Molekulárne cesty súvisiace s podporou dlhovekosti a kognitívnym zlepšením Cistanche Tubulosa u Drosophila

pre viac informácií:{0}}

Wei-Yong Lin a kol

Abstrakt:

Pozadie:Proces starnutia vrátane fyzickej dysfunkcie a poruchy pamäti súvisiacej s vekom (AMI) sa považuje za korelujúcu s kumulatívnym oxidačným poškodením a signálnymi dráhami inzulínu/IGF-1. Účel: Cieľom tejto štúdie bolo objasniť in vivo účinky na oddialenie starnutia a zlepšenie AMI a základné molekulárne mechanizmyCistanche tubulosa(CT), bylina používaná v tradičnej čínskej medicíne na zlepšenie sexuálnej funkcie a liečbu dysfunkcie obličiek

Metódy:Muchy, ošetrené a neošetrené CT(Cistanche Tubulosa), boli pozorované pre dĺžku života, odolnosť voči oxidačnému stresu s H2O2 alebo paraquatom, test hladovania, kognitívne správanie s T-labyrintom a hladiny transkripcie cieľových génov pomocou kvantitatívnej RT-PCR.

Výsledky:Podávanie CT(Cistanche Tubulosa)predĺžila strednú a maximálnu životnosť a zvýšila odolnosť proti oxidačnému stresu u múch. CT(Cistanche Tubulosa)suplementácia tiež zlepšila tvorbu pamäte u mladých múch a potlačila starnutie AMIupon. Bolo identifikovaných niekoľko génov a signálnych dráh, vrátane mechanistického cieľa rapamycínu (mTOR) a sietí Notch, ktoré spôsobujú tieto farmakologické účinky a zmeny v génovej expresii glutamátových receptorov.

Záver:Naše výsledky naznačujú, že CT(Cistanche Tubulosa)suplementácia môže prispieť k spomaleniu fenotypov starnutia a zmierneniu kognitívno-behaviorálneho poklesu u múch, čo naznačuje potenciálnu použiteľnosť na zlepšenie ľudského zdravia a zníženie náchylnosti na poruchy súvisiace s vekom.

Kľúčové slová:starnutie,Cistanche tubulosa,Kognitívne správanie, Herb

Kliknite na kmeňové produkty Cistanche

Úvod

Keďže starnúca populácia na celom svete rastie, uľahčenie zdravého starnutia a dlhovekosti je čoraz dôležitejším problémom verejného zdravia pre vedu, spoločnosť a oblasť lekárskej starostlivosti. Proces starnutia bol navrhnutý ako riadený zložitými mechanizmami, poháňanými širokou súhrou genetických a environmentálnych faktorov. Kvôli postupnému poškodeniu na bunkovej a tkanivovej úrovni je vek rizikovým faktorom a vysoko koreluje s náchylnosťou na chronické ochorenia, ako je rakovina, ako aj kardiovaskulárne a neurodegeneratívne ochorenia (Kenyon, 2005). Starnutie tiež znižuje synaptickú aktivitu, syntézu nových bielkovín a kognitívne funkcie. Tieto funkčné zmeny prispievajú k zhoršeniu pamäti súvisiacej s vekom (AMI) (Burke a Barnes, 2010; Schimanski a Barnes, 2010). Preto vývoj liekov na oddialenie patológií súvisiacich s vekom a kognitívneho starnutia môže byť prospešný pre kvalitu ľudského života. V tejto štúdii sme použili Drosophila melanogaster, ktorý je ideálnym organizmom pre štúdie starnutia in vivo kvôli jeho krátkej životnosti, na vyhodnotenie účinnosti lieku a preskúmanie molekulárnych mechanizmov, ktoré sú základom zmiernenia starnutia a AMI.

Herbacistanche, tiež známy pod svojím čínskym názvom Rou CongRong, je parazitická rastlina, ktorá sa vyskytuje hlavne v púštiach severozápadnej Číny. Dva druhy Cistanche, Cistanche deserticolaY. C. Ma aCistanchetubulosa(Schrenk) Wight sú zahrnuté v Čínskom liekopise (vydanie z roku 2005) pre ich podobné chemické zložky a farmakologické aktivity. Extrakt z ich stonky sa už tisíce rokov široko používa ako tonikum, hlavne na liečbu rôznych symptómov, vrátane nedostatočnej funkcie obličiek, impotencie, neplodnosti a na uľahčenie katarzie, ako je opísané v starých čínskych lekárskych knihách. Početné chemické zložky, vrátane éterických olejov, fenyletanoidových glykozidov (PhG), iridoidov, lignanov a sacharidov, boli izolované zCistanchedruhy a dve hlavné zložky PhG, akteozid a andechinakozid, sa typicky vyberajú ako markery na hodnotenie kvality Herba cistanche kvôli ich významným farmakologickým účinkom (Wang et al., 2012).

Cistanche tubulosa(CT) extrakty majú rôzne biologické funkcie, medzi ktoré patrí modulácia imunitnej aktivity, zvýšenie sexuálnej funkcie, podpora rastu vlasov a ďalšie výhody v oblasti antioxidácie, hepatoprotekcie, antiosteoporotickej aktivity a protinádorovej aktivity (Li et al., 2016; Seok et al., 2015 Wang a kol., 2012). Štúdia in vitro navyše odhalila, že Herbacistancheextrakt môže chrániť neuróny podobné dopamínu pred oxidačným poškodením vyvolaným H2O2-a významne zvyšuje hladiny nervového rastového faktora a neurotrofického faktora odvodeného z mozgu (Lin et al., 2013). Echinakozid zabránil smrti dopamínových neurónov v myšom modeli Parkinsonovej choroby s léziami MPTP (Zhao et al., 2010). Navyše CT(Cistanche Tubulosa)extrakt zlepšil kognitívnu dysfunkciu znížením ukladania amyloidu a zvýšením hladín acetylcholínu a dopamínu v potkanom modeli Alzheimerovej choroby (AD) (Wu et al., 2014). Hoci terapeutický účinok Herbycistancheje stále potrebné na potvrdenie, malorozmerného, ​​placebom nekontrolovaného klinického skúšania na CT(Cistanche Tubulosa)glykozidové extrakty ukázali, že liek má potenciál liečiť pacientov s miernou až stredne závažnou AD a má relatívne mierne nežiaduce reakcie aj po dlhodobom podávaní (Guo et al., 2013). Tieto údaje naznačujú, že v Herbe sú glykozidové extraktycistanchemajú neuroprotektívne a anti-demenčné účinky. Napriek rôznym výhodám CT(Cistanche Tubulosa)jeho molekulárne mechanizmy a účinky na oddialenie starnutia a zlepšenie AMI neboli objasnené. V tejto štúdii sú účinky CT(Cistanche Tubulosa)pri významnom predĺžení životnosti sa skúmala lepšia odolnosť voči environmentálnemu stresu a potlačená kognitívna dysfunkcia súvisiaca s vekom, aby sa určila možná klinická užitočnosť CT(Cistanche Tubulosa)pri spomaľovaní procesu starnutia.

