Osteopontín z mlieka pre vývoj čriev, imunity a mozgu u predčasne narodených ošípaných
Jun 14, 2022
Ak sa chcete dozvedieť viac informácií, kontaktujte prosímdavid.wan@wecistanche.com
Abstraktné
Nedostatočné hladiny mliečneho osteopontínu (OPN) v dojčenskej výžive môžu čiastočne zodpovedať za vývojové rozdiely medzi dojčatami kŕmenými umelým mliekom alebo materským mliekom. Podporujeme mliečnu diétu doplnenú o hovädzie mliekoOPNzlepšuje vývoj čriev, imunity a mozgu a testovalo sa to na modeli predčasne narodených prasiat. Predčasne narodené ošípané narodené cisárskym rezom (90 percent gravidity) boli kŕmené surovým hovädzím mliekom (CON, n{1}}) alebo rovnakou stravou doplnenou o fyziologicky relevantnú dávku OPN (46 mg/(kg:d), n{ {3}}). Počas štúdie sa hodnotili koncové body súvisiace s klinickými výsledkami, systémovou imunitou a neurokognitívnym vývojom a 19. deň sa odobrali črevné tkanivá. Vzorec rastu, skorý motorický vývoj a väčšina systémových imunitných parametrov boli podobné medzi OPN aKONošípané. OPN ošípané mali vyššie pomery klkov ku kryptám ako CON ošípané a vyšší počet monocytov a lymfocytov na 8. deň. Tráviace a absorpčné funkcie čriev a kognitívna výkonnosť (T-bludisko test) boli medzi OPN a CON ošípanými podobné. Na záver doplnenie stravy sOPNnad bazálnymi hladinami hovädzieho mlieka vyvolalo menšie zlepšenie štruktúry čreva a systémovej imunity bez akýchkoľvek účinkov na kognitívnu výkonnosť. Minimálne hladiny OPN v dojčenskej výžive na zabezpečenie optimálnej adaptácie v bezprostrednom novorodeneckom období je potrebné určiť.
Kľúčové slová: osteopontín; bioaktívny mliečny proteín; predčasne narodených novorodencov; zdravie čriev; systémová imunita; vývoj mozgu; poznanie
Kliknutím sem sa dozviete viac o Cistanche
1. Úvod
Optimalizácia hladín bioaktívnych bielkovín v dojčenskej výžive môže pomôcť znížiť dobre zavedené rozdiely vo vývoji a odolnosti voči chorobám medzi dojčatami kŕmenými výživou a materským mliekom[1-3]. Osteopontín (OPN) je kyslý proteín s vysokou glykozyláciou a fosforyláciou, ktorý sa považuje za dôležitý pre stimuláciu vývoja v bezprostrednom novorodeneckom období a je hojne prítomný v ranom ľudskom mlieku[4-6]. Koncentrácie OPN mlieka sa medzi jednotlivými druhmi výrazne líšia av ľudskom mlieku sú dokonca aj rozdiely medzi jednotlivými matkami vysoké. Pokles počas obdobia laktácie sa zdá byť konzistentným pozorovaním [5,7]. V multicentrickej štúdii bola stredná hladina OPN 160 mg/l približne 13 týždňov po pôrode [7]. Najvyšších 25 percent hladiny OPN v ľudskom mlieku bolo 230-495 mg/l, čo je oveľa viac ako priemerné hladiny uvádzané pre hovädzie mlieko (~18 mg/l) alebo dojčenskú výživu (~9 mg/l)[ 4]. V súčasnosti je hovädzie mlieko OPN komerčne dostupné, a preto sa môže pridávať do dojčenskej výživy, aby sa dosiahli hladiny podobné hladinám v ľudskom mlieku.
Vzhľadom na vysoko konzervované arginín-glycín-aspartátové (RDG) integrínové väzbové miesto v OPN možno očakávať, že biologické účinky budú u jednotlivých druhov podobné [8]. Fragment obsahujúci sekvenciu RDG je vysoko odolný voči rozpadu v dôsledku glykozylácií v blízkosti motívu viažuceho integrín [9], čím podporuje bioaktívny potenciál natívneho mliečneho OPN v čreve. In vitro je mliečny OPN schopný stimulovať proliferáciu črevných buniek a vyvíjať antibakteriálne aktivity ako súčasť komplexu s laktoferínom (LF), ďalším dôležitým bioaktívnym mliečnym proteínom [10,11]. Priaznivé účinky mliečneho OPN v čreve boli preukázané aj in vivo. Intestinálny vývoj u novorodených opíc rhesus sa zlepšil pomocou bovinného mliečneho OPN a transkriptóm jejuna u zvierat kŕmených umelou výživou s doplnkom OPN bol podobný ako u dojčených náprotivkov [12]. Diétne mliekoÚčinky OPNlokálne v čreve, ako aj systémovo po menšej intestinálnej absorpcii u dojčiat, sa čiastočne pripisuje jeho schopnosti stimulovať endogénne hladiny OPN [5,13,14]. OPN sa nachádza vo väčšine telesných tkanív a tekutín, kde okrem účasti na bunkovej proliferácii, migrácii, adhézii a opsonizácii vykonáva rôzne funkcie, ako je biomineralizácia a imunitná modulácia [8,10,15,16]. Je známe, že OPN reguluje rovnováhu Th1/Th2, ktorá je u novorodencov vychýlená smerom k polarizácii Th2 [17]. OPN má vlastnosti podobné cytokínom a môže stimulovať imunitu typu Th1 indukciou expresie IL-12 a inhibíciou produkcie IL-10, Th2cytokínu, v makrofágoch [18]. Okrem toho môže OPN podporovať dozrievanie mozgu a potenciálne prispievať k zlepšeniu kognitívnych funkcií u dojčených detí v porovnaní s deťmi s umelým kŕmením [19-21]. Na podporu tohto javu myšie mláďatá kŕmené OPN vykazovali lepšiu schopnosť učiť sa a vyššie hladiny expresie proteínov súvisiacich s myelinizáciou, vrátane myelínového základného proteínu a glykoproteínu spojeného s myelínom, a OPN tiež zosilnil myelinizáciu in vitro [14,22,23]. U ošípaných v termíne bolo niekoľko oblastí mozgu ovplyvnených zvýšeným relatívnym objemom po doplnení stravy s hovädzím mliekom OPN, ale nepozorovali sa žiadne účinky na kognitívne parametre [24].
