 (Gibco, 10131035). V prípade LMP sa spočítalo celkovo 25 bodovo pozitívnych buniek A375P-galektín{152}} vo viacerých poliach obrázkov. Percento punktapozitívnych buniek sa vypočítalo v každom poli samostatne a pre každú skupinu sa vypočítalo priemerné percento. Testovacia súprava Magic Red Cathepsin L (Abcam, ab270774) bola použitá podľa protokolu výrobcu. Bunky sa zobrazili pod inverzným mikroskopom Zeiss Axio Observer 7. Surová integrovaná intenzita Magic Red sa vypočítala pomocou softvéru Fiji - ImageJ (NIH). Test životaschopnosti buniek MTT (3-[4,{159}}dimetyltiazol-2-yl]-2, 5-difenyltetrazoliumbromid). 2000 buniek bolo nanesených v troch replikátoch do každej jamky 96-jamkovej doštičky a boli uskutočnené 3-denné MTT testy s použitím súpravy Cell viability Kit (Roche, 11465007001) podľa protokolu výrobcu. Predbežné ošetrenie inhibítorom sa podávalo počas 1 hodiny, potom nasledovalo spoločné ošetrenie buniek inhibítormi s alebo bez DC661. Na výpočet IC50 sa použila metóda nelineárnej regresie (preloženie krivky).

cistanche tubulosa - zlepšenie imunitného systému

Kliknite sem pre zobrazenie produktov Cistanche Enhance Immunity

【Požiadať o viac】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Test tvorby kolónií. 2,000 buniek na jamku sa naočkovalo do 6-jamkovej platne a ošetrilo sa nasledujúci deň; bunky boli udržiavané pod ošetrením celkovo 8 dní. Kolónie vytvorené v každej jamke boli premyté PBS, fixované studeným metanolom pri -20 stupňoch počas 20 minút a zafarbené 0,5% vodným roztokom Crystal violet (V5265; MilliporeSigma).

Test vylúčenia farbiva trypánovou modrou. Reakčná zmes pre test s trypánovou modrou bola pripravená zmiešaním 1 dielu 0,4 % trypánovej modrej (25- 900-CI, Corning) a 1 dielu zriedených vzoriek buniek. Zmes sa inkubovala 1 minútu a bunky sa spočítali na Cellometer Vision (Nexcelom, Vision{6}}).

Obrázok 8. DC661-indukovaná povrchová expresia kalretikulínu aktivuje T bunky proti nádorovým bunkám. (A)

Obrázok 9. Inokulácia buniek ošetrených DC661- spôsobuje odmietnutie nádoru v špecifických súvislostiach. (A)

FOAM-LPO. LLP bol študovaný pomocou fluorescenčnej sondy FOAMLPO. FOAM-LPO bol syntetizovaný, ako už bolo opísané (26). Bunky sa kultivovali na 8jamkovom μSlide (ibid, 80807) a ošetrili sa inhibítormi as DC661 alebo bez neho. Bunky sa inkubovali s médiom obsahujúcim FOAM-LPO (1 M) v atmosfére 5 % C02 a 95 % vzduchu počas 5 minút pri 37 stupňoch. Bunky sa dvakrát premyli médiom a potom sa bunky pozorovali pod mikroskopom (invertovaný mikroskop Zeiss Axio Observer 7), aby sa zistil posun fluorescencie z 586 na 512 nm v reakcii na LLP. qRT-PCR a primery. Bunky A375P (3 x 105) sa kultivovali v 60 mm miskách a ošetrili sa DMSO alebo DC661 (3 uM) počas 24 hodín. Celková RNA bola izolovaná pomocou súpravy na izoláciu RNA (QIAGEN, 74134) podľa protokolu výrobcu. cDNA sa syntetizovala s použitím súpravy iScript reverznej transkriptázy s 500 ng purifikovanej RNA podľa protokolu výrobcu (Thermo Scientific, K1642). Reakcia qPCR bola nastavená pomocou SYBR Green PCR Master Mix (BioRad, 1725121) obsahujúcej 1 ul cDNA. Všetky merania sa uskutočňovali trojmo a ako vnútorný štandard na výpočty ACT sa použil BACTIN. Analýza génovej expresie sa uskutočnila s použitím nasledujúcich primérov: PTGS2/COX-2 vpred (CGGTGAAACTCTGGCTAGACAG), PTGS2/COX-2 vzad (GCAAACCGTAGATGCTCAGGGA), CARS vpred (CTGGACTACTCCAGCAACACCA), CARSG vpred (GACCAGAGACGAT1) (GTGGTGACGCTCCTTGAAGATC), CHAC1 vzad (GAAGGTGACCTCCTTGGTATCG), BACTIN vpred (CAACTGGGACGACATGGAGAAAAT) a BACTIN vzad (CCAGAGGCGTACAGGGATAGCAC).

