Naringín a hesperidín pôsobia proti hepatotoxicite vyvolanej diklofenakom u samcov potkanov Wistar prostredníctvom ich antioxidačných, protizápalových a antiapoptotických aktivít, časť 1

Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPre viac informácií

1. Úvod

Nesteroidné protizápalové lieky (NSAID) majú rôzne vedľajšie účinky [1]. Diklofenak, ako jedno z tejto kategórie liekov, je derivát kyseliny fenyloctovej, ktorý sa dlho používa ako analgetikum a protizápalový liek na liečbu určitých stavov [2]. V mechanizme účinku diklofenak inhibuje cyklooxygenázu (COX- )2 enzýmy s väčšou účinnosťou ako pôsobí na COX-1 [3]. Hoci má diklofenak silné terapeutické účinky, jeho trvalé používanie je spojené so závažnými nežiaducimi účinkami závislými od dávky [3]. Zvýšenie voxidačnéstres a supresia antioxidačných obranných systémov boli uvedené v rôznych publikáciách, ktoré sa podieľali na indukcii toxicity a vedľajších účinkov lieku [4,5]. Použitie antioxidantov, ako sú citrusové flavonoidy, v kombinácii s diklofenakom môže pôsobiť proti oxidačnému stresu vyvolanému diklofenakom, a tým môže zabrániť vedľajším účinkom a toxicite lieku.

Ak chcete vedieť viac, kliknite sem

Naringin zodpovedný za kyslú chuť a horkú chuť plodov citrusových plodov má širokospektrálne farmakologické a terapeutické vlastnosti, ako je znižovanie lipidov, protizápalové, lapač voľných radikálov, antioxidačné, antihyperlipidemické,

antiapoptotické a antiaterogénne vlastnosti [6,7. Hesperidín je ďalší flavonoid izolovaný z citrusových druhov, ktorý má niekoľko biologických vlastností, najmä antioxidačné a protizápalové [8]. Bolo hlásené, že hesperidín zlepšil cytochrómom indukované poškodenie pečeňového tkaniva pozorovanéhistopatologickévyšetrenie [9]. Tiež sa zistilo, že hesperidín bol účinný pri potláčanízápala alergických symptómov a pri liečbe alergickej rinitídy[10]. Preto sa táto štúdia uskutočnila s cieľom posúdiť možné preventívne účinky naringínu a hesperidínu na pečeňovú toxicitu vyvolanú diklofenakom a preskúmať úlohu modulácie zápalu, oxidačného stresu a apoptózy v preventívnom účinku.

2. Materiály a metódy

2.1. Chemikálie a súpravy. Diklofenak sodný bol získaný od El-Nasr Pharmaceutical Chemical Company, Egypt.

Naringín a hesperidín boli vyrobené spoločnosťou Sigma-Aldrich Company (St. Louis, MO, USA). Všetky ostatné použité chemikálie sú analytickej kvality a boli získané od miestnych chemických spoločností. Súpravy alanín transaminázy (ALT) a aspartát transaminázy (AST) boli získané od Spinreact, Ctra Sta Coloma, 7.17176 St., Esteve de Bas, Girona, Španielsko. Laktátdehydrogenáza (LDH) a y-glutamyltransferáza (GGT) boli získané od Spectrum, Egyptian Company for Biotechnology, Obour City Industrial Area, Cairo, Egypt. Súprava alkalickej fosfatázy (ALP) bola získaná od Biodiagnostic, 29 Tahrir St., Dokki, Giza, Egypt. Súpravy albumínu a bilirubínu boli získané od Diamond, 24 El Mon-matzah St., Heliopolis, Cairo, Egypt.

Cistanche môže zlepšiť imunitu

2.2.Pokusné zvieratá. V tejto práci boli ako experimentálne zvieratá použité dospelé samce potkanov kmeňa Wistar s hmotnosťou 100-130 g (9-1 l týždňov).

Boli získané z Ani-mal House oftalmologického výskumného ústavu, Gíza, Egypt. Zvieratá boli umiestnené v dobre vetraných klietkach 12 hodín denne v cykloch svetlo-tma a teplote medzi 20 a 25 °C. Potkanom bola denne podávaná štandardná peletovaná strava a voda ad libitum. Zvieratá boli udržiavané dva týždne pod pozorovaním pred začatím experimentu kvôli adaptácii a vylúčeniu akejkoľvek interkurentnej infekcie. Všetky metodiky pre zvieratá sú v súlade s usmerneniami a pokynmi Etického výboru pre experimentálne zvieratá Prírodovedeckej fakulty pre starostlivosť a používanie zvierat, Univerzita Beni Suef, Egypt. Číslo etického schválenia je BSU/FS/2015/15. Všetko úsilie bolo vynaložené na zníženie utrpenia a strachu zvierat.