Materiály a metóda

Bylinková medicína

Identifikácia pôvoduCistanche tubulosa(Schrenk) Wight (Orobanchaceae) (CT) bol overený v Ko Da PharmaceuticalCo. Ltd. (Taoyuan, Taiwan), kde sa uchovávajú kupónové vzorky (10 603 205) a vyrába sa CT koncentrovaný bylinný liek. Stručne, vysušená mäsitá stonka CT sa extrahovala v 12-násobne prevarenej vode počas 1 hodiny, po čom nasledovala filtrácia. Filtráty sa zhromaždili a podrobili sa vákuu a koncentrácii pri zníženom tlaku počas 1 hodiny, aby sa získali extrakty. CT extrakty sa zmiešali so škrobom v pomere 1:1 (hmotn./hmotn.) a podrobili sa sprejovej granulácii na získanie CT prášku.

Údržba muškárskych zásob a meranie životnosti

Divoký typ mušky použitý v tejto štúdii bol z CantonS, získaný z Bloomington Drosophila Stock Center. Muchy boli chované a udržiavané v štandardnom médiu kukuričnej múčky pri 25 stupňoch pri 50–60 percentnej relatívnej vlhkosti v 12-hodinovom cykle svetlo-tma. Vznikajúce dospelé muchy boli zozbierané do 24 hodín a oddelené podľa pohlavia. Od ranej dospelosti boli muchy doplnené CT. CT(Cistanche Tubulosa)prášok sa rozpustil vo vode a pridal do média kukuričnej múčky v koncentráciách 5,4, 10,8 a 21,6 mg/ml, ktoré boli úmerné účinnej dennej dávke na orálne podanie človeku. Pri analýze dĺžky života bolo dvadsať až tridsať múch chovaných v liekovke s jedlom s alebo bez CT(Cistanche Tubulosa); pre každé ošetrenie sa vykonalo najmenej 250 múch. Fľaštičky s jedlom sa vymieňali každé 3 až 4 dni a v tom čase sa počítali mŕtve muchy

Testy odolnosti voči stresu

Dospelé muchy boli odobraté a potom vopred ošetrené kontrolnou stravou bez CT(Cistanche Tubulosa)a experimentálne diéty doplnené o 5,4, 10,8 a 21,6 mg/ml CT počas 20 dní pri 25 stupňoch. Na analýzu hladovania boli muchy držané vo fľaštičkách iba s vlhkými papiermi a hodnotili sa ich výdrž proti oxidačnému stresu vyvolanému hladovaním. Na testy oxidačného stresu boli muchy prenesené do fľaštičiek bez potravy, ktoré obsahovali filtračný papier s peroxidom vodíka (H2O2) (Sigma Aldrich) v 5-percentnom roztoku glukózy, aby sa zmerala odolnosť muchy voči hydroxylovým radikálom (OH) indukovaným H2O2- −) stres. Podobne boli muchy prenesené do liekoviek obsahujúcich filtračný papier nasýtený 10 mM paraquatom (Sigma-Aldrich), ktorý vytvára superoxidové anióny (O2 -), ktoré spôsobujú oxidačné poškodenie zvierat. Muchy boli hodnotené z hľadiska úmrtnosti najmenej trikrát denne, kým neboli všetky mŕtve. Na jedno ošetrenie sa vykonalo najmenej 250 múch. Na šplhanie sa muchy vystavené parakvátu počas 0 a 16 hodín umiestnili do plastovej fľaštičky a jemne poklepali na dno. Počet múch na vrchole ampulky sa spočítal po 18 sekundách stúpania.

Hodnotenie plodnosti

Panenskí muži aj ženy kŕmili 5,4 a 10,8 mg/ml CT(Cistanche Tubulosa)20 dní slúžili ako experimentálne skupiny. Desať experimentálnych samíc sa spárilo s rovnakým počtom panenských samcov, ktorí mali 9-deň a nedostali CT. Podobne sa pokusné samce spárili s panenskými samicami v rovnakom stave. Spárované muchy sa potom preniesli do novej liekovky na znášanie vajíčok na 24 hodín a celkové množstvo vajíčok znesených do liekoviek sa spočítalo manuálne. Anindex plodnosti sa vypočítal ako priemerná denná produkcia vajec na samicu. Uskutočnilo sa najmenej päť ampuliek na ošetrenie a celkový počet múch n=50–80.

Čuchové asociatívne učenie a pamäť

Muchy boli odobraté po eklózii a vopred ošetrené 5,4, 10,8 a 21,6 mg/ml CT(Cistanche Tubulosa)slúžili ako experimentálne skupiny a kontrolné muchy nedostali CT(Cistanche Tubulosa)počas 5 a 2 0 dní pri 25 stupňoch . Podľa predchádzajúcej štúdie sa uskutočnil jeden tréningový pokus (Dubnau et al., 2001). Stručne povedané, približne 100 múch bolo postupne vystavených dvom pachom, buď 3-oktanolu (OCT, Sigma-Aldrich) alebo 4-metylcyklohexanolu (MCH, Sigma-Aldrich). Muchy vystavené prvému pachu (podmienený stimul, CS plus ) boli spárované s 80 V elektrickými výbojmi a potom dostali druhý pach (CS-) bez výbojov. Schopnosť učenia sa určila ihneď po tréningu a schopnosti 3- a {{ 12}hodinová pamäť vykonala test po tréningu počas 3 a 24 hodín. Na vykonanie testu boli vycvičené muchy uväznené do vybraného bodu T-bludiska, v ktorom boli súčasne vystavené OCT a MCH. Vypočítal sa výkonnostný index (PI), ktorý predstavuje podmienené zamedzenie zápachu. Hodnota PI nula indikovala distribúciu 50:50 a hodnota PI 100 ukázala distribúciu 0:100 preč od CS plus zápachu.