transfekcia siRNA. Genetické knockdown štúdie pre ľudské ULK1, ATG7, TAX1BP1, BNIP3, PPT1 a MFSD12 sa uskutočnili v bunkových líniách A375P. Štúdie genetickej inhibície pre myšací Ppt1 a kalretikulín sa uskutočnili v bunkách MC38. Necieľová siRNA (sc{{1{152}}}}), ľudská ULK1 (sc-44182), ATG7 (sc-41447), TAX1BP1/T6BP (sc-106831), BNIP3 (sc{{2{168}}}}), PPT1/CLN1 (sc-105216), MFSD12 (sc-97888), myš Ppt1/Cln1 (sc-142398) a kalretikulín /Calregulin (sc{29}}) siRNA boli zakúpené od Santa Cruz Biotechnology. Tieto siRNA pozostávajú zo skupín 3–5 cieľovo špecifických siRNA. Prietoková cytometria. Indukcia ferroptózy sa merala pomocou C11- BODIPY (BODIPY 581/591 C11, Thermo Fisher Scientific, D3861). Bunky A375P boli nasadené na 6-jamkovú doštičku a ošetrené DMSO, ferostatínom{{40}} (10 μM), roxstatínom na pery-1 (2 μM), elastínom (5 μM ), DC661 (3 μM), alebo ich kombináciu počas 24 hodín. Bunky sa zozbierali centrifugáciou pri 300 g počas 5 minút. Bunky boli resuspendované v 500 ul 1X HBSS (Corning, 21-023-CV) obsahujúcom 1 μM C11-BODIPY a inkubované pri 37 stupňoch počas 15 minút. Bunky sa peletovali a resuspendovali v 500 ul 1X HBSS a intenzita fluorescencie sa merala na cytometri BD LSRII s použitím 530/30 Blue (University of Pennsylvania Flow Core Facility). Kvantifikácia bunkovej povrchovej expresie kalretikulínu na imunogénnu bunkovú smrť sa uskutočnila, ako už bolo opísané (45), prietokovou cytometriou. Bunky B16F10 alebo MC38 boli kultivované a ošetrené NAC (10 mM) alebo DC661 (3 uM) počas 24 hodín. Bunky MC38 boli ošetrené siPpt1 alebo siNT počas 48 hodín v prítomnosti alebo neprítomnosti 10 mM NAC počas 24 hodín. Bunky boli zafarbené protilátkou CALR (Cell Signaling Technology, 12238), kozou anti-králičou druhou protilátkou Alexa Fluor 647 (Invitrogen) a propídium jodidom (PI) (Biolegend, 421301). Zafarbené vzorky sa získali na prietokovom cytometri BD LSRII s použitím 710/50 Blue a 670/30 Red na zachytenie fluorescencie PI a CALR (zariadenie University of Pennsylvania Flow Core) a analýza sa obmedzila na CALR-pozitívne a PI-negatívne bunky. aby sa predišlo falošne pozitívnym udalostiam. Priming T buniek a percento cytotoxicity. Nádorové bunky B16 alebo MC38 (5 x 104) sa kultivovali a ošetrili sa s NAC (10 mM) alebo DC661 (1 uM alebo 3 uM) počas 24 hodín. Na genetickú inhibíciu Calr boli bunky MC38 ošetrené siRNA Calr alebo necieľovou siRNA (siNT) počas 48 hodín, po čom nasledovalo ošetrenie buď DMSO alebo 3 uM DC661 počas 24 hodín. Splenocyty sa potom kultivovali s DC661 s bunkami B16 alebo MC38 alebo bez nich v prítomnosti IL{102}} (5 IU/ml) a kokultivovali sa 72 hodín. Aktivácia bola potvrdená pomocou IFN-ELISA (Biolegend, 430815) supernatantu. Primované splenocyty sa potom spoločne kultivovali s čerstvo kultivovanými bunkami B16 alebo MC38 s pomermi cieľ-efektor (B16 alebo MC38 k splenocytom) 1:20 a 1:50 pre bunky B16 a MC38, v danom poradí. Uvoľňovanie LDH spojené so smrťou buniek B16 alebo MC38 a potom percento cytotoxicity sa merali podľa protokolu výrobcu (MilliporeSigma, 4744926001) (31). Protinádorové vakcinačné testy a štúdie chemoterapie so zavedenými modelmi rakoviny. Šesť až osemtýždňové samice myší WT C57BL/6, myši NOD/SCID a BALB/c boli získané z The Jackson Laboratory. Pre protinádorové vakcinačné experimenty boli bunky WT B16F10, MC38 a CT26 ošetrené DC661 (3 uM) počas 36 hodín v 175 cm2 bankách. Potom sa supernatanty a oddelené bunky zhromaždili v 50 ml skúmavke Falcon. Bunky sa odstredili a premyli ľadovo studeným PBS. Na vakcináciu sa 150 ul bunkovej suspenzie vstreklo sc do ľavého boku imunokompetentných myší C57BL/6, imunodeficientných NOD/SCID myší (1,8 x 104 buniek B16F10, 1,5 x 106 buniek MC38 na myš) alebo syngénnych myší BALB/c (3. × 106 buniek CT26 na myš). Zmrazené a rozmrazené bunky resuspendované v PBS boli injikované ako negatívna kontrola. O týždeň neskôr boli do pravého boku injikované živé rakovinové bunky rovnakého typu (3 × 104 buniek B16F10, 2 × 105 buniek MC38 alebo 5 × 105 buniek CT26 na myš) s rovnakým objemom Matrigelu (Corning, 354248). očkovaných myší. Nádory sa merali pomocou elektronického posuvného meradla a objem sa vypočítal ako L × W2 × 0,5. Nádorový rast sa pravidelne monitoroval počas nasledujúcich dní a neprítomnosť nádorov sa považovala za indikáciu účinnej protinádorovej vakcinácie. Štúdie očkovania DC661-MC38 sa opakovali na myšiach NOD/SCID. Štatistiky. Štatistická významnosť sa určila pomocou Studentovho nepárového 2-tailed t-testu pri porovnaní 2 skupín. Keď sa porovnávali viac ako 2 skupiny, použil sa 1-test ANOVA. Nulová hypotéza bola významne zamietnutá, ak hodnota P bola menšia ako 0,05. Údaje sú uvedené ako priemer ± SEM. Schválenie štúdie. Všetky pokusy na zvieratách sa uskutočňovali v súlade s protokolmi schválenými Inštitucionálnym výborom pre starostlivosť o zvieratá a ich používanie na University of Pennsylvania.