2.3. Zoskupovanie zvierat. V tomto experimente sa použilo 30 samcov potkanov Wistar a rozdelili sa do piatich skupín (obrázok 1).

Potkany zo skupiny 1 (normálne) dostali ekvivalentný objem fyziologického roztoku (vehikulum, v ktorom bol rozpustený diklofenak) intraperitoneálnou injekciou a tiež dostali ekvivalentný objem 1 percentokarboxymetylcelulóza (CMC; vehikulum, v ktorom boli rozpustené naringín a hesperidín) orálnou sondou denne počas 4 týždňov. Skupine 2 (skupina s injekčným diklofenakom) bol injekčne podaný diklofenak (rozpustený vo fyziologickom roztoku) intraperitoneálnym podaním v dávke 3 mg/kilogram telesnej hmotnosti (kgb. hm.)/deň [11] a bol jej tiež podaný ekvivalentný objem 1 percento CMCby perorálnou sondou denne počas 4 týždňov. Skupine 3 (skupina s injekčným diklofenakom liečená naringínom) bol podávaný diklofenak ako v skupine 2 a bola orálne liečená naringínom (rozpusteným v 1 percente CMC) v dávke 20 mg/kgb. hmotn./deň perorálnou sondou[12] počas 4 týždňov. Skupine 4 (skupina s injekciou diklofenaku liečená hesperidínom) bol podávaný diklofenak ako v skupine 2 a bola perorálne liečená hesperidínom (rozpusteným v 1% CMC) v dávke 20 mg/kg telesnej hmotnosti/deň [13] počas 4. týždňov. Skupina 5 (skupina s injekčným diklofenakom liečená naringínom a hesperidínom) bola doplnená o diklofenak ako v skupine 2 a bola perorálne liečená naringínom ahesperidín(rozpustené v 1% CMC) v dávke 20 mg/kg b. hm./deň počas 4 týždňov.

2.4. Odber vzoriek krvi a pečene.

Na konci experimentu sa potkanom odobrala potrava a vzorky krvi sa odobrali z krčných žíl. Vzorky krvi sa nechali koagulovať pri teplote miestnosti a potom sa centrifugovali pri 3000 ot./min. počas 15 minút. Sérum každej vzorky krvi sa rozdelilo do troch fľaštičiek, ktoré sa uchovávali pri -30 stupni až do použitia na biochemickú analýzu.

Po odobratí vzoriek krvi z jugulárnej žily boli potkany usmrtené a rozrezané. Pečeň každého potkana bola rýchlo vyrezaná a premytá sterilným fyziologickým roztokom ({{0}},9 percent NaCl. Kúsky pečene boli fixované v 10 percentnom neutrálnom pufrovanom formalíne na histologické vyšetrenie. Ostatné časti boli uchovávané v hlbokomraziaci pri -30 stupňoch až do homogenizácie v sterilnom izotonickom fyziologickom roztoku (0,9 % NaCl) na stanovenie oxidačného stresu a markerov antioxidačnej obrany. Tretia časť pečene sa uchovávala pri -30 stupňoch v sterilných Eppendorfových skúmavkách analýza reverznej transkriptázy-polymerázovej reťazovej reakcie (RT-PCR).