Meranie hladín transkriptu prostredníctvom kvantitatívnej PCR v reálnom čase (qPCR)

Muchy boli zozbierané po eklózii a vopred ošetrené 5,4 a 10,8 mg/ml CT(Cistanche Tubulosa)počas 20 dní pri 25 stupňoch slúžili ako experimentálne skupiny a kontrolné muchy nedostali CT. Celková RNA bola extrahovaná pomocou súpravy RNeasy Mini kit (Qiagen) a cDNA bola syntetizovaná z celkovej RNA prostredníctvom reverznej transkripčnej reakcie pomocou vysokokapacitnej cDNA reverznej transkripcie (Thermo Fisher Scientific). Úrovne transkriptov cieľových génov boli kvantifikované prostredníctvom kvantitatívnej polymerázovej reťazovej reakcie v reálnom čase (Applied Biosystems ViiATM 7 Real-Time PCR System) pomocou FastStart SYBR Green Master (Roche) podľa pokynov výrobcu. Relatívne množstvo transkriptov sa normalizovalo pomocou metódy porovnávacieho prahu cyklu s vnútorným štandardom RpLP0. Rozdiely relatívnej expresie v cieľových génoch experimentálnych skupín boli normalizované na rozdiely v kontrolnej skupine a prezentované ako násobná zmena. Priméry pre cieľové gény sú uvedené v doplnkovej tabuľke 1.

Konštrukcia a analýza siete

Na analýzu funkčnej interpretácie a biologických procesov sprostredkovaných rozdielne exprimovanými génmi, ktoré sme identifikovali, sa použila databáza pre anotáciu, vizualizáciu a integrovaný objav (DAVID) na anotáciu a analýzu obohatenia dráhy a génu Kjótskej encyklopédie génov a genómu (KEGG). Ontológia pre tieto gény (Jiao et al., 2012). Na analýzu priamych a nepriamych interakcií rozdielne exprimovaných génov bol zoznam génov tiež nahraný do vyhľadávacieho nástroja na vyhľadávanie interagujúcich génov/proteínov (STRING), aby sa získali informácie o interakcii a vytvorili sa siete interakcie s proteínmi (Franceschini et al., 2013).

Štatistická analýza

Všetky experimenty sa uskutočňovali s najmenej tromi nezávislými replikátmi a štatistické analýzy sa uskutočňovali pomocou softvéru SigmaStat v3.5 (Systat Software, Inc., IL). Údaje o predĺžení životnosti a oxidačnom strese boli vykonané s celkovým počtom múch v rozsahu 250–350 a log-rank test bol hodnotený pre rôzne analýzy. Skupinové porovnania na hodnotenie plodnosti a kognitívny test sa hodnotili jednosmernou analýzou rozptylu (ANOVA), po ktorej nasledoval Dunnettov post-hoc test. Ďalšie experimentálne porovnania sa uskutočnili vykonaním Studentovho t-testu v porovnaní s kontrolnou skupinou. Údaje sú vyjadrené ako priemer ± SEM a p-hodnota < 0,05="" sa="" považovala="" za="">

Výsledky

Suplementácia CT (Cistanche Tubulosa) zvyšuje životnosť múch

Ak chcete preskúmať, či CT(Cistanche Tubulosa)suplementácia môže predĺžiť životnosť muchy, muchy boli doplnené 5,4, 10,8 a 21,6 mg/ml CT ihneď po eklózii pri 25 stupňoch počas experimentálnych postupov. Naše údaje ukázali, že CT(Cistanche Tubulosa)suplementácia môže predĺžiť životnosť samcov aj samíc múch. Ako je znázornené na Obr. 1A, životnosť samcov múch sa predĺžila o všetky dávky CT(Cistanche Tubulosa). Priemerná dĺžka života v skupinách s doplnkom 5,4, 10,8 a 21,6 mg/ml CT sa významne zvýšila o 18,9 percenta, 10,3 percenta a 9,9 percenta. CT(Cistanche Tubulosa)tiež významne zvýšila maximálnu životnosť všetkých CT skupín v porovnaní s kontrolnou skupinou z 88 na 102, 98 a 102 dní po liečbe 5,4, 10,8 a 21,6 mg/ml CT(Cistanche Tubulosa), resp. U žien CT(Cistanche Tubulosa)významne zvýšili priemernú dĺžku života CT skupín v porovnaní s kontrolnou skupinou (obr. 1B). Priemerná dĺžka života sa zvýšila na 18,8 percent s 5,4 mg/ml CT(Cistanche Tubulosa)a 5,5 percenta a 6,7 ​​percenta s 10,8 a 21,6 mg/ml CT, v danom poradí. Tiež sme pozorovali, že maximálna dĺžka života sa významne predĺžila z 91 dní (kontroly) na 109, 98 a 102 dní po liečbe CT 5,4, 10,8 a 21,6 mg/ml.(Cistanche Tubulosa), v tomto poradí; maximálna veľkosť zvýšenia maximálnej dĺžky života bola 19,8 percenta pri 5,4 mg/ml CT(Cistanche Tubulosa). Naše výsledky naznačujú, že CT(Cistanche Tubulosa)suplementácia stravy výrazne predlžuje životnosť samcov aj samičiek múch. Kurkumín (10 μM) sa použil ako pozitívna kontrola a účinná pri predĺžení života, ako je znázornené na doplnkovom obrázku 1.