Čínska bylina cistanche rastlina-Protinádorová

Referencie

1. Zeh HJ, a kol. Randomizovaná predoperačná štúdia fázy II inhibície autofágie s vysokou dávkou hydroxychlorochínu a gemcitabínu / Nab-paklitaxelu u pacientov s rakovinou pankreasu. Clin Cancer Res. 2020;26(13):3126–3134.

2. Rebecca VW a kol. PPT1 podporuje rast nádorov a je molekulárnym cieľom derivátov chlorochínu pri rakovine. Cancer Discov. 2019;9(2):220–229.

3. Brun S, a kol. GNS561, nový inhibítor autofágie aktívny proti rakovinovým kmeňovým bunkám pri hepatocelulárnom karcinóme a pečeňových metastázach z kolorektálneho karcinómu. J Cancer. 2021;12(18):5432–5438.

4. Brun S, a kol. GNS561, inhibítor PPT1 v klinickom štádiu, je účinný proti hepatocelulárnemu karcinómu prostredníctvom modulácie lyzozomálnych funkcií. Autofágia. 2022;18(3):678–694.

5. Oberle C, a kol. Permeabilizácia lyzozomálnej membrány a uvoľňovanie katepsínu je amplifikačný prípad apoptózy vo fibroblastoch a monocytoch závislý od Bax/Baka. Cell Death Differ. 2010;17(7):1167–1178.

6. Boya P, Kroemer G. Permeabilizácia lyzozomálnej membrány pri bunkovej smrti. Onkogén. 2008;27(50):6434–6451.

7. Rebecca VW a kol. Jednotný prístup k zacieleniu degradačných a rastových signalizačných úloh lyzozómu. Cancer Discov. 2017;7(11):1266–1283.