Predčasne narodené deti (narodenie<37 weeks="" of="" gestation)="" are="" particularly="" diet-sensitive="" due="" to="" their="" relatively="" immature="" gut,="" immune="" system,="" and="" brain.="" such="" infants="" are="" susceptible="" to="" developing="" both="" short-and="" long-term="" complications="" such="" as="" necrotizing="" enterocolitis="" (nec),="" feeding="" intolerance,="" infections,="" and="" impaired="" neurodevelopment="" [25-28].="" bovine="" milk="" opn="" supplementation="" has="" previously="" been="" shown="" to="" reduce="" nec="" severity="" in="" formula-fed="" preterm="" piglets="" [29],="" and="" other="" milk="" factors="" have="" proven="" to="" support="" brain="" structure="" and="" cognitive="" development,="" particularly="" in="" preterm="" newborns="" [30,31].="" on="" this="" background,="" we="" hypothesized="" that="" preterm="" newborns,="" fed="" a="" standard="" milk="" diet="" with="" relatively="" natural="" bioactivity,="" would="" benefit="" from="" further="" opn="" supplementation.="" following="" an="" initial="" in="" vitro="" demonstration="" of="" opn="" antimicrobial="" activity,="" we="" used="" diet-sensitive="" preterm="" pigs="" [32-34]to="" investigate="" if="" an="" opn-enriched="" bovine="" milk="" diet="" would="" improve="" gut,="" immunity,="" and="" brain="" development="" in="" the="" first="" three="" weeks="" after="" preterm="">
2. Materiály a metódy 2.1. Antibakteriálny test in vitro
Najprv sa na posúdenie biologickej aktivity použil antibakteriálny test [35]OPNkvantifikáciou jeho schopnosti inhibovať rast alebo zabíjať stafylokoka, tj bežného neonatálneho grampozitívneho patogénu [36]. Rovnaké neporušené nepasterizované hovädzie mlieko, ktoré sa použilo ako základ pre enterálnu výživu v štúdii ošípaných, sa postupne rozmrazilo a odstredilo pri 500 x g a 3 000 x 8,4 stupňoch počas 15 minút, pričom sa zakaždým odsala vodná vrstva, aby sa odstránil obsah tuku. minimalizácia straty mliečnych bielkovín [37]. Po testovaní sterility odstredeného hovädzieho mlieka,OPNprášok (Lacprodan⑧ OPN-10, Arla Foods Ingredients, Viby, Dánsko) bol rozpustený v koncentráciách 1,6 (rovnaké ako množstvo pridané v deň 1 v štúdii ošípaných do mlieka OPN), 2,8, 5, 10 a 20 g /L, čím sa vytvorilo 6 testovacích diét vrátane nedoplneného odstredeného hovädzieho mlieka, ktoré sa až do analýzy skladovali v alikvotných podieloch po 1 ml pri -80 stupni. Zmrazené stredné logaritmické kultivačné zásoby [35] S. epidermidis (WT1457 [38], láskavo poskytol Dr. Xiaoyang Wang, Univerzita v Göteborgu, Švédsko) boli rozmrazené, centrifugované pri 3200 x g a resuspendované v sterilnom fyziologickom roztoku pred inkubáciou s 6 testovacích diét (okrem komerčne dostupnej predčasne narodenej mliečnej výživy zahrnutej ako negatívna kontrola [1]) s vypočítanou dávkou 10 stupňov a 106 CFU/ml počas 2, 4, 6 a 24 hodín pri 37 stupňoch. Boli stanovené konečné inokulačné dávky a rast baktérií v testovaných diétach a dojčenskej výžive po rôznych inkubačných časoch [35]. Uskutočnili sa nezávislé triplikáty antibakteriálneho testu.
2.2. Zvieratá a experimentálny dizajn
Všetky postupy na zvieratách boli schválené a vykonávané na základe licencie (číslo licencie 2014-15-0201-00418) vydanej Dánskym inšpektorátom pre experimenty na zvieratách. Štyridsaťosem prasiatok (dánsky Landracex Yorkshire Duroc) od dvoch komerčne chovaných prasníc sa narodilo predčasne cisárskym rezom v približne 90-percentnej gravidite (celý termín: 117 ± 2 d). Po úspešnej resuscitácii a počas stálej anestézie materskými anestetikami sa chirurgické umiestnenie zavedeného umbilikálneho arteriálneho katétra na uľahčenie parenterálnej výživy (PN) a orogastrickej sondy na uľahčenie enterálnej výživy (EN) vykonalo, ako už bolo opísané 32]. Šesť prasiatok bolo utratených ihneď po narodení z dôvodu neúspešnej resuscitácie a následne boli zo štúdie vylúčené. Celkovo bolo štyridsaťdva prasiatok stratifikovaných podľa pohlavia a pôrodnej hmotnosti a zaradených do jednej z dvoch skupín: jedna skupina dostávala surové hovädzie mlieko doplnené o OPN(OPN, n=21) a kontrolná skupina dostávala nesuplementovaný surový hovädzí dobytok. mlieko (KON, n=21)(obrázok 1). Materská plazma bola infúziou v 3 bolusoch (celkovo 25 ml/kg) cez pupočný katéter počas prvých 24 hodín, aby sa zabezpečila pasívna imunizácia. Ošípané boli chované individuálne počas obdobia štúdie 19 dní. Od 1-5 dní boli chované vo vetraných vyhrievaných inkubátoroch (plus okysličovanie počas prvých 24 hodín) a na 5. a 11. deň boli premiestnené do väčších klietok. Všetci klinickí výskumníci boli počas experimentálneho obdobia zaslepení voči liečbe diétou.
2.3. Výživa a kŕmenie
Enterálna strava kŕmená všetkým ošípaným bola založená na nepasterizovanom neporušenom hovädzom mlieku zozbieranom v dvoch dávkach z miestnej farmy kráv v Jersey a skladovanom pri -20 stupni . Hovädzie mlieko bolo obohatené o minerály a vitamíny (15 g/l Pediatric Seravit, Nutricia, Utrecht, Holandsko) a elektrolyty (6 g/l Revolyte Nutrition, Gunnar Kjems ApS, Kodaň, Dánsko). Tento mliečny základ slúžil ako kompletná enterálna strava pre prasiatka v skupine CON. V prípade ošípaných v skupine OPN sa základňa hovädzieho mlieka ďalej dopĺňala hovädzím mliekom OPN (Lacprodan⑧ OPN-10) v mediáne doplnkovOPNkoncentráciu 319 mg/l(IQR 272-445), aby sa získala denná fixná prídavná dávka OPN 46 mg/(kg·deň). Koncentrácia je v rozmedzí OPN v ľudskom mlieku [4]. Koncentrácia OPN v odobratom kravskom mlieku bola 91 mg/l, ako bolo namerané kvapalinovou chromatografiou s tandemovou hmotnostnou spektrometriou (LC-MS/MS, Alphalyse A/S, Odense, Dánsko). Doplnková dávka OPN bola vybraná tak, aby bola v rámci horného konca rozsahu ľudského mlieka, aby sa zabezpečil primeraný rozdiel od kontrolnej diéty hovädzieho mlieka. Denné prípravky enterálnej stravy boli vyrobené a skladované pri 4 stupňoch až do použitia (<24 h).="" pigs="" received="" gradually="" increasing="" volumes="" of="" en="" from="" 32="" ml/(kg.="" day)="" on="" day="" 1="" to="" 180ml/(kg:="" day)on="" day="" 15="" and="" until="" euthanasia.="" the="" enteral="" diets="" were="" given="" as="" boluses.="" during="" the="" daytime,="" the="" boluses="" were="" given="" every="" second="" hour,="" and="" during="" the="" night="" every="" third="" hour="" until="" day="" 9.="" thereafter,="" the="" feeding="" frequency="" was="" reduced="" to="" every="" third="" hour,="" day="" and="" night.="" the="" en="" was="" given="" through="" the="" orogastric="" feeding="" tube="" until="" day="" 5="" when="" pigs="" were="" taught="" to="" drink="" from="" troughs.="" the="" pn="" was="" given="" as="" a="" continuous="" infusion="" in="" decreasing="" amounts="" from="" days="" 1-8="" (144-148="" ml/(kg.="" day))to="" counterbalance="" the="" small="" enteral="" volumes="" the="" piglets="" can="" cope="" with.="" the="" pn="" solution="" was="" a="" commercially="" available="" human="" parenteral="" nutrition="" product="" (kabiven,="" fresenius="" kabi,="" uppsala,="" sweden)="" adjusted="" to="" the="" requirements="" of="" piglets="" as="" previously="" described="" [32].="" after="" removal="" of="" the="" orogastric="" feeding="" tube="" on="" day="" 11="" and="" onwards,="" all="" pigs="" had="" free="" access="" to="">
2.4. Klinické hodnotenie a odber tkaniva
Počas celého obdobia štúdie boli ošípané pozorne monitorované (najmenej každé 3 hodiny) a klinické skóre sa prideľovalo dvakrát denne, ako už bolo opísané [33]. Na základe klinickej indikácie bola zahájená príslušná liečba, napr. podávanie intramuskulárnych analgetík (meloxikam: Metacam, 5 mg/ml Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Nemecko alebo butorfanol: Torbugesic Vet, 10 mg/ml, Zoetis, Parsippany, NJ, USA). V prípadoch nedostatočnej odpovede na liečbu boli ošípané utratené. Telesné hmotnosti sa merali každý deň a priemerný prírastok telesnej hmotnosti vyjadrený ako g/(kg.d) sa vypočítal podľa vzorca: (hmotnosť pri eutanázii-hmotnosť pri narodení)/(priemerná telesná hmotnosť x životnosť). Dvakrát denne boli výkaly hodnotené nasledovne: 1 (pevné výkaly), 2 (mäkké/pastovité výkaly), 3 (krémové výkaly) a 4 (hnačka). V prípade hnačky sa medzi kŕmením podával perorálny roztok elektrolytu (Revolyte Nutrition), aby sa predišlo dehydratácii. Profylaktické perorálne antibiotiká (metronidazol: Flagyl, 40 mg/ml, Sanofi-Aventis, Paríž, Francúzsko; amoxicilín, 500 mg, s kyselinou klavulanovou, 125 mg: Bioclavid, Sandoz GmbH, Kodaň, Dánsko; gentamicín: Gentocin Vet, 4,35 mg/ml , Scanvet, Fredensborg, Dánsko) boli podávané dvakrát denne odo dňa 8-10 po odstránení umbilikálneho arteriálneho katétra. Rovnaká kombinácia perorálnych antibiotík bola podávaná terapeuticky podľa indikácie. V deň 19, 60 minút pred eutanáziou, sa ošípaným podal posledný štandardizovaný bolus ich príslušnej stravy. Ošípané boli anestetizované intramuskulárnou injekciou zolazepamu/tiletamínu (Zoletil 50,25 mg/ml zolazepamu a 25 mg/ml tiletamínu, Virbac, Carros, Francúzsko), ketamínu (Ketaminol, 50 mg/ml, MSD Animal Health, Kenilworth, NJ , USA) a butorfanol (Torbugesic Vet) a následne boli usmrtené pentobarbitalom sodným (Euthanimal, 400 mg/ml, Scanvet) intrakardiálnou injekciou. Ihneď po eutanázii boli vypreparované a odvážené vnútorné orgány, a to celé orgány aj špecifické oblasti orgánov (napr. plný/prázdny žalúdok, tenké črevo, hrubé črevo, celý mozog, oblasti mozgu, pečeň, slezina, obličky, pľúca a srdce). Podiel cerebrálnej vody sa odhadol vážením ľavej mozgovej hemisféry pred a po dehydratácii počas 14 dní pri 50 stupňoch. Každá z piatich gastrointestinálnych oblastí (žalúdok, proximálne tenké črevo (Prox), stredné tenké črevo (Mid), distálne tenké črevo (Dist) a hrubé črevo) boli hodnotené makroskopicky a bolo im priradené skóre NEC [39]. Vzorky tkaniva z každej gastrointestinálnej oblasti sa odobrali a rýchlo zmrazili v tekutom dusíku alebo fixovali v 4 percentnom formaldehyde a skladovali pri -80 stupni až do ďalších analýz. Návrh štúdie a výsledky sú znázornené na obrázku 1.
2.5. Štruktúra črevnej sliznice a aktivity enzýmov na hraniciach kefiek
Štruktúra sliznice v tenkom čreve bola hodnotená meraním výšky klkov a hĺbky krypty histologických rezov tkanív Prox, Mid a Dist fixovaných v paraformaldehyde a zafarbených hematoxylínom a eozínom, ako už bolo opísané [40]. Imunohistochemické farbenie na Ki-67 replikátov rezov Prox, Mid a Dist sa použilo na vyhodnotenie proliferácie enterocytov v sliznici tenkého čreva, ako už bolo opísané [41]. Štyri obrazy každého replikátu sa získali systematickým náhodným spôsobom pomocou svetelného mikroskopu (Ortho-plane, Leitz, Nemecko), pripojeného ku kamere a 10x šošovke objektívu. Analýza obrazu sa uskutočnila s použitím Fiji: Image] (NIH Image, Bethesda, Maryland) a celková plocha Ki-67-pozitívnych zafarbených jadier sa vypočítala ako zlomok celkovej plochy jadier. Aktivita 6 enzýmov kefového lemu (maltáza, sacharáza, laktáza, aminopeptidáza N (ABN), aminopeptidáza A (APA) a dipeptidylpeptidáza IV (DPPIV)) bola stanovená v homogenátoch stredného tkaniva pomocou spektrofotometrie [42].
2.6. Biochémia krvi, hematológia a systémová imunita
Vzorky krvi na biochémiu a hematologické parametre sa analyzovali 1. deň z pupočnej šnúry počas cisárskeho rezu, 8. deň z priechodných umbilikálnych arteriálnych katétrov alebo alternatívne z jugulárnej žily a 19. deň zo srdcovej punkcie počas eutanázie. Plazma na biochémiu získaná heparinizovaným krvným vacutainerom (BDDiagnostics, Oxford, UK) s následnou centrifugáciou (2500 x g, 4 stupne počas 10 minút) bola analyzovaná pomocou ADVIA 1800 Chemistry System (Siemens Healthcare GmbH, Erlangen, Nemecko). Úplná krv na hematológiu a počty imunitných buniek získaná EDTA-potiahnutým krvným vacutainerom (BD Diagnostics) sa analyzovala s použitím hematologického systému ADVIA 2120i (Siemens Healthcare GmbH).
Testy súvisiace so systémovou imunitou na štúdium podskupín krvných T-buniek, funkcie neutrofilnej fagocytózy a imunitných kompetencií ex vivo stimuláciou krvi Toll-like receptor (TLR) sa uskutočnili na vzorkách plnej krvi odobratej v heparinizovanom krvnom vákuovači (BD Diagnostics) na dvoch dni; 8. deň z umbilikálnych arteriálnych katétrov alebo alternatívne jugulárnej žily a 19. deň z krčnej žily. Charakterizácia podskupiny krvných T-buniek sa merala tak, ako už bolo opísané [43]. Stručne, erytrocyty sa lyzovali pomocou lyzačného roztoku 1 X BD FACS (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) a leukocyty sa inkubovali s fixačným/permeabilizačným pufrom (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornia) počas 30 minút pri 4 stupňoch v tme. Po premytí permeabilizačným pufrom (Invitrogen) boli bunky blokované prasacím sérom (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) počas 15 minút pri 4 stupňoch v tme a následne zafarbené štyrmi fluorescenčne značenými monoklonálnymi protilátkami; PE-Cy7-konjugovaná myšacia anti-prasacia CD3 protilátka (klon BB23-8E6-8C8, BD Biosciences), FITC-konjugovaná myšacia anti-prasačia CD4 protilátka (klon MIL17, Bio- Rad Laboratories, Hercules, Kalifornia), PE-konjugovaná myšacia anti-prasacia CD8 protilátka (klon MIL12, Bio-Rad Laboratories) a APC-konjugovaná potkania anti-myšia protilátka FOXP3 (klon JFK-16s, ThermoFisher Scientific). Vzorky sa analyzovali pomocou prietokového cytometra BD Accuri C6 (BDBiosciences) a populácie T-buniek (CD3 plus lymfocyty), cytotoxických T-buniek (CD3 plus CD4-CD8 plus lymfocyty), pomocných T-buniek ( Boli identifikované CD3 plus CD4 plus CD8-lymfocyty) a regulačné T-bunky (CD3 plus CD4 plus FoxP3 plus lymfocyty). Fagocytárna funkcia krvných neutrofilov sa analyzovala prietokovou cytometriou s použitím pHrodo Red Escherichia coli (560/585 nm) Súprava na fagocytózu biočastíc pre prietokovú cytometriu (ThermoFisher Scientific)34]. Fagocytárna rýchlosť bola indikovaná percentom neutrofilov prejavujúcich fagocytózu v populácii neutrofilov (pHrodo plus) a fagocytárna kapacita neutrofilov bola indikovaná strednou fluorescenčnou intenzitou (MFI). Na posúdenie systémovej zápalovej odpovede na ex vivo Gram- negatívna bakteriálna výzva, 294 μl plnej krvi sa inkubovalo s TLR4 agonistom (lipopolysacharidom (LPS), E.coli O127:B8, Sigma Aldrich, St.Louis, MI, USA) počas 5 hodín pri 37 stupňoch, 5 percent CO2. Stimulovaná a nestimulovaná krv sa potom centrifugovala pri 2 000 x g, 4 stupne počas 10 minút a plazmatické supernatanty sa analyzovali na tumor nekrotizujúci faktor (TNF) a interleukín (IL)-10 pomocou ELISA (súpravy pre prasačie špecifické duosety, R&D Systems, Abingdon, UK) podľa pokynov výrobcu. Vzorky plazmy sa pred analýzou zriedili 2-2,5-krát. Na výpočet priemerných hladín a pomerov cytokínov boli zahrnuté iba vzorky s hladinami absorbancie cytokínov v štandardnom rozsahu. Avšak vzorky s hladinami absorbancie cytokínov nižšími ako najnižší štandard, ale vyššími ako slepý pokus, dostali ľubovoľnú hodnotu polovice najnižšej detegovanej hladiny na platni a boli zahrnuté do štatistickej analýzy.
2.7. Skorý motorický vývoj, správanie a poznanie
Čas do prvého státia a prvej chôdze po narodení sa meral ako odhad osvojenia základných motorických zručností. Infračervené kamery citlivé na pohyb nainštalované nad každou domácou klietkou nepretržite zaznamenávali motorickú aktivitu ošípaných od 1. dňa o 21:00 00 popoludní, keď sa ošípané úplne zotavili z anestetík matky, do dňa 11[33]. Priemerný podiel aktívneho času počas hodiny bol vypočítaný zo záznamov v 12-hodinových intervaloch počas dňa (9:00 do 21:00 večer) a v noci (od 9:{{12 }} pm to 9:00 am). Prieskumné správanie každého prasaťa bolo hodnotené v deň 9 v aréne na otvorenom priestranstve (1,2 m × 1,2 m) pomocou videokamery zaznamenanej z vtáčej perspektívy počas {{ 20}-minútové obdobie záznamu s ošípanými v náhodnom poradí. Ošípaným pridelili celkové skóre v reálnom čase dvaja zaslepení pozorovatelia na základe štyroch objektívnych parametrov: kontakt s podlahou, kontakt so stenou, pokusy o útek a množstvo krokov. Získané videá boli následne analyzované pomocou EthoVision XT10 (Noldus Information Technology, Wageningen, Holandsko). Výsledkom bola celková presunutá vzdialenosť a rýchlosť vypočítaná pre každú ošípanú. Po primeranom vizuálnom vývoji a období zvyknutia sa priestorové poznanie každej ošípanej hodnotilo v náhodnom poradí počas dní 12-18 pomocou štandardizovaného kognitívneho testu priestorového T-bludiska [44]. Učenie a pamäť závislé od hipokampu boli testované počas 1-2 akvizícií denne, pričom každá pozostávala z 10 pokusov. Pre ošípané sa použili vizuálne podnety v extra bludisku, aby našli fixnú mliečnu odmenu. Použili sa striedavé počiatočné polohy ošípaných, aby sa predišlo ego-centrickým mechanizmom odozvy a mlieko sa umiestnilo do oboch ramien odmeny. Aby sa zamaskovali čuchové signály, mlieko bolo dostupné iba v jednej z ramien. Počet správnych volieb na akvizíciu sa zaznamenal počas štandardnej fázy (Akvizície 1-6, dni 12-17) a fázy zvrátenia (Akvizície 7-9, dni 17-18). V reverznej fáze sa mliečna odmena zmenila na opačné rameno. Ako kritérium učenia bolo definovaných minimálne 80 percent správnych volieb (8 správnych z 10 pokusov) [30].
2.8. Štatistická analýza
Na všetky štatistické analýzy bol použitý štatistický softvér R (verzia 3.6.0). Pre antibakteriálny test sa rozdiely v raste S. medzi 6 testovanými diétami a dojčenskou výživou počas 2-24 h inkubácie analyzovali pomocou lineárneho modelu zmiešaných účinkov (funkcia Ime) s očkovacou dávkou, časom a testovanou diétou /vzorec ako fixné efekty (vrátane interakcie medzi poslednými dvoma) a experimentálne obdobie ako náhodný efekt, po ktorom nasledujú párové porovnania v každom časovom bode (ls znamená balík). Nepretržité opakované merania zo štúdie ošípaných (tj telesná hmotnosť, aktivita v domácej klietke, správne voľby v kogničnom teste priestorového T-bludiska a parametre tenkého čreva merané v niekoľkých oblastiach) sa analyzovali pomocou lineárneho modelu zmiešaných účinkov (funkcia me). vrátane vhodnej korelačnej štruktúry a prasaťa ako náhodného efektu. Balík uľahčil následné porovnania v rámci každej oblasti tenkého čreva. Coxov model proporcionálneho nebezpečenstva (funkcia) sa použil na nepretržité údaje o čase do udalosti (tj získanie základných motorických zručností a prvé prejavenie hnačky). Všetky ostatné kontinuálne dáta sa analyzovali použitím viacnásobného lineárneho regresného modelu (funkcia lm). Holmova korekcia sa použila na všetky biochemické údaje krvi, aby sa opravilo viacnásobné porovnávacie testovanie a kontrolovala sa chybovosť v rodine. Diskrétne údaje o čase do udalosti (tj percento ošípaných, ktoré dosiahli kritérium učenia sa v T-bludisku) sa analyzovali pomocou zovšeobecneného modelu viacnásobnej lineárnej regresie (funkcie) s binomickou odozvou a komplementárnou log-log väzbou. Pohlavie, vrh a pôrodná hmotnosť boli pred štúdiou identifikované ako biologicky relevantné potenciálne mätúce faktory, a teda zahrnuté ako fixné účinky vo všetkých vyššie uvedených modeloch. Okrem toho, pre všetky biochemické a hematologické parametre krvi boli základné hladiny namerané v deň 1 pred randomizáciou skupiny zahrnuté ako fixné účinky v zodpovedajúcich modeloch viacnásobnej lineárnej regresie. Overenie modelu lineárnych regresných modelov sa uskutočnilo grafickým zobrazením normality a homoskedasticity rezíduí a prispôsobených hodnôt a v prípade potreby sa vykonali transformácie údajov (log alebo sqrt), aby sa splnili tieto predpoklady. Pre premenné, ktoré sa nemohli prispôsobiť normálnemu rozdeleniu, sa použil neparametrický Mann-Whitney test. Regresné modely s premennými kategorickej odozvy boli validované skúmaním kumulovaných zvyškov pomocou testu dobrej zhody (balíka). Pokiaľ nie je uvedené inak, nespracované údaje sú prezentované ako priemer ± SD a p-hodnoty<0.05 are="" considered="" statistically="">
3. Výsledky
3.1. Antibakteriálny test in vitro
Hodnotili sa účinky odstredeného hovädzieho mlieka doplneného OPN v rôznych koncentráciách na rast a životaschopnosť S. a porovnávali sa s dojčenskou výživou. Po 4, 6 a 24 hodinách inkubácie s dojčenskou výživou sa koncentrácia S. zvýšila približne 10, 50 a 1 × 10 plus-násobok, v uvedenom poradí, pre obe inokulačné dávky (10) a 10 stupňov FU ). Pred 4 hodinami inkubácie s očkovacou dávkou 105 CFU neboli žiadne rozdiely medzi 6 testovanými diétami a výživou (obrázok 2). Zjavný baktericídny účinok testovaných diét na báze hovädzieho mlieka bol však evidentný v porovnaní s dojčenskou výživou, pretože koncentrácia S. v nich zostala statická počas 1-4 h inkubácie. Po 4 hodinách inkubácie, po rovnakej inokulačnej dávke, boli počty baktérií nižšie vo všetkých 6 testovaných diétach v porovnaní s umelou výživou (približne 10-krát, p < 0,01).="" suplementácia="" opn="" mala="" na="" dávke="" závislé="" dlhodobé="" bakteriostatické="" účinky="" proti="" s.,="" pretože="" počty="" baktérií="" po="" 6="" hodinách="" inkubácie="" boli="" významne="" nižšie="" v="" testovaných="" diétach="" obsahujúcich="" 4="" najvyššie="" dávky="" opn=""><0.05,10>očkovacia dávka). Iba nedoplnené odstredené hovädzie mlieko stratilo na chvíľu svoju schopnosť zabrániť rastu baktérií, keď sa inkubovalo počas 6 hodín (očkovacia dávka 105 CFU). Po 24 hodinách inkubácie boli počty baktérií nižšie vo všetkých 6 testovaných diétach v porovnaní s umelou výživou (p<001, 105="" cfu="" inoculation="" dose).="" all="" 6="" test="" diets="" exerted="" bacterial="" inhibitory="" effects="" (initially="" bactericidal)="" against="" s.,="" inoculated="" at="" 10°cfu,="" at="" all="" tested="" time=""><2 h="" of="" incubation=""><0.07,>2 h inkubácie p<>
3.2. Klinické výsledky a výsledky rastu
Sedem ošípaných (5/21 OPN v porovnaní s 2/21 CON, p=0.4) zo 42 ošípaných bolo utratených/uhynutých v dôsledku nezrelosti/iatrogénnych komplikácií na začiatku experimentu(
3.3. Štruktúra a funkcia čreva
Výška klkov a hĺbka krypty, hodnotené v proximálnej, strednej a distálnej časti tenkého čreva, boli medzi týmito dvoma skupinami podobné (tabuľka 2). V porovnaní s CON bol v OPN nameraný celkovo vyšší pomer klkov ku kryptám v troch oblastiach tenkého čreva (p<0.05, figure="" 4a).="" similar="" amounts="" of="" proliferative="" enterocytes="" were="" observed="" between="" the="" two="" groups,="" indicated="" by="" the="" same="" relative="" area="" of="" ki-67="" positive="" stained="" nuclei="" in="" the="" three="" small="" intestinal="" regions="" (figure="" 4b,="" c).="" further,="" the="" gastric="" emptying="" ability="" indicated="" by="" the="" gastric="" content="" weights="" at="" euthanasia="" as="" well="" as="" the="" activity="" of="" lactase,="" maltase,="" sucrase,="" apa,="" abn,="" and="" dppiv="" measured="" in="" the="" middle="" part="" of="" the="" small="" intestine="" were="" comparable="" between="" the="" groups="" (table="">
3.4. Biochémia krvi, hematológia a systémová imunita
Vzorky pupočníkovej krvi odhalili vyšší celkový počet leukocytov a bazofilov v deň 1 (str<0.05)of pigs="" later="" assigned="" the="" opngroup="" relative="" to="" pigs="" assigned="" the="" con="" group.="" no="" other="" immune="" cell="" counts,="" blood="" biochemistry,="" or="" hematology="" variables="" differed="" between="" the="" two="" groups="" prior="" to="" receiving="" their="" specific="" dietary="" interventions(data="" not="" shown).="" blood="" biochemistry="" variables="" measured="" on="" days="" 8="" and="" 19="" did="" not="" differ="" between="" groups(table="" s1,="" supplementary="" materials),="" and="" accompanied="" hematology="" parameters="" and="" immune="" cell="" counts="" are="" presented="" in="" table="" 3.="" compared="" with="" con="" pigs,="" opn="" pigs="" had="" a="" higher="" lymphocyte="" and="" monocyte="" count="" on="" day=""><0.05, figure="" 5a,="" b).="" the="" lymphocyte="" and="" monocyte="" count="" increased="" from="" day="" 8="" to="" day="" 19,="" with="" no="" final="" differences="" between="" the="" groups(figure="" 5a,="" b).="" the="" remaining="" immune="" cell="" counts="" and="" nonimmune-related="" hematological="" parameters="" were="" similar="" between="" opn="" and="" con="" pigs="" (table="" 3).="" innate="" and="" adaptive="" immune="" parameters="" were="" evaluated="" on="" days8="" and="" 19.="" on="" day="" 8,="" the="" blood="" neutrophil="" phagocytic="" rate="" and="" capacity="" were="" similar="" between="" opn="" and="" con="" (table="" 3).="" conversely,="" on="" day="" 19="" they="" had="" a="" higher="" frequency="" of="" neutrophils="" exerting="" phagocytosis="" compared="" with=""><0.05). the="" phagocytic="" capacity="" was="" though="" not="" different="" between="" groups="" (figure="" 5c,="" d).="" the="" t-cell="" subset="" characterization="" on="" days="" 8="" and="" 19="" did="" not="" reveal="" any="" differences="" between="" t="" helper="" cells,="" cytotoxic="" t="" cells,="" and="" regulatory="" t="" cells="" in="" the="" two="" groups="" (table="" 3).="" a="" representative="" facs="" gating="" is="" shown="" in="" figure="" s1,="" supplementary="" materials.="" the="" tlr4-mediated="" il10="" and="" tnf-α="" cytokine="" production="" of="" full="" blood="" from="" days="" 8="" and="" 19="" was="" evaluated.="" tnf-α="" and="" il10="" were="" detected="" at="" similar="" levels="" between="" opn="" and="" con="" in="" unstimulated="" plasma="" obtained="" on="" day="" 8="" and="" there="" were="" no="" group="" differences="" in="" the="" response="" to="" lps="" stimulation="" indicated="" by="" a="" similar="" tnf-α/il10="" ratio(table="" s2,="" supplementary="" materials).="" tnf-α="" was="" not="" detectable="" in="" unstimulated="" plasma="" obtained="" on="" day="" 19="" from="" either="" group.="" however,="" both="" groups="" responded="" equally="" to="" lps="" stimulation,="" indicated="" by="" similar="" tnf-α="" and="" il-10="" plasma="" levels="" (table="" s2,="" supplementary="">
3.5. Štrukturálny a funkčný výsledok mozgu
Štrukturálne výsledky súvisiace s mozgom vrátane absolútnych a relatívnych hodnôt celkovej hmotnosti mozgu, regionálnych hmotností mozgu a obsahu cerebrálnej vody boli podobné medzi skupinami OPN a CON (tabuľka 4). Neboli pozorované žiadne rozdiely v ranom motorickom vývoji, pretože čas do prvého státia, prvej chôdze a prvého dobrovoľného príjmu plného mliečneho bolusu, ako aj podiel aktívneho času v domácich klietkach boli merané kamerami citlivými na pohyb z Days { {3}}, boli podobné medzi OPN a CON (obrázok 6A-D). Prieskumné správanie ošípaných hodnotené v aréne na otvorenom poli v deň 9 bolo medzi týmito dvoma skupinami porovnateľné, pretože celkové skóre, celková presunutá vzdialenosť a rýchlosť boli podobné (tabuľka 4). Okrem toho bol podobný kognitívny výkon pozorovaný počas štandardnej a reverznej fázy v kognitívnom teste priestorového T-labyrintu vykonanom počas 9 akvizícií od 12- do 18. dňa (obrázok 7A, B). Priemerný podiel správnych volieb sa časom zvýšil pre obe skupiny v oboch fázach (obrázok 7A). V štandardnej fáze dosiahli OPN aj CON vopred definované kritérium učenia v akvizícii 5 (80 percent správnych možností, obrázok 7A). Všetky ošípané dosiahli kritérium učenia a nebol žiadny rozdiel v čase dosiahnutom kritériom učenia (obrázok 7B).
4. Diskusia
Multifunkčné účinky OPN, najmä pokiaľ ide o jeho proliferatívnu, imunitnú regulačnú a antibakteriálnu aktivitu, ale potenciálne aj pri podpore vývoja mozgu, môžu pomôcť zlepšiť zdravie a vývoj orgánov citlivých novorodencov a dojčiat. Vysoké hladiny OPN v ranom materskom mlieku a zodpovedajúce plazmatické koncentrácie OPN u dojčiat obhajujú dostatočný prísun OPN v bezprostrednom novorodeneckom období, keď sú dojčatá kŕmené ľudským mliekom [5]. Naopak, nižšia koncentrácia OPN v kravskom mlieku a dojčenskej výžive 4 poskytuje príležitosť na zvýšenie obsahu OPN v mliečnej výžive a suplementácia OPN môže pomôcť znížiť vývojové rozdiely, ktoré existujú medzi umelou výživou a materským mliekom. -kŕmené dojčatá [2,3]. V tejto štúdii sme ukázali, že suplementácia OPN do stravy z hovädzieho mlieka s bazálnym obsahom OPN bola dobre tolerovaná, ale pozorovali sa len malé zlepšenia v štruktúre čreva a systémovej imunite a nepozorovali sa žiadne ďalšie účinky na štruktúru a funkciu mozgu. Základ z hovädzieho mlieka bol vybraný tak, aby zabezpečil relevantnú bioaktívnu základnú stravu v porovnaní s mliečnou formulou, ktorá má okrem nižšieho obsahu OPN tiež zníženú bioaktivitu. Mliečny OPN je uznávaný ako dôležitý biologicky aktívny srvátkový proteín, najmä vďaka svojej schopnosti modulovať imunitu a stimulovať bunkovú proliferáciu [18,45]. Schopnosť OPN tvoriť komplexy s kladne nabitým laktoferínom nachádzajúcim sa v mlieku môže pridať ďalšie funkčné vlastnosti, ktoré prispievajú k obrane proti patogénom v čreve dojčiat [10]. OPN-laktoferínový komplex sa nachádza v ľudskom a hovädzom mlieku, ale môže byť vytvorený aj z jednotlivých proteínov [10]. Aby sme zdokumentovali bioaktívny potenciál OPN v strave na báze hovädzieho mlieka, pôvodne sme testovali in vitro antibakteriálnu schopnosť OPN z hovädzieho mlieka pridaného v rôznych koncentráciách do sterilného odstredeného Jersey mlieka. Naše výsledky ukazujú, že mliečne diéty suplementované OPN vykazujú krátkodobú aj dlhodobú antibakteriálnu schopnosť v závislosti od dávky inhibíciou rastu S. epidermidis, bežného novorodeneckého patogénu, ktorý spôsobuje sepsu s neskorým nástupom po translokácii čreva [46,47 ]. To poskytuje príležitosť stimulovať vývoj čriev pomocou OPN suplementácie novorodeneckej mliečnej stravy. Optimálne hladiny OPN v strave založenej na mlieku sú nejasné a variabilita obsahu OPN v ľudskom mlieku je veľká, a to medzi matkami a krajinami, ako aj počas obdobia laktácie [7. Predchádzajúce štúdie na zvieratách skúmali predovšetkým účinky pridania OPN ku kontrolnej strave bez OPN v hladinách porovnateľných s priemerným obsahom ľudského mlieka [14,22,24]. V tejto predklinickej štúdii ošípaných sme sa zamerali na klinicky relevantný aspekt pridania väčšieho množstva OPN do stravy s bazálnou hladinou OPN na dosiahnutie vysokých hladín ľudského mlieka. Suplementácia OPN v tejto štúdii zvýšila dennú dávku OPN na dávku predstavujúcu príjem u dojčiat od matiek s relatívne vysokou koncentráciou mlieka OPN a značne nad rámec toho, čo sa bežne dostáva z dojčenskej výživy[4]. Ukázalo sa, že obsah OPN v zozbieranom Jerseyskom mlieku má vyšší obsah OPN ako predtým nameraný v mlieku hovädzieho dobytka. Je dôležité poznamenať, že použitá metóda LC-MS/MS sa líši od metódy ELISA použitej v predchádzajúcich štúdiách [48]. Nedostatok kognitívnych účinkov v súčasnej štúdii môže spočívať v skutočnosti, že kontrolné ošípané už dostávajú OPN v koncentráciách 91 mg/l, ktoré sú prirodzene prítomné v mlieku z Jersey, a dodatočný doplnok OPN neposkytuje žiadne ďalšie výhody. Zistili sme, že dopĺňanie hovädzieho mlieka OPN bolo dobre tolerované a malo menšie účinky na dozrievanie čriev a imunity, zatiaľ čo štrukturálne a funkčné parametre mozgu zostali nezmenené. Obe ošípané OPN a CON vykazovali rýchlosti rastu porovnateľné alebo vyššie, než aké sa bežne pozorujú u predčasne narodených prasiatok v podobných štúdiách s diétou s hovädzím mliekom [49-51]. Rýchlosť rastu a relatívne dobrý klinický stav s nízkym skóre NEC dosiahnutým u týchto predčasne narodených ošípaných poskytli optimálne podmienky na dokumentovanie účinkov stravy na zmeny orgánových funkcií a kognitívny vývoj mozgu u citlivých novorodencov.
Medzi ľudskými, kravskými a prasacími sekvenciami OPN je vysoká podobnosť [52] a všadeprítomná povaha OPN je u ošípaných dobre potvrdená. OPN je exprimovaný rôznymi zdravými tkanivami ošípaných s najväčším výskytom v ileálnom tkanive [53], ale koncentrácie v mlieku ošípaných nie sú známe. Už predtým sme preukázali menšie priaznivé účinky na črevá prípravku obohateného o OPN u predčasne narodených prasiatok vo vzťahu k zotaveniu z prenatálneho zápalu [43]. Spolu to zdôrazňuje použitie prasiatka ako predklinického modelu na skúmanie účinkov doplnkov stravy OPN. V porovnaní s CON mali ošípané OPN vyšší pomer klkov ku kryptám v tenkom čreve. Podobný morfologický rozdiel bol hlásený na základe duodenálnych vzoriek od 10-dňových mláďat myší, ktoré kojili samice divokého typu alebo matky knock-out OPN suplementované hovädzím mliekom OPN v porovnaní s mláďatami myší, ktoré nedostávali žiadny OPN[22]. Predchádzajúce štúdie predčasne narodených ošípaných korelovali zvýšené výšky klkov so zvýšenou schopnosťou absorpcie živín, napr. galaktózy [51,54], čo môže byť rozhodujúce pre zabezpečenie optimálneho rastu. Použitím prasacej IPEC-J2 bunkovej línie sme predtým in vitro preukázali schopnosť OPN zvyšovať bunkovú proliferáciu v závislosti od dávky [43]. Zlepšená hrubá štruktúra črevnej sliznice pozorovaná u ošípaných OPN v súčasnej štúdii sa nedala vysvetliť zvýšením proliferatívnych enterocytov na základe farbenia Ki-67 v tenkom čreve a neviedla k zmeneným aktivitám tráviacich enzýmov. Skoršie nálezy u novorodených opíc rhesus s doplnkom OPN kŕmených umelým mliekom ukázali, že črevné zmeny s profilmi expresie génov jejuna sú podobnejšie ako u dojčených náprotivkov [12]. Rovnaká vývojová trajektória týkajúca sa počtu imunitných buniek bola pozorovaná u ošípaných OPN a CON. Počet všetkých imunitných buniek, okrem počtu bazofilov a eozinofilov, s podobne nízkymi hladinami u donosených prasiatok [34], sa zvýšil od 8. do 19. dňa, čo poukazuje na zvýšenú schopnosť oboch skupín vyvolať dostatočnú imunitnú odpoveď na potenciálny patogén. Hladiny cirkulujúcich monocytov a lymfocytov u OPN ošípaných v deň 8 boli vyššie v porovnaní s CON ošípanými, ale nie v deň 19. Keďže klinický stav bol podobný medzi ošípanými v oboch skupinách a skóre NEC nízke, hladiny monocytov a lymfocytov pravdepodobne súvisia hlavne s liečbou účinky a naznačujú zrýchlený imunitný vývoj u OPN ošípaných. Vyšší podiel cirkulujúcich monocytov sa pozoroval aj v randomizovanej kontrolovanej štúdii u šesťmesačných dojčiat, ktoré dostávali umelú výživu s pridaným hovädzím mliekom OPN v koncentráciách 65 mg/l a 135 mg/l v porovnaní s dojčenými kontrolami [55]. OPN je schopný interagovať s imunitnými bunkami prostredníctvom svojho receptora a pôsobiť ako chemotaktické činidlo pre IL-1-aktivované monocyty, ktoré môžu byť fyziologicky relevantné počas zápalu [16]. OPN môže ďalej hrať úlohu vo vrodenej imunite sprostredkovaním fagocytózy prostredníctvom integrínového receptora, ox 2, exprimovaného na povrchu monocytov [16]. Je potrebné preskúmať ďalšie štúdie skúmajúce úlohu OPN na funkciu monocytov a ako sa to premieta do prínosu pre dojčatá s umelým kŕmením.
Charakterizácia podskupiny T-buniek sa uskutočnila v dňoch 8 a 19, aby sa ďalej opísala populácia lymfocytov, ale neodhalili žiadne rozdiely vo frakciách podskupiny medzi týmito dvoma skupinami v tomto bezprostrednom novorodeneckom období. Dojčatá, ktoré dostávali dojčenskú výživu doplnenú o OPN (65 alebo 130 mg/l), preukázali zvýšený podiel T-buniek v prvých šiestich mesiacoch života v porovnaní s kŕmenou základnou dojčenskou výživou [55]. Táto odpoveď sa nemusí vyvinúť už v prvých týždňoch života, alebo relatívne vysoká hladina OPN v našom základnom hovädzom mlieku (91 mg/l) môže obmedziť ďalšie zmeny. Počet T-buniek, pomocných T-buniek a cytotoxických T-buniek sa medzi OPN a CON nelíšil, a preto nemôže vysvetliť rozdiely v cirkulujúcich lymfocytoch medzi týmito dvoma skupinami v deň 8. V tejto štúdii sme farbili na CD3, CD4, CD8 a Foxp3 a zostáva preskúmať, či vyšší počet lymfocytov môže pochádzať z vyššieho počtu B-buniek alebo zvýšeného počtu prirodzených zabíjačských buniek. Zrenie systémovej imunity po narodení zahŕňa posun v rovnováhe Th1/Th2, kde obrana proti bakteriálnym infekciám vyžaduje skreslenie Th1 [17]. OPN je silný chemoatraktant s vlastnosťami podobnými cytokínom a je známe, že reguluje rovnováhu Th1/Th2 [18]. V tejto štúdii nebola rovnováha Th1/Th2 krátko po narodení modulovaná stravou indikovanou podobným pomerom TNF-/IL10 v deň 8. Keďže hladiny TNF-o neboli zistené v nestimulovaných vzorkách plazmy od dňa 19, TNF-/IL10 pomer v tomto bode nebolo možné vypočítať. Nedávno štúdie na zvieracích modeloch [14,22,24] skúmali úlohu mliečneho OPN v neurovývoji počas detstva. Použitím modelu knockout myší OPN sa ukázalo, že mlieko s hladinami OPN podobnými ľudskému mlieku zlepšuje vývoj motorických zručností a pamäťových schopností závislých od hipokampu u 30-dňových myších mláďat v porovnaní s kontrolnými zvieratami s deficitom OPN. Tieto funkčné mozgové výsledky diétneho OPN súvisiaceho s mliekom boli spojené so zvýšenými hladinami endogénneho mozgového OPN a vyššou proliferáciou a diferenciáciou nervových / gliových antigénových dvoch buniek na oligodendrocyty, čo viedlo k zvýšenej expresii proteínov súvisiacich s myelínom. V podobnom experimentálnom usporiadaní vykazovali mláďatá myší divokého typu ošetrované OPN knockout matkami a dostávajúce doplnkové hovädzie mlieko OPN（12 ug/g） väčšiu pamäťovú schopnosť ako nedoplnené kontroly [22]. Súhrnne tieto výsledky naznačujú, že mliečny OPN hrá dôležitú úlohu v neurokognitívnom vývoji a že OPN hovädzieho mlieka môže mať takéto priaznivé účinky na všetky druhy. Zistili sme podobný vývoj pri získavaní základných motorických zručností, aktivite v domácej klietke a prieskumnom správaní v aréne v otvorenom poli medzi skupinami. Skupinové výkony v teste priestorového T-bludiska ďalej naznačili podobné učenie a pamäť, a tým aj kognitívne schopnosti závislé od hipokampu. Naše zistenia sú v súlade s nedávno vykonanou štúdiou, ktorá porovnávala dvojdňové prasiatka v termíne, ktoré dostávali diétu na báze sójového proteínu bez OPN alebo doplnenú 250 mg/l hovädzieho mlieka OPN [24]. Medzi týmito dvoma skupinami boli evidentné iba obmedzené rozdiely v správaní, ktoré sa posudzovali počas novej úlohy rozpoznávania objektov vykonanej na 30. deň po narodení. Z toho vyplýva, že prinajmenšom u zdravých ošípaných narodených v termíne suplementácia mlieka OPN ďalej nezlepšuje vývoj súvisiaci s mozgom, ako bolo merané pomocou nové rozpoznávanie objektov. Podobne ako pri teste priestorového T-bludiska [44] sa nová úloha rozpoznávania objektov považuje za závislú od hipokampu, a preto môžu byť tieto behaviorálne testy citlivejšie bližšie k času maximálnej rýchlosti rastu hipokampu, ku ktorému dochádza v termíne u samcov a samíc ošípaných. približne v 8. a 3. týždni po pôrode [56]. Nie je známe, či dlhodobé kognitívne zlepšenia po suplementácii mliečneho OPN v ranom veku, ako sa preukázalo v štúdiách na myšom modeli [14,22], mohli byť dokumentované u ošípaných v neskorších časových bodoch.
Pokiaľ ide o štrukturálny vývoj mozgu, už predtým bolo prostredníctvom zobrazovania magnetickou rezonanciou zdokumentované, že suplementácia OPN v strave zvýšila počet regionálnych objemov mozgu po normalizácii na celkové objemy mozgu [24]. V tejto štúdii sme nezistili žiadne diétou vyvolané rozdiely v regionálnych hmotnostiach mozgu, ani absolútne hmotnosti, ani relatívne k celkovým hmotnostiam mozgu. Preto sme nevykonali hlbšiu analýzu, ako je meranie hladín génovej expresie myelínových proteínov, napr. myelínového bázického proteínu a myelínom asociovaného glykoproteínu [14,23]. Už skôr bolo zdokumentované, že exogénny OPN má neuroprotektívne vlastnosti tým, že zmierňuje intracerebrálnym krvácaním indukovaný neurozápal, čo vedie k zlepšeniu neurologického skóre [57I. Je potrebný ďalší výskum, aby sa zistilo, či je mliečna OPN schopná preniesť priaznivé štrukturálne a funkčné účinky na mozog počas systémových zápalových stavov, s ktorými sa často stretávajú predčasne narodené deti [26]. To bolo mimo rozsahu súčasnej štúdie.
5. Závery
Na modeli predčasne narodených ošípaných citlivých novorodencov sme ukázali, že bioaktívna diéta z hovädzieho mlieka doplnená dodatočným hovädzím mliekom OPN je dobre tolerovaná a indukuje menšie zlepšenia v štruktúre čreva a systémovej imunite bez ďalších účinkov na štrukturálny alebo funkčný vývoj mozgu. Suplementácia OPN nad rámec toho, čo sa dostáva z bazálneho hovädzieho mlieka, čím sa dosiahne úroveň na vysokej fyziologickej úrovni toho, čo dojčatá prirodzene dostávajú z ľudského mlieka, môže mať preto obmedzené účinky na črevá, imunitu a vývoj mozgu u citlivých novorodencov v bezprostrednom novorodeneckom období . Viac informácií o výhodách suplementácie mliečnej OPN dojčenskej výživy na báze hovädzieho mlieka na stimuláciu vývoja postihnutých novorodencov je potrebné určiť.