2.5. Detekcia parametrov funkcie pečene v sére.

Aktivity ALT a AST sa odhadli pomocou oxidačnej metódy nikotínamid adenín dinukleotid vodíka (NADH) podľa metód Murraya [14] a Murrayho [15], v uvedenom poradí, s použitím reagenčných súprav zakúpených od Spinreact, Španielsko. Stručne povedané, ALT katalyzuje konverziu alanínu na pyruvát, ktorý sa redukuje na laktát pomocou LDH a NADH sa oxiduje na nikotínamid adenín dinukleotid (NAD). Rýchlosť poklesu koncentrácie NADH, meraná fotometricky pri 340 nm, je úmerná katalytickej koncentrácii ALT prítomnej vo vzorke séra. Na druhej strane AST katalyzuje premenu aspartátu na oxalacetát, ktorý sa malátdehydrogenázou (MDH) redukuje na malát a NADH sa oxiduje na NAD. Rýchlosť poklesu koncentrácie NADH, meraná fotometricky pri 340 nm, je úmerná katalytickej koncentrácii AST prítomnej vo vzorke séra. Aktivita LDH v sére sa detegovala podľa metódy Van der Heidena a kol. [16]. Pri tejto metóde LDH katalyzuje reakciu medzi pyruvátom a NADH za vzniku NAD* a L-laktátu. Rýchlosť poklesu koncentrácie NADH, meraná fotometricky pri 340 nm, je úmerná katalytickej koncentrácii LDH prítomnej vo vzorke. Aktivita sérovej ALP bola stanovená podľa metódy Belfielda a Goldberga [17] s použitím súprav získaných od Biodiagnostic, Egypt. Pridaním vzorky séra k fenylfosfátu (5 mmol/l) pri pH 10,

ALP vedie k tvorbe fenolu a fosfátu. Uvoľnený fenol sa meria kolorimetricky pri 510nm v prítomnosti 4-aminofenazónu a ferrikyanidu draselného. Aktivita GGT bola stanovená podľa metódy Szasza a Persijna [18] s použitím súprav získaných od Spectrum Diagnostic, Egyptian Company for Biotechnology, Egypt. GGT prenáša oni-glutamylovú skupinu zo substrátu L- -glutamyl-p-nitroanilid, pričom uvoľňuje chromogén p-nitroanilid (PNA), ktorý sa meria pri 418 nm a jeho tvorba je úmerná aktivite GGT. Hladina sérového albumínu bola stanovená podľa metódy Doumas et al. [19] pomocou reagenčných súprav zakúpených od Diamond, Egypt. Metóda sa v stručnosti uskutočnila pridaním 10 ul séra k 2 ml bro-more sol green (0,12 mmol/l) v citrátovom pufri pH 3,8. albumín/brómkrezolzelený komplex, vytvorený reakciou, bol meraný pri 630 nm. Hladina sérového bilirubínu bola testovaná podľa metód Malloya a Evelyn [20] s použitím reagenčných súprav zakúpených od Diamond, Egypt. Táto metóda na stanovenie bilirubínu je založená na van den Berghovej reakcii. Pri tejto reakcii bilirubín reaguje s diazotovanou kyselinou sulfanilovou za vzniku azobilirubínu, ktorý má purpurovú farbu a bol meraný fotometricky pri 578 nm. Intenzita farby je priamo úmerná množstvu bilirubínu v sére.

2.6. Hodnotenie parametrov pečeňového oxidačného stresu a antioxidačného obranného systému.

Peroxidácia pečeňových lipidov (LPO) bola stanovená podľa metódy Preussa et al. [21]. Stručne povedané, proteín sa vyzrážal pridaním 0,15 ml 76 % kyseliny trichlóroctovej (TCA) do 1 ml pečeňového homogenátu. Potom sa k oddelenému supernatantu pridalo 0 0,35 ml kyseliny tiobarbiturovej (TBA), ako činidlo vyvolávajúce farbu. Vyvolaná slabo ružová farba sa merala pri 532 nm po inkubácii vo vodnom kúpeli pri 80 stupňoch počas 30 minút. Ako štandard sa použil MDA (malóndialdehyd alebo 1,1,3,3-tetrametoxypropán). Znížený obsah glutatiónu (GSH) v pečeni sa stanovil pridaním 0,5 ml 5,5'-ditiobis(2-kyseliny dusičnej), Ellmanovho činidla (ako činidlo vyvolávajúce farbu) a roztoku fosfátového pufra (pH 7 ) na homogenizáciu supernatantu po precipitácii proteínu podľa postupu Beutlera et al. [22]. Vyvolané žlté farby vo vzorkách a GSH štandardoch sa merali pri 412 nm oproti slepému pokusu. GPx aktivita pečene bola meraná podľa postupu Matkovicsa et al.[23] s niektorými úpravami. Táto metóda je založená na detekcii GSH, ktorý sa enzýmom premení na oxidovaný glutatión (GSSG) prostredníctvom detekcie zvyškového GSH a jeho odpočítania od celkového množstva. Stručne, 50 ul supernatantu homogenátu sa pridalo do Wassermanovej skúmavky obsahujúcej 350 ul Tris pufra (pH 7,6), 50 ul roztoku GSH (2 mM) a 50 ul H, O, (3,38 mM). Potom, po 10 minútach inkubácie, sa zmeral zvyškový obsah GSH vyššie opísaným spôsobom na stanovenie GSH pri 430 nm. Štandardný test bol pripravený pridaním 50 μl destilovanej vody namiesto 50 μl vzorky a slepý test bol pripravený pridaním 100 μl destilovanej vody namiesto 50 μl vzorky a 50 μl roztoku GSH. Po detekcii zvyškového obsahu GSH vo vzorke sa GSH premení na oxidovanú formu (GSSG) a možno vypočítať aktivitu enzýmu. Aktivita pečeňovej superoxiddismutázy (SOD) bola detegovaná podľa metódy Marklunda a Marklunda [24]. Reakcia je založená na inhibícii autooxidácie pyrogallolu pomocou SOD. Proces je závislý od prítomnosti superoxidových iónov. Množstvo enzýmu, ktoré spôsobí 50-percentnú inhibíciu zmien extinkcie za 1 minútu v porovnaní s kontrolou, sa považuje za jednu jednotku enzýmu.