8. Tang R a kol. Ferroptóza, nekroptóza a pyroptóza v protirakovinovej imunite. J Hematol Oncol. 2020; 13 (1): 110.

9. Yamamoto K, a kol. Autofágia podporuje imunitný únik rakoviny pankreasu degradáciou MHCI. Príroda. 2020;581(7806):100–105.

10. Deng J, a kol. Inhibícia ULK1 prekonáva narušenú prezentáciu antigénu a obnovuje protinádorovú imunitu pri mutantnej rakovine pľúc LKB1. Nat Cancer. 2021;2(5):503–514.

11. Lazarou M, a kol. Ubikvitínkináza PINK1 rekrutuje autofágové receptory na vyvolanie mitofágie. Príroda. 2015;524(7565):309–314.

12. Choi YB a kol. TAX1BP1 obmedzuje vírusom indukovanú apoptózu uľahčením degradácie mitochondriálneho adaptéra MAVS sprostredkovanej svrbením. Mol Cell Biol. 2017;37(1):e00422-16.

13. Rikka S, a kol. Bnip3 zhoršuje mitochondriálnu bioenergetiku a stimuluje mitochondriálny obrat. Cell Death Differ. 2011;18(4):721–731.

14. Leu JI, a kol. Mechanický základ narušenej ferroptózy v bunkách exprimujúcich afrocentrický variant S47 p53. Proc Natl Acad Sci USA 2019;116(17):8390–8396.

15. Erkes DA, a kol. Mutantné inhibítory BRAF a MEK regulujú imunitné mikroprostredie nádoru prostredníctvom pyroptózy. Cancer Discov. 2020;10(2):254–269.

16. Serrano-Puebla A, Boya P. Permeabilizácia lyzozomálnej membrány pri bunkovej smrti: nové dôkazy a dôsledky pre zdravie a choroby. Ann NY Acad Sci. 2016;1371(1):30–44.

17. Thirusangu P, a kol. Autofágia vyvolaná chinakrínom pri rakovine vaječníkov spúšťa permeabilizáciu lyzozomálnej / mitochondriálnej membrány a bunkovú smrť sprostredkovanú katepsínom-L. Rakoviny (Bazilej). 2021;13(9):2004.

18. Michallet MC, a kol. Apoptóza závislá od katepsínu spustená supraoptimálnou aktiváciou T lymfocytov: možný mechanizmus tolerancie vysokej dávky. J Immunol. 2004;172(9):5405–5414.

19. Mondal A, a kol. Deficit Ppt1-narušuje reguláciu lyzozomálnej Ca++ homeostázy, čo prispieva k patogenéze v myšom modeli ochorenia CLN1. J Zdediť Metab Dis. 2022;45(3):635–656. 20. Engel KM a kol. Lipidové biomarkery odvodené od fosfolipáz a reaktívnych foriem kyslíka u zdravých a chorých ľudí a zvierat – zameranie na lyzofosfatidylcholín. Predný Physiol. 2021;12:732319.

21. Fu R, a kol. Účinnosť N-acetylcysteínu pri fenotypovej supresii myších modelov Niemann-Pickovej choroby, typ C1. Hum Mol Genet. 2013;22(17):3508–3523.

22. Boz Z, a kol. N-acetylcysteín zabraňuje olanzapínom vyvolanému oxidačnému stresu v mHypoA-59 hypotalamických neurónoch. Sci Rep. 2020;10(1):19185.

23. Khare S, a kol. ASS1 a ASL potláčajú rast karcinómu obličkových buniek z jasných buniek prostredníctvom zmeneného metabolizmu dusíka. Rakovina Metab. 2021; 9 (1): 40.

24. Gęgotek A, a kol. Porovnanie ochranného účinku kyseliny askorbovej na interakcie redoxných a endokanabinoidných systémov in vitro kultivovaných fibroblastov ľudskej kože vystavených UV žiareniu a peroxidu vodíka. Arch Dermatol Res. 2017;309(4):285–303.

25. De Raedt T, a kol. Využitie zraniteľnosti rakovinových buniek na vývoj kombinovanej terapie pre nádory poháňané rasou. Cancer Cell. 2011;20(3):400–413.

26. Zhang X, a kol. Monitorovanie peroxidácie lipidov v penových bunkách pomocou lyzozómovo cielenej a pomerovej sondy. Anal Chem. 2015;87(16):8292–8300.

