Deplécia makrofágov znižuje patológiu ochorenia pri glomerulonefritíde sprostredkovanej imunitným komplexom závislou od faktora H

Doplnkový faktorH (FH) je kľúčovým regulátorom alternatívnej dráhy komplementu u človeka a myši. Skoršie naše štúdie odhalili, že absencia FH spôsobuje, že myš C57BL6 sa stáva citlivou nachronická sérová choroba(CSS) spolu s nárastomobličkovej infiltrácia makrofágovv porovnaní s kontrolami. Aby sme pochopili, či zvýšený nábor makrofágov (Mϕs) do obličky vháňalFlamácie a šíriaceho sa poranenia, skúmali sme eFfect z Mϕ deplécia klodronátom u FH knockout myší s CSS. 8-týždňové myši FHKO boli liečené apoferritínom (4 mg/myš) počas 5 týždňov a buď vehikulom (PBS) alebo klodronátom (50 mg/kg ip, 3-krát/týždeň počas posledných 3 týždňov). Správa oklodronát znížil monocyty a Mϕs v obličkáchpodľa>80%. 

Funkcia obličiekhodnotené pomocou BUN a albumín zostal bližšie k normálu pri deplécii Mϕs. Liečba klodronátom zabránila zmene cytokínov, TNF a IL-6 a zvýšenie génovej expresie rastového faktora spojivového tkaniva (CTGF), TGF -1, matricová metaloproteináza-9 (MMP9),Fi pripojeniebronektín, laminín a kolagén u myší FHKO s CSS (P < 0:05). Liečba klodronátom viedla k relatívnej ochrane predimunitný komplex- (IC-) sprostredkovaná patológia ochorenia počas CSS podľa hodnoteniasigniFi pripojenievýrazne znížená glomerulárna patológia(GN) a extracelulárnu matricu. Naše výsledky naznačujú, že aktivácia komplementu je jedným z mechanizmov, ktoré regulujú krajinu makrofágov, a týmFi pripojeniebrosis. Presný mechanizmus zostáva rozlúštiť. Stručne povedané, naše údaje ukazujú, že Mϕs zohrávajú rozhodujúcu úlohu v ICGN závislých od FH a Mϕ vyčerpanieznižuje progresiu ochorenia.

KLIKNITE SEM A ZÍSKAJTE PRÍRODNÝ BIO EXTRAKT CISTANCHE S 25 % ECHINAKOZIDU A 9 % AKTEOZIDU PRE FUNKCIU OBLIČIEK

1. Úvod

Chronické ochorenie obličiek(CKD) je globálny zdravotný problém; 10 % z nich je sprostredkovaných imunitným komplexom (IC-) a vyskytuje sa pri sérovej chorobe, infekciách a autoimunitných ochoreniach. [1]. Uvádza sa to vo výročnej správe USA Renal Data Systemjedincov s CKD„sú jednoznačne vystavení vysokému riziku úmrtia“ s 10-násobne zvýšeným výskytom počas troch desaťročí, v ktorých postihnutí pacienti stratili 70 % dĺžky života. Podľa NIDDK bolo približne 14 % dospelej populácie diagnostikované ochorenie obličiek, čo z neho robí 9. hlavnú príčinu smrti [2]. Oblička je vysoko citlivá na poškodenie sprostredkované komplementom, najmä pri autoimunitných a zápalových ochoreniach [3, 4].