2.7. Stanovenie hladín TNF-, IL-17 a IL-4 v sére.

Hladiny TNF-, I-17 a I-4 v sére boli odhadnuté podľa špecifických súprav ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) podľa pokynov výrobcu. Súprava ELISA potkanieho TNF-alfa (katalógové číslo: MBS355371), súprava IL-17 ELISA (katalógové číslo MBS5203506) a súprava IL{8}} ELISA (katalógové číslo: MBS494192) boli získané od spoločnosti MyBioSource, Inc. , San Diego, CA, USA. Tieto súpravy ELISA používajú sendvičovú ELISA. Stručne povedané, doštičky mikro ELISA poskytované v týchto súpravách boli vopred potiahnuté protilátkou špecifickou pre príslušný cytokín. Štandardy alebo vzorky sa pridajú do príslušných jamiek mikro ELISA platne a kombinujú sa so špecifickými protilátkami. Potom sa do každej mikrodoštičky postupne pridá biotinylovaná detekčná protilátka špecifická pre príslušný cytokín a konjugát avidín-chrenová peroxidáza (HRP) a inkubuje sa. Voľné komponenty sa vymyjú. Do každej jamky sa pridá roztok substrátu. Modrú farbu budú mať iba tie jamky, ktoré obsahujú cytokín, biotinylované detekčné protilátky a konjugát avidín-HRP. Reakcia enzým-substrát sa ukončí pridaním roztoku kyseliny sírovej a farba sa zmení na žltú. Optická hustota (OD) sa meria spektrofotometricky pri vlnovej dĺžke 450 nm. Hodnota OD je úmerná koncentrácii testovaného cytokínu a jeho koncentráciu vo vzorkách je možné určiť porovnaním OD vzoriek so štandardnou krivkou.

2.8. Detekcia expresie mRNA p53

2.8.1. Izolácia RNA.

Celková RNA bola izolovaná z pečeňového tkaniva podľa metódy Chomzynski a Sacchi [25] a Boom et al. [26] s použitím súpravy na čistenie RNA Thermo Scientific GeneJET získanej od Thermo Fisher Scientific Inc., Rochester, New York, USA. Stručne, vzorky pečene sa lyzujú a homogenizujú v lyzovacom pufri, ktorý obsahuje guanidíntiokyanát ako chaotropnú soľ a -merkaptoetanol schopný chrániť RNA pred endogénnymi RNázami. Lyzát sa potom zmieša s etanolom a nanesie na čistiacu kolónu. Chaotropná soľ a etanol spôsobujú, že sa RNA naviaže na membránu oxidu kremičitého, zatiaľ čo lyzát sa otáča cez kolónu. Následne sa nečistoty účinne odstránia z membrány premytím kolóny premývacími puframi. Čistá RNA sa potom eluuje za podmienok nízkej iónovej sily vodou bez nukleázy. Hladiny izolovanej RNA sa určili a kvantifikovali použitím ultrafialového (UV) spektrofotometra a meraním absorbancie pri optických hustotách (OD) pri 260nm a 280 nm. RNA sa kvantifikovala a kvalifikovala na základe [27]vzorca Sambrooka a Russella （RNA（ug/μL）=ODat 260 nm × riedenie × 40 ug/ml/1000）. Pre každú extrahovanú vzorku RNA pomer medzi OD pri 260 nm a OD pri 280 nm a pomer v rozsahu medzi 1,7 a 2,0 zaisťuje vysokú čistotu extrahovanej RNA.

2.8.2. Test RT-PCR. Test RT-PCR sa použil pomocou súpravy Thermo Scientific Verso 1-Step RT-PCR Reddy Mix Kit (Thermo Fisher Scientific Inc.,

Rochester, New York, USA) na detekciu mRNA expresie pečeňového p53. Stručne, v jednokrokovej reakcii bola RNA reverzne transkribovaná do cDNA a vytvorená cDNA bola amplifikovaná pomocou Techne 32 Ther-mocykler. Reakčná zmes pozostáva z Veso Enzyme Mix（1μL）, 2X One-Step PCR ReadyMix） (25μL）), zosilňovača RT （25μL）, dopredného priméru （10μM; 1 μl), reverzný primér (10 μM; 1 μ), templátová RNA (1 ng; 1,5 μl) a bez vodnej nukleázy na dokončenie celkového objemu na 50 μl. Program tepelných cyklov zahŕňa syntézu cDNA (teplota 50 stupňov, 15 minút, 1 cyklus), inaktiváciu naopak (teplota 95 stupňov, 2 minúty, 1 cyklus), denaturáciu (teplota 95 stupňov, 20 sekúnd), žíhanie (tepl. 55 stupňov C, 30 sekúnd), predĺženie (teplota 72 stupňov, 1 minúta) a konečné predĺženie (teplota 72 stupňov, 5 minút, 1 cyklus). Počet cyklov denaturácie, po ktorých nasleduje žíhanie a predlžovanie, je 35 cyklov. Po reverznej transkripcii a amplifikácii sa 10 μl produktov PCR analyzovalo na 1,5 percentnom agarózovom géli zafarbenom etídium bromidom v 1 x Tris Borate EDTA pufri (TBE) pH 8.3-8,5. Elektroforetický obraz sa vizualizoval a analyzoval gélovým dokumentačným systémom (GelDocu Advanced) a hodnoty sa normalizovali na množstvo -aktínu. Sekvencie páru primérov p53 boli 5'd CAGCGTGATGATGGTAAGGA 3'(dopredný) a 5'd GCGTTGCTCTGATGGTGA 3'(reverzný) podľa Asiriho [28].

2.9. Histopatologické vyšetrenia. Po usmrtení a disekcii bola pečeň každého potkana rýchlo vyrezaná a potom perfundovaná vo fyziologickom roztoku.

Odobrali sa kúsky pečene každého potkana (3 mm²) a fixovali sa v 10 percentnom neutrálnom pufrovanom formalíne počas 24 hodín. Fixované pečene boli odoslané na oddelenie patológie Fakulty veterinárneho lekárstva Univerzity Beni Suef na ďalšie spracovanie, blokovanie voskom, narezanie a farbenie hematoxylínom a eozínom (H&E)[29]. Zafarbené rezy pečene sa skúmali na detekciu histopatologického skóre. V troch náhodne vybraných poliach každej sekcie (×1{6}}0) boli lézie alebo poranenia hodnotené ako chýbajúce (0), mierne (I), stredne ťažké () a ťažké (II) pre zmeny, 0 percent, menej ako 30 percent , 30-50 percent a viac ako 50 percent [30]. Stupňované lézie zahŕňali hydropickú a vakuolárnu degeneráciu, infiltráciu zápalových buniek, nekrózu, apoptózu, proliferáciu Kupfferových buniek, tukové zmeny a steatózu, upchaté krvné cievy a sínusoidy a hyperpláziu epitelovej výstelky žlčovodu.