27. Wei CY, a kol. Analýza založená na bioinformatike odhaľuje zvýšený MFSD12 ako kľúčový promótor bunkovej proliferácie a potenciálny terapeutický cieľ pri melanóme. Onkogén. 2019;38(11):1876–1891.

28. Aldini G, a kol. N-acetylcysteín ako antioxidant a činidlo narušujúce disulfidy: dôvody prečo. Free Radic Res. 2018;52(7):751–762. 29. Abu-Remaileh M, a kol. Lysozomálna metabolomika odhaľuje reguláciu odtoku aminokyselín z lyzozómov závislú od V-ATPázy a mTOR. Veda. 2017;358(6364):807–813.

30. Zhou J, a kol. Imunogénna bunková smrť v terapii rakoviny: Súčasné a vznikajúce induktory. J Cell Mol Med. 2019;23(8):4854–4865. 31. Sharma G, a kol. Inhibícia PPT1 zvyšuje protinádorovú aktivitu anti-PD-1 protilátky pri melanóme. JCI Insight. 2020;5(17):e133225.

32. Mehnert JM, a kol. BAMM (BRAF autofágia a inhibícia MEK pri melanóme): štúdia fázy I/II dabrafenibu, trametinibu a hydroxychlorochínu pri pokročilom BRAFV600-mutovanom melanóme. Clin Cancer Res. 2022;28(6):1098–1106. 33. Loi M, a kol. Makroautofágové proteíny kontrolujú hladiny MHC triedy I na dendritických bunkách a formujú antivírusové CD8(+) T bunkové reakcie. Cell Rep. 2016;15(5):1076–1087.

34. Jouandin P, a kol. Mobilizácia lyzozomálneho cysteínu formuje odpoveď TORC1 a rast tkaniva na hladovanie. Veda. 2022;375(6582):eabc4203.

35. Schwalfenberg GK. N-acetylcysteín: prehľad klinickej užitočnosti (starý liek s novými trikmi). J Nutr Metab. 2021;2021:9949453.

36. Beer LA, et al. Systematické objavovanie biomarkerov mimomaternicového tehotenstva v sére pomocou profilovania 3-D proteínu spojeného s kvantifikáciou bez označenia. J Proteome Res. 2011;10(3):1126–1138. 37. Goldman AR, a kol. Primárny účinok na proteóm ARID1A-mutovaného ovariálneho karcinómu z jasných buniek je downregulácia mevalonátovej dráhy na post-transkripčnej úrovni. Mol Cell Proteomics. 2016;15(11):3348–3360.

38. Cox J, Mann M. MaxQuant umožňuje vysokú mieru identifikácie peptidov, individuálnu presnosť hmotnosti v rozsahu ppb a kvantifikáciu proteínov v rámci celého proteómu. Nat Biotechnol. 2008;26(12):1367–1372.

39. Cox J, a kol. Andromeda: peptidový vyhľadávací nástroj integrovaný do prostredia MaxQuant. J Proteome Res. 2011;10(4):1794–1805.

40. Cox J, a kol. Presná kvantifikácia bez označenia v celom proteóme pomocou oneskorenej normalizácie a extrakcie maximálneho pomeru peptidov, nazývaná MaxLFQ. Mol Cell Proteomics. 2014;13(9):2513–2526.

41. Tyanova S, a kol. Výpočtová platforma Perseus pre komplexnú analýzu (prote)omických údajov. Metódy Nat. 2016;13(9):731–740.

42. Tyanova S, Cox J. Perseus: bioinformatická platforma pre integratívnu analýzu proteomických údajov vo výskume rakoviny. Metódy Mol Biol. 2018;1711:133–148.

43. Alicea GM, a kol. Zmeny v metabolizme lipidov vo veku fibroblastov indukujú rezistenciu melanómových buniek závislú od veku na cielenú terapiu prostredníctvom transportéra mastných kyselín FATP2. Cancer Discov. 2020;10(9):1282–1295.

44. Ran FA a kol. Genómové inžinierstvo pomocou systému CRISPR-Cas9. Nat Protoc. 2013;8(11):2281–2308.

45. Liu P a kol. Kvantifikácia expozície kalretikulínu spojenej s imunogénnou bunkovou smrťou. Metódy Enzymol. 2020;632:1–13.