Systém komplementu sa podieľa na vrodených a adaptívnych imunitných odpovediach a poskytuje prvú líniu obrany proti mikroorganizmom [5, 6]. Pozostáva z troch aktivačných dráh, ktoré sú iniciované jedinečnými spôsobmi a sú tvorené viac ako 30 plazmatickými a bunkami asociovanými proteínmi [7]. Alternatívna dráha je neustále v strehu a je regulovaná proteínmi, ako je komplementový faktor H (FH). FH je cirkulujúci proteín väčšinou syntetizovaný pečeňou [8]. U myší s deficitom FH (fh-/-) liečených apoferritínom sa rozvinie chronická sérová choroba (CSS) vedúca k difúznej proliferatívnej glomerulonefritíde (GN) do 5 týždňov liečby, zatiaľ čo myši z rovnakého vrhu C57BL/6, ktoré majú dostatok faktora H (FH), majú málo glomerulárny zápal [9]. Infiltrácia makrofágmi F4/80+ sa vyskytuje v obličkách a pozoruje sa okolo depozitov IC u myší fh-/-. Aktivácia komplementu generuje anafylatoxíny, C3a a C5a, ktoré sa podieľajú na prenose Mϕs do miesta zápalu. Inhibícia signalizácie C5a/C5aR1 znížila Mϕs v obličkách [10]. V tomto nastavenípoškodenie obličiekje spojená s renálnou infiltráciou, ale s mechanizmami, ktoré sa môžu podieľať na jej vznikupoškodenie obličiekzostávajú neznáme.

Obrázok 1: FH mení makrofágové markerové gény v obličkách myší s FH-dependentným ICGN. Kvantitatívna PCR v reálnom čase pre CD204 a CD206 s použitím mRNA izolovanej z obličiek po 5 týždňoch fyziologického roztoku alebo apoferitínu. Výraz je normalizovaný na GAPDH (n=6/skupina). ∗P < 0:01. Grafy znázorňujú násobok zmeny génov u myší liečených apoferritínom fh-/- (n=6) v porovnaní s myšami fh-/- liečených fyziologickým roztokom (n=6).

Monocyty (Mo) generované hematopoetickými bunkami [11] migrujú cez endotel do tkanív, kde sa diferencujú na Mϕs. Markery ako F4/80, CD11b, CD68 a Fc receptory môžu identifikovať Mϕs. Mϕ sa kriticky podieľajú na poškodení, oprave a fibróze obličiek v rôznych experimentálnych modeloch ochorenia obličiek [12, 13]. Nedávno naše štúdie preukázali, že poškodenie obličiek pri ICGN závislom od FH je spojené s renálnou infiltráciou Mϕs. Predchádzajúce štúdie navyše preukázali, že inhibícia renálnej infiltrácie Mϕ znižuje arteriálny tlak a zabraňuje poškodeniu glomerulov a fibróze na rôznych zvieracích modeloch nefropatie [14, 15]. Podľa našich vedomostí však vplyv deplécie Mϕ počas poškodenia obličiek spojeného s ICGN závislým od FH nebol riešený. Preto táto štúdia skúmala úlohu Mϕs pri poškodení obličiek spojenom s ICGN závislou od FH pomocou lipozómového clodronátu. Klodronát (kyselina klodronová) je bisfosfonát, ktorý sa metabolizuje na nehydrolyzovateľný analóg ATP [16]. Naše experimenty ukazujú, že Mϕs hrajú kľúčovú úlohu pri strate funkcie obličiek v prostredí neregulovanej aktivácie komplementu. Preto zníženie Mϕs alebo inštrukcia Mϕs, aby predpokladali reparačný fenotyp, by mohlo znížiť patológiu ochorenia a môže sa terapeuticky využiť.

2. Materiály a metódy

2.1. Experimentálne zvieratá.

Kmeň myši fh-/- vytvoril a láskavo poskytol Dr. Matthew Pickering a Marina Botto (Imperial College of London) a nepretržite spätne krížili kmeň C57BL/6 v našom laboratóriu už viac ako 10 generácií. Ako kontroly slúžili myši s dostatkom FH z jedného vrhu (n=8/skupina). Genotypizácia sa uskutočnila pomocou prístupov založených na PCR. Myši boli udržiavané pri teplote 20 – 22 °C v 12-hodinovom cykle svetla – 12-hodinového svetelného cyklu v sterilných, vetraných klietkach s potravou a vodou podľa potreby. Chicagská univerzita a Inštitucionálne výbory pre starostlivosť o zvieratá a ich používanie na univerzite v Buffale schválili všetky štúdie.