2.10. Imunohistochemická detekcia kaspázy-3.

Vzorky pečene zaliate do parafínu boli prenesené na oddelenie patológie, National Cancer Institute, na rezy na rezy s hrúbkou 5 um, ktoré boli pripevnené na sklíčka s kladným nábojom (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Kaspázová-3 reaktivita bola spracovaná podľa metód Galalyho et al.[31] a Ahmed a Ahmed [32]. Stručne povedané, po získaní antigénu sa zriedená primárna protilátka pre kaspázu-3 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) inkubovala s pečeňovými rezmi počas 1 hodiny. Pridala sa zriedená biotinylovaná sekundárna protilátka (DakoCytomation Kit) a inkubácia sa uskutočnila 15 minút pri 37 stupňoch. Potom bola aplikovaná chrenová peroxidáza konjugovaná so streptavidínom (DakoCytomation Kit) na ďalších 15 minút inkubácie. Komplex naviazaných protilátok sa vizualizoval reakciou 3,3'-diaminobenzidín (DAB) substrátu a kontrastným farbením hematoxylínom. Všetky rezy pečene boli inkubované za rovnakých podmienok s rovnakými riedeniami protilátok a v rovnakom období, takže imunofarbenie bolo porovnateľné medzi rôznymi študijnými skupinami. Pre každý prípravok bola vykonaná negatívna kontrola (sklíčko bez primárnej protilátky). Rezy boli vizualizované pod svetelným mikroskopom a bol hodnotený rozsah bunkovej imunopozitivity. Obrázky rezov pečene boli zachytené pomocou digitálneho fotoaparátu (Leica, DM2500M Leica, Wetzlar, Nemecko). Skúmanie a analýza značenia sa uskutočňovali pomocou bezplatnej verzie softvéru ImageJ(1.51d)[33]. Na meranie integrovaných intenzít (v pixeloch) pozitívnej reakcie kaspázy sa použil softvér ImageJ{19}}.

2.11. Štatistická analýza.

Results were represented in tables and graphs as the mean±standarderror(SE). The data were analyzed by LSD analysis to discern the main effects and to compare various groups with each other using PC-STAT, University of Georgia(USA)[34]. Values of p>0.05 sa považovali za štatisticky nevýznamne odlišné, zatiaľ čo hodnoty p<0.05 were="" significantly="" and="" highly="" significantly="">

3. Výsledky

3.1. Účinok na sérové ​​parametre súvisiace s funkciou pečene.

Denná intraperitoneálna injekcia diklofenaku počas 4 týždňov vyvolala významné zvýšenie (p<0.05)in serum="" alt,="" ast,="" ldh,="" alp,="" and="" ggt="" activities="" as="" well="" as="" serum="" total="" bilirubin="" level.="" the="" cotreatment="" of="" diclofenac-injected="" ani-mals="" with="" naringin="" and/or="" hesperidin="" induced="" a="" decrease="" in="" these="" elevated="" levels.="" while="" the="" cotreatment="" of="" diclofenac-injected="" rats="" with="" naringin="" induced="" a="" significant="" decrease=""><0.05)in the="" elevated="" serum="" ast,="" ldh,="" alp,="" ggt,="" and="" total="" bilirubin="" levels,="" it="" produced="" a="" nonsignificant="" effect="" (p="">0.05) v aktivite ALT. Súbežná liečba hesperidínom u zvierat, ktorým bol podaný diklofenak, vyvolala významný účinok (p<0.05)on the="" elevated="" alt,="" ast,="" ldh,="" ggt,="" and="" total="" bilirubin="" levels="" while="" it="" failed="" to="" produce="" a="" significant="" effect="" in="" serum="" alp=""><0.05). the="" cotreatment="" with="" naringin="" and="" hesperidin="" in="" combination="" successfully="" caused="" a="" significant="" decrease=""><0.05)in all="" elevated="" parameters="" related="" to="" liver="" function="" including="" alt,="" ast,="" ldh,="" alp,="" ggt,="" and="" total="" bilirubin="" levels.="" moreover,="" the="" treatment="" with="" the="" combination="" of="" naringin="" and="" hesperidin="" appeared="" to="" be="" the="" most="" effective="" in="" improving="" the="" elevated="" ast,="" alp,="" and="" ggt="" activities(table="" 1).="" serum="" albumin="" level,="" on="" the="" other="" hand,="" exhibited="" a="" nonsignificant="" change="" (p="">0.05) vo všetkých skupinách.

3.2. Účinok na oxidačný stres pečene a antioxidačný obranný systém.