Suplementácia CT zvyšuje odolnosť voči hladovaniu a oxidačnému stresu

Predĺženie životnosti je často spojené so zvýšenou odolnosťou voči oxidačnému stresu počas procesu starnutia. Hodnotili sme, či CT(Cistanche Tubulosa)suplementácia zvyšuje odolnosť voči oxidačnému stresu. Samce a samice muchy boli vopred ošetrené rôznymi dávkami CT(Cistanche Tubulosa)20 dní a vyhodnotili sa z hľadiska ich prežitia po hladovaní (obr. 2A). Priemerný čas prežitia a maximálna dĺžka života oboch pohlaví v porovnaní s kontrolnou skupinou vykazovali signifikantné zvýšenia v 5,4 a 10,8 mg/ml CT skupinách, ale nie v 21 0,6 mg/ml CT(Cistanche Tubulosa)skupina. Vopred ošetrené muchy boli tiež hodnotené z hľadiska ich prežitia po expozícii H202 a paraquatom, ktoré produkujú reaktívne formy kyslíka (ROS), aby vyvolali starnutie buniek a bunkovú smrť. Zistili sme, že CT(Cistanche Tubulosa)chránili samčie aj samičie muchy pred toxicitou H2O2 a predĺžili ich strednú a maximálnu životnosť (obr. 2B, p < 0.{5}}1 a 0,001 pri 5,4 a 10,8 mg/ml CT(Cistanche Tubulosa), respektíve). Bol tiež pozorovaný podobný trend vykazujúci zvýšenú odolnosť voči parakvátu. Samce kŕmené muchami všetkými dávkami CT a samice, najmä tie, ktoré boli doplnené 5,4 mg/ml CT(Cistanche Tubulosa) (Cistanche Tubulosa), prežili dlhšie ako kontroly (obr. 3A, p < 0,001).="" čo="" sa="" týka="" schopnosti="" šplhať,="" samcom="" aj="" samičkám="" muchy="" podali="" 10,8="" mg/ml="">(Cistanche Tubulosa)vykazovali oslabenú lokomotorickú dysfunkciu vyvolanú paraquatom 16 hodín po aplikácii paraquat-u (obr. 3B, všetky p < 0="" 0,05).="" tieto="" výsledky="" ukazujú,="" že="" suplementácia="" ct="" zlepšuje="" odolnosť="" voči="" určitému="" oxidačnému="" stresu,="" čo="" naznačuje,="" že="">(Cistanche Tubulosa)-indukované predĺženie života je spojené so zvýšenou antioxidačnou obranou.

Účinky CT (Cistanche Tubulosa) na reprodukčnú kapacitu

Pretože teória starnutia naznačuje, že proces starnutia negatívne ovplyvňuje reprodukciu, skúmali sme, či CT(Cistanche Tubulosa)ovplyvnená reprodukčná zdatnosť analýzou schopnosti dospelých múch znášať vajíčka. Dospelé muchy boli odobraté po eklózii, oddelené podľa pohlavia a podané 5,4 a 10,8 mg/ml CT(Cistanche Tubulosa)na 20 dní. Panenské samce alebo samice múch podávané CT(Cistanche Tubulosa)boli spárené s 9-dňovými muchami, ktorým nebolo podané CT(Cistanche Tubulosa). Pozorovali sme na dávke závislé zvýšenie denného počtu vajíčok znesených na samicu, konkrétne 30,3 percenta a 57,2 percenta starých múch ošetrených 5,4 a 10,8 mg/ml CT(Cistanche Tubulosa)v porovnaní s kontrolami (obr. 4, p < 0.05).="" tieto="" údaje="" naznačujú,="" že="">(Cistanche Tubulosa)suplementácia by mohla uľahčiť reprodukčnú kapacitu starých žien, ale pravdepodobne nie u starších mužov.

Suplementácia CT (Cistanche Tubulosa) zlepšuje kognitívne schopnosti

Zisťovali sme, či CT(Cistanche Tubulosa)suplementácia má priaznivé účinky na učenie a pamäťové schopnosti, uskutočnil sa jeden cyklus čuchovo-asociatívneho tréningu. Hodnotíme výkonnosť učenia, ako aj 3- a 24-h pamäť, ktorá sa považuje za strednodobú pamäť a dlhodobú pamäť. Najprv boli muchy doplnené rôznymi dávkami CT(Cistanche Tubulosa)na 5 dní. Schopnosť učiť sa bola podobná v CT aj v kontrolnej skupine (obr. 5A). Pokiaľ ide o 3-h pamäť, CT 10,8 mg/ml(Cistanche Tubulosa)skupina mala tendenciu mať vyšší výkonnostný index (PI) ako kontrolná skupina (obr. 5B, 51,5 ± 3,2 oproti 42,6 ± 2,1), hoci neexistuje žiadny významný rozdiel. Navyše 5,4 a 10,8 mg/ml CT(Cistanche Tubulosa)významne zlepšila {{0}}h pamäť múch v porovnaní s kontrolami (obr. 5C, PI=41,6 ± 3,6 a 45,9 ± 3.0 oproti 29,6 ± 2,9, v tomto poradí , p < 0,05="" a="" 0,01).="" tieto="" výsledky="" ukázali,="" že="" suplementácia="" ct="" zlepšuje="" tvorbu="" pamäte="" u="" mladých="" múch.="" po="" druhé,="" zatiaľ="" čo="">(Cistanche Tubulosa)suplementácia zvýšila dlhovekosť a oxidačnú odolnosť múch, ďalej sme určili, či suplementácia môže zlepšiť aj kognitívne správanie u starých múch. Muchám sa podávalo štandardné jedlo s alebo bez 5,4, 10,8 a 21,6 mg/ml CT(Cistanche Tubulosa)na 20 dní na napodobnenie starnutia; muchy doplnené týmito dávkami CT(Cistanche Tubulosa)mali výrazne vyššie hodnoty PI učenia (67,6 ± 1,9, 72,5 ± 0,5 a 75,2 ± 1,3 v uvedenom poradí) ako kontrolné skupiny (58.0 ± 2.0; Obr. 5D , p < 0.001), čo naznačuje, že CT(Cistanche Tubulosa)má priaznivý vplyv na oddialenie vekom podmieneného poklesu učenia.Podobné výsledky tiež ukázali, že CT 5,4 mg/ml(Cistanche Tubulosa)skupina mala efektívnejšie uchovávanie pamäte za {{0}}h (obr. 5E, 47,5 ± 1,9 oproti kontrole37.{{10}} ± 2,9, p < 0,05)="" a="" 24-="" h="" pamäťové="" testy="" (obr.="" 5f,="" 31,8="" ±="" 3,8="" oproti="" kontrole="" 19,3="" ±="" 2,4,="" p="">< 0,01).="" tieto="" výsledky="" naznačujú,="" že="">(Cistanche Tubulosa)suplementácia nielen zvyšuje tvorbu pamäti u mladých múch, ale tiež odďaľuje zhoršenie kognitívneho správania a udržiava efektívnejšie učenie a pamäťovú schopnosť s vekom.

Molekulárne dráhy súvisiace s podporou dlhovekosti a kognitívnym zlepšením suplementácie CT

CT(Cistanche Tubulosa)suplementácia potláča AMI a predlžuje životnosť. Preto sme usúdili, že gény súvisiace s AMI a dlhovekosťou by sa mohli určiť vyhodnotením rozdielnej expresie medzi kontrolnou skupinou a skupinami CT s 5,4 a 10,8 mg/ml prostredníctvom qPCR. Zmeny v génovej expresii múch ošetrených CT sa porovnali so zmenami v kontrolnej skupine, ako je znázornené na obr. 6A. Upregulovaná expresia niekoľkých cieľových génov, vrátane Sirt6, Sir2, Sod, p38b a Sirt2, sa môže podieľať na procese starnutia. Hladiny transkriptov S6k, raptor, Psn, Rpd3 a N sa tiež zvýšili, čo naznačuje, že CT(Cistanche Tubulosa)suplementácia mení signálnu transdukciu ich TOR a Notch dráh. Okrem toho suplementácia CT významne ovplyvnila expresiu mRNA Nmdar1, Nmdar2 a SkpA. Na zvýraznenie proteínových interakcií relevantných pre CT, ktoré predlžujú životnosť a zlepšujú učenie a pamäť, bola vytvorená sieť proteínových interakcií založená na literatúre génov skrínovaných qPCR (obr. 6B). Každý uzol predstavuje jeden proteín, pričom každý okraj označuje jednu interakciu založenú na literatúre. Uzly sú zoskupené podľa KEGG dráhy a biologického procesu génovej ontológie (GOBP). Ako je znázornené na obr. 6B, GOBP neuroaktívna interakcia ligand-receptor, ktorá ovplyvňuje učenie a pamäť, a ďalší GOBP starnutia, ktorý koreluje s dĺžkou života, sú obe spojené so signálnou dráhou Notch. Okrem toho je GOBP starnutia ovplyvnený signálnou dráhou mTOR. Význam nadmernej expresie génu indukovanej CT na týchto GOBP a dráhach je opísaný v sekcii Diskusia.

Obr. 6. Sieťová analýza rozdielne exprimovaných génov. Muchy vopred ošetrené 5,4 a 10,8 mg/ml CT(Cistanche Tubulosa)a kontrolné diéty pri 25 stupňoch počas 20 dní sa odobrali na kvantifikáciu diferenciálnej génovej expresie. (A) Relatívne hladiny transkriptov cieľových génov ku kontrolám boli kvantifikované pomocou qPCR. n=4 pre každú skupinu. (B) Upregulované gény zapojené do transdukcie bunkového signálu a ich interakčnej siete. Uzly predstavujú gény. Gény s nadmernou expresiou sú zakrúžkované zelenou farbou. Hrany predstavujú interakcie medzi génovými produktmi. Typy interakcie sú na obrázku označené rôznymi farbami. (Pre interpretáciu odkazov na farbu v tejto legende obrázku sa čitateľ odvoláva na webovú verziu tohto článku.)

Diskusia

Nerovnováha medzi tvorbou a elimináciou voľných radikálov endogénnymi antioxidačnými obrannými systémami môže vekom spôsobiť oxidačné poškodenie tkanív; preto sa špekuluje, že voľné radikály zohrávajú rozhodujúcu úlohu pri starnutí (Dato et al., 2013). Tu sme ukázali, že CT(Cistanche Tubulosa)suplementácia u múch predlžuje životnosť a vedie k vysokej tolerancii voči oxidačnému poškodeniu spôsobenému H2O2 a paraquatom u oboch pohlaví. Štúdie korelovali s CT(Cistanche Tubulosa)andantiaging, sú menej preskúmané, ale extrakty z C. deserticola môžu predĺžiť životnosť u myší so sklonom k ​​starnutiu 8 (SAM-P8) (Zhang et al., 2014) a echinakozid, jedna z hlavných zlúčenín, ktoré existujú v CT , má priaznivé účinky na predĺženie životnosti a toleranciu stresu u C. elegans (Wang et al., 2015).

Nedávne štúdie na zvieratách preukázali, že echinakozid má ochranné účinky proti testikulárnej toxicite vyvolanej bisfenolom A a zvyšuje biosyntézu testosterónu indukciou testikulárnych steroidných enzýmov vrátane CYP11A1, 3 -HSD a CYP17A1 (Jiang et al., 2016). CT(Cistanche Tubulosa)etanolový extrakt tiež podporuje životaschopnosť a kvalitu spermií u potkanov (Wang et al., 2016). Hoci korelácia medzi CT(Cistanche Tubulosa)a estrogén je stále potrebné preskúmať, jedna štúdia uviedla, že echinakozid významne zvyšuje expresiu estrogénových receptorov, podobne ako skupina liečená estradiolom u potkanov po ovariektómii (Li et al., 2013). Pretože reprodukčná kapacita negatívne koreluje s vekom (Kenyon, 2005), skúmali sme, či má CT výhody u starších múch. Reprodukčná zdatnosť ovplyvnená CT(Cistanche Tubulosa)bol pozorovaný iba u samíc, čo naznačuje, že samičky muchy môžu lepšie reagovať na CT(Cistanche Tubulosa)suplementácia. Tieto výsledky odhaľujú, že CT môže mať účinok podobný pohlavnému hormónu a oneskoriť reprodukčnú starnutie v súlade s klinickým používaním CT(Cistanche Tubulosa)na liečbu sexuálnej dysfunkcie u ľudí.

Akteozid môže objasniť ochranné účinky na zníženie apoptózy neurónov a straty pamäte v modeli senescentnej myši indukovanej kombináciou D-galaktózy a AlCl3, čo naznačuje, že CT môže mať potenciál mať neuroprotektívne vlastnosti a vlastnosti na zlepšenie pamäte (Gao et al., 2015; Peng a kol., 2015). Naše údaje ukázali, že tvorba pamäte sa zlepšila u mladých múch doplnených CT. Preto sme posudzovali, či CT(Cistanche Tubulosa)suplementácia je prospešná pre uchovanie pamäti pri starnutí, pretože je známe, že kognitívne funkcie pri normálnom starnutí klesajú. Naše výsledky odhalili, že niekoľko typov AMI, vrátane učenia, 3- a 24-pamäť, možno zlepšiť pomocou CT(Cistanche Tubulosa)suplementácia na 20 dní.Podľa spomínaných výsledkov CT(Cistanche Tubulosa)suplementácia môže mať priaznivé účinky na dlhovekosť a zlepšenie formovania pamäti, ako aj dostatočne oddialiť AMI.

Použitie zvieracích modelov uľahčuje identifikáciu potenciálnych mechanizmov a závislosti od dráhy CT(Cistanche Tubulosa)na spomalenie starnutia mozgu a oddialenie AMI na bunkovej úrovni. Zamerali sme sa na molekulárne mechanizmy, ktoré sú základom starnutia, prenosu neurónov a oxidačného stresu, a usúdili sme, že gény súvisiace s AMI a dlhovekosťou možno identifikovať skúmaním rozdielnej expresie medzi kontrolnými a CT skupinami prostredníctvom qPCR. Signálna dráha Notch je medzi druhmi od Drosophila po ľudí vysoko konzervovaná; v centrálnom nervovom systéme dospelých sa prejavuje neurálnou plasticitou a reguluje neurálnu diferenciáciu spolu so svojím inhibítorom počas vývoja (Presente et al., 2001). Myši nesúce heterozygotnú mutáciu Notch majú nedostatok priestorového učenia a pamäte (Costa et al., 2003). Presenilín (Psn) je potrebný na aktiváciu štiepenia Notch do intracelulárnej domény Notch a knockout Psn spôsobuje zhoršenie synaptickej plasticity a tvorby pamäte (Saura et al., 2004). Naše údaje odhalili od dávky závislú upreguláciu Notch a Psn v CT(Cistanche Tubulosa)doplnené muchy, s nezmenenou úrovňou expresie znecitlivenia, čo naznačuje signálnu dráhu Notch ako silný mechanizmus zlepšenia pamäte pomocou CT suplementácie. Okrem signalizácie Notch, N-metyl-D-aspartátový receptor (NMDAR), glutamátom a D-serínom riadený iónový kanál v neurónoch, riadi synaptickú plasticitu a pamäťovú funkciu (Furukawa et al., 2005). Genóm Drosophila obsahuje dva Podjednotky NMDAR, Nmdar1 a Nmdar2 a obe sú rozhodujúce pre funkciu pamäte. Knockdown Nmdar1 u Drosophila zhoršuje učenie a pamäť (Xia a kol., 2005), zatiaľ čo nadmerná expresia Nmdar2 u myší zlepšuje učenie a pamäť (Tang a kol., 2001). Naše údaje ukázali na dávke závislé zvýšenie upregulácie Nmdar1 a Nmdar2 v muchách doplnených CT, čo naznačuje ďalší potenciálny mechanizmus zlepšenia pamäte pomocou CT(Cistanche Tubulosa)suplementácia.

Trieda O dráhy transkripčného faktora forkhead box (FoxO) je medzi druhmi zachovaná a kritická v metabolizme, tolerancii stresu a predĺžení životnosti (Lehtinen et al., 2006). Posttranslačné modifikácie, vrátane fosforylácie, acetylácie a ubikvitylácie, regulujú aktivitu FoxOs (van der Horst a Burgering, 2007). Tichý informačný regulátor 2 (Sir2; homológ u ​​cicavcov je známy ako SIRT1) reguluje aktivitu FoxO prostredníctvom deacetylácie a ovplyvňuje dĺžku života zvierat súvisiacu s dráhou rastového faktora podobného inzulínu (IGF) (Lemieux et al., 2005). Sirt6 defosforyluje FoxO, aby spôsobil predĺženie života u samcov myší (Kanfi et al., 2012). Naše údaje odhalili upreguláciu Sir2 a Sirt6 v muchách doplnených CT, z čoho vyplýva, že regulácia FoxO pomocou Shirts môže byť účinným mechanizmom predĺženia životnosti pomocou CT.(Cistanche Tubulosa)suplementácia. Voľné radikály produkované počas metabolických procesov poškodzujú DNA a proteíny, čo vedie k skráteniu životnosti. Sir2 je tiež gén reakcie na oxidačný stres (Whitaker et al., 2013) a nadmerne exprimovaná superoxiddismutáza (SOD), ktorá premieňa O2- na H2O2 a nakoniec na H2O pomocou katalázy a glutatiónperoxidázy, predlžuje životnosť múch ( Le Bourg, 2001). Naše údaje odhalili od dávky závislú reguláciu Sod a Sir2 v muchách doplnených CT, čo naznačuje, že antioxidačné dráhy môžu byť silným mechanizmom predĺženia životnosti pomocou CT(Cistanche Tubulosa)suplementácia.

Ďalšia kľúčová cesta starnutia je regulovaná komplexmi mTOR mTORC1 a mTORC2, z ktorých oba podporujú organizáciu evolučným konzervatívnym spôsobom. Signály z inzulínového receptora aktivujú mTORC1 prostredníctvom fosfoinozitid3-kinázy–Akt dráhy na podporu syntézy proteínov a zápalu a na inhibíciu autofágie a glykolýzy pomocou odlišných downstream proteínov (Johnson et al., 2013). Syntéza proteínov je aktivovaná ribozomálnou proteínovou S6 kinázou (S6K), ktorá vytvára negatívnu spätnú väzbu na inhibíciu signalizácie inzulínového receptora (Hands et al., 2009). Inhibičným cieľom mTORC1 je proteín podobný Drosophila (sima), ktorého homológ u ​​cicavcov je známy ako hypoxiou indukovateľný faktor 1 alfa (HIF1). HIF1 hrá ochrannú úlohu proti poškodeniam krvných ciev a motorických neurónov v závislosti od veku (Oosthuyse a kol., 2001; Rivard a kol., 2000). Naše údaje odhalili nezmenenú úroveň expresie komplexných podjednotiek mTOR, vrátane Tor, ricor a raptor, zatiaľ čo CT(Cistanche Tubulosa)suplementácia v závislosti od dávky upregulovala S6K a sima, čo naznačuje aprotektívnu úlohu CT(Cistanche Tubulosa)proti aktivite mTOR.

Závery

Napriek tomu, že boli identifikované niektoré implikované cesty, dlhovekosť a vysoká inteligencia prispeli CT(Cistanche Tubulosa)zásahom môže byť apolygénna črta ovplyvnená súhrou viacerých génov a proces starnutia môžu modulovať aj iné genetické faktory, ktoré sme neobjasnili. Pre starších ľudí by malo byť udržanie požadovanej fyzickej zdatnosti a kognitívnych schopností s cieľom oddialiť alebo zabrániť demencii a chronickým ochoreniam kľúčovým poznatkom zo štúdií o starnutí. Pretože CT(Cistanche Tubulosa), známy ako „ženšen púšte“, má výrazný liečebný účinok na posilnenie jangu obličiek, ktorý vyživuje všetky orgány a dopĺňa životne dôležité esencie v tradičnej čínskej medicíne, veríme, že naša štúdia poskytuje dôkazy podporujúce klinickú liečbu CT(Cistanche Tubulosa)a môže poskytnúť cenný pohľad na vývoj nových liekov alebo prídavných látok v potravinách, ktoré nielen oddialia starnutie a choroby súvisiace s vekom, ale aj zvýšia kvalitu ľudského života.

Konflikt záujmov

Autori vyhlasujú, že nie sú v konflikte záujmov.

Poďakovanie

Túto prácu podporila Čínska lekárska univerzita (CMU103-S-25); Čínska lekárska univerzitná nemocnica (DMR-101-065,DMR-103-099); Ministerstvo vedy a techniky na Taiwane (NSC 102-2632-B-039-001-MY3, MOST 104-2632-B-039-002) ​​a čiastočne Centrum klinických skúšok a výskumov Ministerstva zdravotníctva a sociálnej starostlivosti Taiwanu excelentnosti (MOHW105-TDU-B-212-133019).

Doplnkové materiály

Doplnkový materiál súvisiaci s týmto článkom možno nájsť v online verzii na adrese doi:10.1016/j.phymed.2017.01.006.

Od: „Molekulárne dráhy súvisiace s podporou dlhovekosti a kognitívnym zlepšenímCistanche tubulosain Drosophila' byWei-Yong Lin a kol

--W.-Y. Lin a kol. / Fytomedicína 26 (2017) 37–44

Referencie

Burke, SN, Barnes, CA, 2010. Senescentné synapsie a dynamika hipokampálneho okruhu. Trendy Neurosci. 33, 153-161.

Costa, RM, Honjo, T., Silva, AJ, 2003. Deficity učenia a pamäte u mutantných myší Notch. Curr. Biol. 13, 1348–1354.

Dato, S., Crocco, P., D'Aquila, P., de Rango, F., Bellizzi, D., Rose, G., Passarino, G., 2013. Skúmanie úlohy genetickej variability a životného štýlu v oxidatívnom reakcia na stres pre zdravé starnutie a dlhovekosť. Int. J. Mol. Sci. 14, 16443–16472.

Dubnau, J., Grady, L., Kitamoto, T., Tully, T., 2001. Prerušenie neurotransmisie v tele huby Drosophila blokuje vyhľadávanie, ale nie získavanie pamäte. Príroda 411, 476–480.

Franceschini, A., Szklarczyk, D., Frankild, S., Kuhn, M., Simonovic, M., Roth, A., Lin, J., Minguez, P., Bork, P., von Mering, C. , Jensen, LJ, 2013. STRING v9.1: siete interakcie proteín-proteín so zvýšeným pokrytím a integráciou. Nucleic Acids Res. 41, D808 – D815.

Furukawa, H., Singh, SK, Mancusso, R., Gouaux, E., 2005. Usporiadanie a funkcia podjednotiek v NMDA receptoroch. Príroda 438, 185–192.
Gao, L., Peng, XM, Huo, SX, Liu, XM, Yan, M., 2015. Zlepšenie pamäte akteozidu (verbascozid) v modeli senescentných myší vyvolané kombináciou D-gal a AlCl3. Phytother. Res. 29, 1131-1136.
Guo, Q., Zhou, Y., Wang, CJ, Huang, YM, Lee, YT, Su, MH, Lu, J., 2013. Otvorená, placebom nekontrolovaná štúdia oCistanche tubulosaglykozidové kapsuly (Memoregain((R))) na liečbu stredne ťažkej Alzheimerovej choroby. Am. J. Alzheimer's Dis. Iní Demeni. 28, 363-370.
Hands, SL, Proud, CG, Wyttenbach, A., 2009. Úloha mTOR pri starnutí: syntéza proteínov alebo autofágia? Starnutie (Albany NY) 1, 586–597.
Jiang, Z., Wang, J., Li, X., Zhang, X., 2016. Echinakozid aCistanche tubulosa(Schenk) R. Wight zmierňuje poškodenie semenníkov a spermií vyvolané bisfenolom A u potkanov prostredníctvom steroidogénnych enzýmov regulovaných osou gonád. J. Ethnopharmacol 193, 321–328.
Jiao, X., Sherman, BT, Huang da, W., Stephens, R., Baseler, MW, Lane, HC, Lempicki, RA, 2012. DAVID-WS: stavová webová služba na uľahčenie analýzy zoznamu génov/proteínov. Bioinformatika 28, 1805–1806.
Johnson, SC, Rabinovitch, PS, Kaeberlein, M., 2013. mTOR je kľúčovým modulátorom starnutia a chorôb súvisiacich s vekom. Príroda 493, 338–345.
Kanfi, Y., Naiman, S., Amir, G., Peshti, V., Zinman, G., Nahum, L., Bar-Joseph, Z., Cohen, HY, 2012. Sirtuín SIRT6 reguluje dĺžku života u mužov myši. Príroda 483, 218–221.
Kenyon, C., 2005. Plasticita starnutia: pohľady od dlhovekých mutantov. Bunka 120, 449-460.
Le Bourg, E., 2001. Oxidačný stres, starnutie a dlhovekosť u Drosophila melanogaster. FEBS Lett. 498, 183–186.
Lehtinen, MK, Yuan, Z., Boag, PR, Yang, Y., Villen, J., Becker, EB, DiBacco, S., de la Iglesia, N., Gygi, S., Blackwell, TK, Bonni, A., 2006. Konzervovaná signálna dráha MST-FOXO sprostredkúva reakcie na oxidačný stres a predlžuje životnosť. Cela 125, 987-1001.
Lemieux, ME, Yang, X., Jardine, K., He, X., Jacobsen, KX, Staines, WA, Harper, ME, McBurney, MW, 2005. Sirt1 deacetyláza moduluje signálnu dráhu rastového faktora podobného inzulínu v cicavcov. Mech. Starnutie Dev. 126, 1097-1105.
Li, F., Yang, X., Yang, Y., Guo, C., Zhang, C., Yang, Z., Li, P., 2013. Antiosteoporotická aktivita echinakozidu u potkanov po ovariektómii. Fytomedicína 20, 549–557.
Li, Z., Lin, H., Gu, L., Gao, J., Tzeng, CM, 2016. Herba Cistanche (Rou Cong-Rong): jeden z najlepších farmaceutických darov tradičnej čínskej medicíny. Front Pharmacol. 7, 41.
Lin, S., Ye, S., Huang, J., Tian, ​​Y., Xu, Y., Wu, M., Wang, J., Wu, S., Cai, J., 2013. How do Chinese lieky, ktoré tonizujú obličky, inhibujú apoptózu dopaminergných neurónov? Neural Regen. Res. 8, 2820-2826.