2.2. Protokol o chronickej sérovej chorobe.

CSS bola indukovaná u 6–8 týždňových myší fH-/- alebo u myší divokého typu denným intraperitoneálnym podávaním 4 mg apoferitínu z konskej sleziny (Calzyme Laboratories) bez adjuvans [10, 17, 18] počas 5 týždňov. Kontrolné skupiny z jedného vrhu dostávali súčasne intraperitoneálne injekcie fyziologického vehikula

2.3. Hodnotenie funkcie obličiek.

Koncentrácie močovinového dusíka v krvi (BUN) boli stanovené pomocou Beckman Autoanalyzer (Beckman Coulter, Fullerton, CA). Koncentrácie albumínu v moči sa merali pomocou súpravy ELISA na myší album (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX) a normalizovali sa na kreatinín v moči meraný kolorimetricky (Stanbio Laboratory, Boerne, TX), ako už bolo opísané [19].

Obrázok 2: Klodronát stále viac redukuje obličkové makrofágy u myší s FH-dependentným ICGN. Uvedené sú profily prietokovej cytometrie F4/80+ monocytov/Mϕs v deň 0, 2., 4. a 7. deň, reprezentatívne. Expresia buniek F4/80+ bola stanovená prietokovou cytometriou. Údaje sa analyzovali pomocou softvéru FlowJo V10. Bunky F4/80+ sú výrazne znížené v každom časovom bode a dosahujú menej ako 10 % do 7. dňa. Každý časový bod n=6.

2.4. Histológia.

Obličky boli zaliate do parafínu a pre malínom fixované a boli vytvorené štvormikrometrové rezy. Rezy boli zafarbené kyselinou periodickou-Schiff a vyšetrené renálnym patológom (AC) zaslepeným spôsobom. Pre každé sklíčko boli proliferatívna glomerulonefritída a glomeruloskleróza hodnotené od 0 do 4, ako je opísané vyššie [20]. Pre imunofluorescenčnú mikroskopiu sa obličkové tkanivo rýchlo zmrazilo v 2-metylbutáne predchladenom v suchom ľade. Štvormikrónové kryostatické rezy boli spracované na imunofluorescenčné (IF) farbenie. Rezy boli fixované v 4% paraformaldehyde a zafarbené s Alexa488-konjugovaným anti-myším C3 (Cappel) a Alexa 555 anti-myším IgG. Semikvantitatívne skóre intenzity a distribúcie farbenia od 0 do 4 bolo poskytnuté zaslepeným spôsobom, ako bolo opísané vyššie [19].

2.5. qRT-PCR.

Obličky sa odobrali a celková RNA sa extrahovala z tkanív pomocou činidla TRIzol podľa pokynov výrobcu (Invitrogen, USA). cDNA sa syntetizovala použitím reverznej transkriptázy SuperScript III (Invitrogen). qRT-PCR sa uskutočnilo s použitím Power SYBR Green PCR Master mix na sekvenčnom detektore ABI 7700 (Applied Biosystems). PCR amplifikácia sa uskutočnila v celkovom objeme 25 ul obsahujúcom 12,5 ul 2x TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems), 6,25 ul vody bez nukleázy, 5 ul cDNA a 1,25 ul vhodných primerov (IDT). Všetky qPCR priméry (tabuľka 1) boli navrhnuté pomocou softvéru Primer3 (Whitehead Institute for Biomedical Research), aby sa zabezpečila špecifickosť a citlivosť. Na kvantifikáciu hladín mRNA sme normalizovali expresiu cieľových génov na glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázu. Relatívne hladiny expresie mRNA sa vypočítali pomocou metódy 2 - ΔACt a normalizovali sa na hladiny expresie GAPDH.

2.6. Štatistiky.

Všetky výsledky sú priemer ± SD od najmenej {{0}} myší v každej skupine. Na porovnanie 2 skupín pomocou GraphPad Prism 5 sa použil buď nepárový dvojstranný test (údaje s normálnou distribúciou) alebo Mann-Whitney U test (údaje bez normálnej distribúcie).{5}}. Štatistická významnosť je vyjadrená nasledovne: ∗P < 0:05; ∗∗P < 0:01; a ns: nevýznamné.

Podporná služba Wecistanche - Najväčší vývozca cistanche v Číne:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel:+86 15292862950

Nakupujte pre ďalšie špecifikácie Podrobnosti:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop