Mitochondriálne proteíny odhaľujú mechanizmus, ktorým fyzické cvičenie zlepšuje pamäť, učenie a motorickú aktivitu v modeli potkanov s hypoxickou ischemickou encefalopatiou, časť 3

4. Materiály a metódy

4.1. Zvieratá a experimentálne skupiny

Na túto štúdiu sa použilo 36 potkanov Sprague-Dawley. Zvieratá sa udržiavali pri teplote 22 ± 1 °C s 12-hodinovými cyklami svetlo/tma a mali voľný prístup k potrave a vode. Experimentálne postupy sa uskutočňovali so súhlasom Etického inštitucionálneho výboru pre starostlivosť o zvieratá a výskum Univerzity Zhengzhou.

Temný cyklus označuje obdobie, keď ľudia v noci spia, a úzko súvisí s pamäťou. Pre väčšinu ľudí dobrý nočný spánok zlepšuje fyzické zdravie a funkciu mozgu. Spánok zároveň súvisí aj s pamäťovým procesom mozgu.

Keď spíme, naše telá vstupujú do rôznych štádií spánku, vrátane spánku s rýchlym pohybom očí (REM) a spánku bez rýchleho pohybu očí (NREM). Tieto štádiá zohrávajú dôležitú úlohu pri regulácii integrácie informácií mozgu a konsolidácie pamäte.

Väčšina ľudí pociťuje pozitívne účinky spánku na koncentráciu a pamäť. Výskumy ukazujú, že spánok nám môže pomôcť upevniť a posilniť naše spomienky a dokonca zlepšiť našu schopnosť učiť sa. Počas spánku mozog integruje nové informácie s existujúcimi znalosťami, čím zvyšuje schopnosť ukladať a používať pamäť.

Naopak, nedostatok dostatočného spánku môže viesť k strate pamäti a problémom s učením. Dlhodobá nespavosť môže spôsobiť rôzne problémy v tele a mozgu, ktoré ovplyvňujú každodenný život a funkčnosť. Správna spánková stratégia a rozumný životný štýl sú preto kľúčové pre udržanie dobrej pamäte.

Celkovo existuje spojenie medzi temnými cyklami a pamäťou. Adekvátny spánok môže podporiť integráciu mozgových informácií a konsolidáciu pamäte, zatiaľ čo dlhodobé poruchy spánku môžu ovplyvniť funkciu mozgu a pamäť. Preto by sme mali venovať pozornosť kvalite spánku v našom každodennom živote a udržiavať zdravý životný štýl, aby sme účinne podporovali a zlepšovali našu pamäť a schopnosti učenia. Je vidieť, že potrebujeme zlepšiť pamäť a Cistanche deserticola dokáže výrazne zlepšiť pamäť, pretože Cistanche deserticola dokáže regulovať aj rovnováhu neurotransmiterov, ako je zvýšenie hladín acetylcholínu a rastových faktorov. Tieto látky sú veľmi dôležité pre pamäť a učenie. Okrem toho môže Cistanche deserticola tiež zlepšiť prietok krvi a podporiť dodávku kyslíka, čo môže zabezpečiť, že mozog dostane dostatok živín a energie, čím sa zlepší mozgová vitalita a vytrvalosť.

Kliknite na spoznajte 10 spôsobov, ako zlepšiť pamäť

Bolo vynaložené maximálne úsilie na zníženie počtu zvierat a minimalizáciu utrpenia zvierat počas experimentov. Zvieratá boli náhodne rozdelené do štyroch skupín (obrázok 8). (1) HIE, NT (skupina hypoxia-ischemiaencefalopatia bez tréningu na cvičenie) pozostávala zo zvierat, ktoré boli modelované na hypoxicko-ischemickú encefalopatiu na 7. deň po narodení anestéziou mláďat izofluránom (5 % indukcia, 1,5 % udržiavanie).

Ľavá spoločná krčná tepna sa potom natrvalo podviazala a mláďatá sa umiestnili na 30 minút na teplé zotavovacie pohovky a potom sa preniesli do hypoxickej komory s kontinuálnym prietokom hypoxickej zmesi plynov 92 % N2 a 8 % O2 počas 90 minút a potom sa vrátili do klietok do 10. týždňa bez toho, aby ich podrobili plaveckému cvičeniu. (2) HIE, T (skupina s hypoxicko-ischemickou encefalopatiou s cvičebným tréningom) pozostávala zo zvierat, ktoré boli modelované na hypoxicko-ischemickú encefalopatiu ako v (1) a vrátili sa do klietok do 6. týždňa života a potom sa podrobili 90-minútovému plávanie denne počas piatich dní s 2 dňami odpočinku týždenne počas 4 týždňov, (3) SHAM, NT (kontrolná skupina) zahŕňala zvieratá, ktoré neboli podrobené žiadnej liečbe, ale žili normálny život v klietkach od 1. do 10. týždňa bez cvičebný tréning a (4) SHAM, T pozostával zo zvierat, ktoré neboli podrobené žiadnej liečbe, ale žili normálny život v klietkach od popôrodného dňa1 až do 6 týždňov, po ktorých boli vystavené plaveckému cvičeniu počas 4 týždňov.

Zvieracie mozgy z rôznych skupín sa potom zozbierali a pripravili na western blotting (hipocampus a mozgová kôra) a imunofluorescenciu (motorická kôra).

4.2. Paradigma cvičenia

Zvieratá boli chované s potravou a vodou ad libitum a udržiavané v 12-cykle svetlo/tma. Boli rozdelené do dvoch skupín: zvieratá so sedením (HIE, NT a SHAM, NT) a zvieratá, ktoré cvičia (HIE, T a SHAM, T). Cvičné zvieratá boli po 6. týždni po pôrode po dobu 4 týždňov podrobené tréningu v plávaní; 5 dní v týždni mali plávanie s 2 dňami odpočinku. Každé plávanie trvalo 90 minút. Bazén bol naplnený do hĺbky 50 cm, aby sa zvieratám zabránilo dotýkať sa dna nádrže.

Zvieratá sa nechali voľne plávať bez akejkoľvek ďalšej záťaže a boli počas plávania jemne stimulované. Potkany boli po cvičení starostlivo vysušené a vrátené do klietok.

4.3. Vertica! Test pólového motora

Zvieratá v každej skupine boli jedno po druhom umiestnené lícom nahor na tyč pokrytú látkou (priemer 3.0 cm a dĺžka 150 cm), ktorá bola držaná vo vodorovnej polohe, potom bola postupne zdvihnutá do polohy vertikálnej polohe a čas, keď potkan zostal na tyči, sa zaznamenával maximálne 2 minúty (120 s). V tomto teste zviera s deficitom motorickej koordinácie a rovnováhy spadne z tyče.

4.4. Morrisov test vo vodnom bludisku (MWM)

Potkany (vo veku 10 týždňov) boli podrobené MWM po absolvovaní 4 týždňov cvičebného protokolu (SHAM, 'T a HlE, T). Všetky údaje o vodnom bludisku boli zaznamenané pomocou video sledovacieho systému Panjab SMART (Panlab Howo Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd.) (Shanghai, Čína). MWM sa použil tak, ako je opísané v 132]. Stručne povedané, potkany používali vizuálne signály umiestnené na hraniciach bazéna, aby dosiahli skrytú plošinu a unikli z vody. Učenie bolo hodnotené počas 7 dní. Pred hodnotením učenia sa potkany umiestnili do bazéna, ktorý obsahoval čistú vodu a viditeľnú plošinu. Počas tréningu mali potkany skúšobné plavecké cvičenia, aby sa s úlohou oboznámili.

Počas fázy učenia boli potkany natreté čiernym farbivom pre ľahké sledovanie videa a platforma bola ponorená. Každý potkan bol podrobený štyrom testom z rôznych východiskových bodov (kvadrantov). Latencia alebo čas potrebný na dosiahnutie platformy sa zaznamenával každý deň systémom Panlab SMART Video Tracking System. V posledný deň experimentu bola platforma odstránená a každý potkan bol znovu vložený do vody, koľkokrát zvieratá prešli cez miesto skrytej plošiny v kvadrante, ktorý predtým obsahoval plošinu (cieľový kvadrant).

4.5. Western blotting

Šesť potkanov bolo náhodne vybraných z každej skupiny pre experiment na úrovni proteínov. Proteíny boli extrahované z hipokampu a kôry a homogenizované v RIPA činidle (CW2333S, CoWin Biosciences, Cambridge, MA, USA) a rozdelené na cytoplazmatické a jadrové proteíny. Koncentrácie proteínov boli stanovené pomocou testu kyseliny bicinchoninikovej (BCA) (CW0014S, CoWin Biosciences, Cambridge, MA, USA) a celkovo 20 g proteínu bolo separovaných elektroforézou na univerzálnych SDS-PAGE géloch (CFAS AnyKD PAGE) # PE008, Zhonghui Hecai Bio-pharmaceutical Technology Co., Ltd., Shaanxi, Čína.

Proteíny sa potom preniesli na polyvinylidénfluoridové membrány (PVDF) (R1CB12934, Merck Millipore Ltd., (Burlington, MA, USA). Membrány sa blokovali 2 hodiny 5 % hovädzím sérovým albumínom (BSA) (č. A8020, Solarbio Life Sciences , Peking, Čína) pri izbovej teplote a inkubované s nasledujúcimi primárnymi protilátkami od spoločnosti Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA): AIF (D39D2, 1:1000), Cytochróm C (136F3, 1:1000), štiepená kaspáza{{ 13}} (Asp175, 1:1000), Smac/Diablo (D553R, 1:1000) a OPA1 (D7C1A, 1:1000).

GAPDH od Servicebio, Wuhan, Čína (GB11002, 1:2000) a H3 od Proteintech (17168-1-AP, 1:1000) pri 4 ◦C cez noc a následne sekundárna protilátka SA konjugovaná s HRP00001-2 od Proteintect (1:5000) inkubácia počas 2 hodín pri teplote miestnosti. Proteínové pásy sa vizualizovali pomocou vylepšenej chemiluminiscenčnej súpravy #KF005 od Affinity Biosciences a zobrazili sa systémom Bio-Image Analysis System (Zhengzhou University, Zhengzhou, Čína). Pomery intenzít proteínových pásov k GAPDH (cytoplazmatické proteíny) a H3 (jadrové proteíny) ako interným referenciám boli stanovené pomocou ImageJ.

4.6. Imunofluorescencia

{{0}}}µm koronálne rezy mozgového tkaniva sa získali pomocou mraziaceho mikrotómu (Leica, Nemecko) na imunofluorescenciu. Sklíčka boli blokované 2 hodiny PBS s 10 % fetálnym hovädzím sérom, (#A8020, Solarbio Life Sciences, Peking, Čína) a 0,3 % Triton ×-100, Amresco 0694, Biosharp, Estónsko pri teplote miestnosti a potom inkubované s primárnymi protilátkami od Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA): anti-AIF, D39D2 (riedenie 1:400), anti-cytochróm C, 136F3 (riedenie 1:200), anti-štiepená kaspáza-3 Asp175 (riedenie 1:400), anti-Smac/Diablo, D553R (riedenie 1:200) a anti-OPA1, D7C1A (riedenie 1:400) cez noc pri 4 °C.

Potom sa sklíčka premyli 3-krát, vždy 10 minút v PBS, a potom sa inkubovali so sekundárnymi protilátkami (ab150077 od Abcam, Cambridge Biomedical Campus, Cambridge, UK) počas 2 hodín pri izbovej teplote v tme. DAPI,#C0065 od Solarbio Life Sciences, Peking, Čína (1:100 PBS) sa pridalo na 5 minút a vylialo, premylo sa v PBS 3-krát vždy po 5 minútach, vysušilo sa, pridalo sa činidlo proti zhášaniu (#P0126, Beyotime Biotechnology, Shanghai, Čína), sklo sklíčka sa pripevnili na podložné sklíčka a vzorky sa uchovávali pri teplote -20 ◦C počas 2 hodín a odobrali sa na mikroskopické zobrazenie. Snímky tkaniva sa zachytili pomocou konfokálneho fluorescenčného mikroskopu (Ni-U942877, Nikon, Tokio, Japonsko) a obrázky predstavujúce proteíny v motorickej kôre sa potom kvantifikovali pomocou FIJI-ImageJ, ako je opísané v [33].

4.7. Štatistická analýza

Pre všetky analýzy bola použitá verzia GraphPad Prism 8.0.0 pre Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Na meranie štatistickej významnosti sa použila jednosmerná ANOVA nasledovaná Dunnettovými post hoc testami. Výsledky sú prezentované ako priemer ± SEM a p < 0,05 sa považovalo za štatisticky významné.

5. Závery

Táto štúdia ukazuje, že cvičenie pri plávaní zlepšilo motorickú aktivitu, pamäť a učenie spojené s HIE potlačením mitochondriálnej apoptózy prostredníctvom signálnych dráh Cyto.C/štiepená kaspáza-3 a AIF. Okrem toho sa ukázalo, že intervencia pri plávaní stabilizuje mitochondriálne krísty a membránové potenciály, ako to znázorňuje reverzia Smac/Diablo a OPA1 u potkanov s HIE. Výsledkom je, že ide o atraktívny a životaschopný základ pre ďalší výskum na dešifrovanie viacerých molekulárnych dráh, ktoré by bolo možné manipulovať s cieľom efektívne zvládnuť HIE a výsledné deficity. Zatiaľ čo táto štúdia úspešne preukázala úlohu cvičenia pri zvrátení štrukturálnych a funkčných deficitov spôsobených mitochondriami. podľa HIE nevyčerpal všetky možné metódy na stanovenie toho, ako sú mitochondriálne cristae stabilizované; je to dôležité pre budúci výskum na túto tému.

Autorské príspevky: Konceptualizácia, FG, FP, YW a CC; spracovanie údajov, FG, FP, YW, HL a JF; formálna analýza, FG, HL a CC; získavanie financií, CC; vyšetrovanie, FG, FP, YW, HL a JF; metodológia, FG, FP, YW a CC; administrácia projektu, FG, YW a CC; zdroje, CC; softvér, FG, FP, JF a CC; dozor, CC; validácia, FG, FP, YW, HL a CC; vizualizácia, FG, FP, YW, HL a JF; písanie – pôvodný návrh, FG a YW; písanie – kontrola a úprava FG a HL Všetci autori si prečítali publikovanú verziu rukopisu a súhlasili s ňou.

Financovanie: Táto štúdia je podporovaná Vedeckým a technologickým výskumným projektom oddelenia vedy a techniky provincie Henan (Grant č. 212102310217) a grantom z fondov Národnej nadácie pre prírodné vedy Číny (Grant č. 81401015).

Vyhlásenie Inštitucionálneho revízneho výboru: Štúdia bola vykonaná podľa smerníc Výboru pre starostlivosť o výskumné zvieratá Univerzity Zhengzhou; ZZUIRB2022-32.

Vyhlásenie o informovanom súhlase: Neuplatňuje sa.

Vyhlásenie o dostupnosti údajov: Neuplatňuje sa.

Konflikty záujmov: Autori nevyhlasujú žiadny konflikt záujmov.

Referencie

1. Li, B.; Concepcion, K.; Meng, X.; Zhang, L. Mozgovo-imunitné interakcie pri perinatálnom hypoxicko-ischemickom poškodení mozgu. Prog. Neurobiol.2017, 159, 50–68. [CrossRef]

2. Douglas-Escobar, M.; Weiss, MD Hypoxicko-ischemická encefalopatia: Prehľad pre lekára. JAMA Pediatr. 2015, 169, 397–403.[CrossRef] [PubMed]

3. čierna, RE; Cousens, S.; Johnson, HL; Lawn, J.; Rudan, I.; Bassani, D.; Jha, P.; Campbell, H.; Walker, CF; Cibulskis, R.; et al. Globálne, regionálne a národné príčiny detskej úmrtnosti v roku 2008: Systematická analýza. Lancet 2010, 375, 1969–1987. [CrossRef]

4. Juul, SE; Ferriero, DM Farmakologické neuroprotektívne stratégie pri poranení mozgu u novorodencov. Clin. Perinatol. 2014, 41, 119–131.[CrossRef]

5. Zhu, C.; Rodriguez, JI; Li, T.; Xu, Y.; Sun, Y. Úloha faktora indukujúceho apoptózu pri perinatálnom hypoxicko-ischemickom poškodení mozgu. NeuralRegen. Res. 2021, 16, 205–213. [CrossRef] [PubMed]

6. Song, S.-H.; Jee, Y.-S.; Ko, I.-G.; Lee, S.-W.; Sim, Y.-J.; Kim, D.-Y.; Lee, S.-J.; Cho, YS Cvičenie na bežeckom páse a cvičenie na kolese zlepšujú motorickú funkciu potlačením apoptotickej smrti neuronálnych buniek u potkanov so zápalom mozgu. J. Exerc. Rehabil. 2018, 14, 911–919.[CrossRef]

7. Kelly, M.; Darrah, J. Vodné cvičenie pre deti s detskou mozgovou obrnou. Dev. Med. Dieťa. Neurol. 2005, 47, 838-842. [CrossRef]

8. Müller, P.; Duderstadt, Y.; Lessmann, V.; Müller, NG laktát a BDNF: Kľúčové mediátory neuroplasticity indukovanej cvičením?J. Clin. Med. 2020, 9, 1136. [CrossRef]

9. Intlekofer, KA; Cvičenie Cotman, CW pôsobí proti klesajúcej funkcii hipokampu pri starnutí a Alzheimerovej chorobe. Neurobiol.Dis. 2013; v tlači. [CrossRef]

10. Real, C.; Ferreira, A.; Chaves-Kirsten, G.; Torrão, A.; Pires, R.; Britto, L. Blokáda BDNF receptora bráni prospešným účinkom cvičenia na potkanom modeli Parkinsonovej choroby. Neuroveda 2013, 237, 118–129. [CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com