Oosthuyse, B., Moons, L., Storkebaum, E., Beck, H., Nuyens, D., Brusselmans, K., Van Dorpe, J., Hellings, P., Gorselink, M., Heymans, S. , Theilmeier, G., Dewerchin, M., Laudenbach, V., Vermylen, P., Raat, H., Acker, T., Vleminckx, V., Van Den Bosch, L., Cashman, N., Fujisawa, H., Drost, MR, Sciot, R., Bruyninckx, F., Hicklin, DJ, Ince, C., Gressens, P., Lupu, F., Plate, KH, Robberecht, W., Herbert, JM, Collen , D., Carmeliet, P., 2001. Delécia prvku odozvy na hypoxiu v promótore vaskulárneho endotelového rastového faktora spôsobuje degeneráciu motorických neurónov. Nat. Genet. 28, 131-138.

Peng, XM, Gao, L., Huo, SX, Liu, XM, Yan, M., 2015. Mechanizmus vylepšenia pamäte Acteoside (Verbascoside) v modeli Senescent Mouse vyvolaný kombináciou D-gal a AlCl3. Phytother, Res. 29, 1137-1144.
Presente, A., Andres, A., Nye, JS, 2001. Požiadavka Notch v dospelosti na neurologickú funkciu a dlhovekosť. Neuroreport 12, 3321–3325.
Rivard, A., Berthou-Soulie, L., Principe, N., Kearney, M., Curry, C., Branellec, D., Semenza, GL, Isner, JM, 2000. Porucha rastu cievneho endotelu závislá od veku expresia faktora je spojená so zníženou hypoxiou indukovateľnou aktivitou faktora 1. J. Biol. Chem. 275, 29643–29647.
Saura, CA, Choi, SY, Beglopoulos, V., Malkani, S., Zhang, D., Rao, Shankaranarayana, Chattarji, BS, Kelleher, S., 3rd, RJ, Kandel, ER, Duff, K., Kirkwood , A., Shen, J., 2004. Strata funkcie presenilínu spôsobuje poruchy pamäti a synaptickej plasticity, po ktorých nasleduje vekom závislá neurodegenerácia. Neurón 42, 23–36.
Schimanski, LA, Barnes, CA, 2010. Syntéza nervových proteínov počas starnutia: účinky na plasticitu a pamäť. Predné starnutie Neurosci. 2. Seok, J., Kim, TS, Kwon, HJ, Lee, SP, Kang, MH, Kim, BJ, Kim, MN, 2015. ÚčinnosťCistanche Tubulosaa výťažky z Laminaria Japonica (MK-R7) dopĺňajú prevenciu vzorovaného vypadávania vlasov a podporujú zdravie pokožky hlavy. Clin. Nutr. Res. 4, 124-131.
Tang, YP, Wang, H., Feng, R., Kyin, M., Tsien, JZ, 2001. Diferenciálne účinky obohatenia na funkciu učenia a pamäte u transgénnych myší NR2B. Neuropharmacology 41, 779–790.
van der Horst, A, Burgering, BM, 2007. Zdôraznenie úlohy FoxO proteínov v dĺžke života a chorobe. Nat. Mol. Bunka. Biol. 8, 440-450.
Wang, T., Chen, C., Yang, M., Deng, B., Kirby, GM, Zhang, X., 2016.Cistanche tubulosaetanolový extrakt sprostredkováva hladiny potkanieho pohlavného hormónu indukciou testikulárnych steroidgénnych enzýmov. Pharm. Biol. 54, 481-487.
Wang, T., Zhang, X., Xie, W., 2012.Cistanche deserticolaYC Ma, "Púštny ženšen": recenzia. Am. J. Chin. Med. 40, 1123-1141.
Wang, X., Zhang, J., Lu, L., Zhou, L., 2015. Účinok dlhovekosti echinakozidu u Caenorhabditis elegans sprostredkovaný cez daf-16. Biosci. Biotechnol. Biochem. 79, 1676–1683.
Whitaker, R., Faulkner, S., Miyokawa, R., Burhenn, L., Henriksen, M., Wood, JG, Helfand, SL, 2013. Zvýšená expresia Drosophila Sir2 predlžuje životnosť v závislosti od dávky. Starnutie (Albany NY) 5, 682–691.
Wu, ČR, Lin, HC, Su, MH, 2014. Zvrat pomocou vodných extraktovCistanche tubulosaz behaviorálnych deficitov v modeli potkanov podobných Alzheimerovej chorobe: význam pre ukladanie amyloidu a funkciu centrálneho neurotransmitera. Doplnok BMC. Altern. Med. 14, 202.
Xia, S., Miyashita, T., Fu, TF, Lin, WY, Wu, CL, Pyzocha, L., Lin, IR, Saitoe, M., Tully, T., Chiang, AS, 2005. NMDA receptory sprostredkúvajú čuchové učenie a pamäť u Drosophila. Curr. Biol. 15, 603-615.
Zhang, K., Ma, X., He, W., Li, H., Han, S., Jiang, Y., Wu, H., Han, L., Ohno, T., Uotsu, N., Yamaguchi, K., Ma, Z., Tu, P., 2014. Extrakty z Cistanche deserticola môžu antagonizovať imunosenescenciu a predĺžiť životnosť myši s akcelerovanou starnutím
Myši Prone 8 (SAM-P8). Evid. Založený doplnok. Alternatíva. Med. 2014, 601383.
Zhao, Q., Gao, J., Li, W., Cai, D., 2010. Neurotrofické a neurozáchranné účinky echinakozidu v subakútnom MPTP myšom modeli Parkinsonovej choroby. Brain Res. 1346, 224–236.