Denná intraperitoneálna injekcia diklofenaku počas 4 týždňov vyvolala významné zvýšenie (p<0.05)in liver="" lpo="" and="" a="" significant=""><0.05) in="" liver="" gsh="" con-tent="" and="" gpx="" and="" sod="" activities.="" the="" treatment="" of="" diclofenac-injected="" animals="" with="" naringin="" and/or="" hesperidin="" induced="" a="" significant=""><0.05)in liver="" lpo.="" narin-gin="" and="" its="" combination="" with="" hesperidin="" were="" more="" potent="" than="" hesperidin="" alone="" in="" decreasing="" the="" elevated="" liver="" lpo="" product.="" while="" the="" treatment="" with="" naringin="" and/or="" hesperidin="" produced="" a="" significant="" increase=""><0.05) in="" liver="" gpx="" and="" sod="" activities,="" only="" naringin,="" and="" hesperidin="" in="" combination="" induced="" a="" significant="" increase=""><0.05) in="" liver="" gsh="" content="" (table="">

3.3. Účinok na expresiu mRNA p53 v pečeni.

Ako je uvedené na obrázku 2, expresia mRNA proapoptotického proteínu p53 sa výrazne zvýšila (str<0.05)in the="" liver="" of="" diclofenac-injected="" rats.="" on="" the="" other="" hand,="" the="" treatment="" with="" naringin,="" hesperidin,="" and="" their="" combination="" produced="" a="" significant=""><0.05)decrease in="" p53="" mrna="" expression="" in="" comparison="" with="" diclofenac-injected="" control.="" there="" is="" no="" significant="" difference="" between="" the="" three="" treatments="" when="" compared="" with="" each="">

3.4. Účinok na hladiny TNF-, IL-17 a-4 v sére. V tabuľke 3 denná intraperitoneálna injekcia diklofenaku počas 4 týždňov vyvolala významný nárast (p<0.05)in serum="" tnf-αand="" il-17="" levels="" and="" a="" significant="" decrease="" in="" serum="" il-4="">

Súbežná liečba naringínom a/alebo hesperidínom u potkanov s injekciou diklofenaku vyvolala významné zlepšenie (p<0.05)of altered="" serum="" tnf-a,="" il-17,="" and="" i-4="" levels.="" the="" treatment="" with="" the="" combination="" of="" both="" flavonoids="" was="" the="" most="" potent="" in="" increasing="" the="" lowered="" il-4level;="" the="" effect="" of="" the="" combination="" was="" more="" significantly="" potent=""><0.05)as compared="" with="" the="" effect="" of="" either="" naringin="" or="">

3.5. Histopatologické nálezy pečene.

Obrázok 3 znázorňuje účinok naringínu a/alebo hesperidínu na histologické zmeny pečene u potkanov s injekciou diklofenaku. Obrázok 3(a) ukazuje pečeň s normálnou histologickou štruktúrou pečeňového lalôčika. Na druhej strane pečeň potkanov s injekciou diklofenaku vykazovala okrem cytoplazmatickej vakuolizácie hepatocytov a fokálnej hepatálnej nekrózy výrazné škodlivé histologické zmeny, ako je hydropická degenerácia hepatocytov, apoptotické bunky a portálna infiltrácia mononukleárnymi bunkami (obrázok 3(b)). spojené s infiltráciou fokálnych zápalových buniek (obrázok 3(c)). Tieto zmeny boli do určitej miery zmenené u potkanov s injekciou diklofenaku liečených naringínom, ktoré vykazovali jedinú tukovú zmenu sporadických hepatocytov (obrázok 3 (d)). Liečba potkanov s injekciou diklofenaku hesperidínom viedla k zlepšeniu histologických zmien pečene v porovnaní s kontrolnou skupinou s injekciou diklofenaku, ale stále vykazovala tukové zmeny sporadických hepatocytov, miernu aktiváciu Kupfferových buniek a prítomnosť niekoľkých apoptotických buniek (obrázok 3(e)). Podobne liečba potkanov s injekciou diklofenaku kombináciou naringínu a hesperidínu zlepšila histologické zmeny pečene v porovnaní s kontrolou s injekciou diklofenaku. Avšak pečeň potkanov s injekciou diklofenaku s kombináciou oboch flavonoidov vykazovala miernu proliferáciu Kupfferových buniek a miernu cytoplazmatickú vakuolizáciu (obrázok 3 (f)). Zdalo sa, že kombinovaný účinok naringínu a hesperidínu bol najsilnejší pri zlepšovaní histologickej architektúry pečene.

Skóre histopatologických zmien všetkých skupín je zaznamenané v tabuľke 4. Sekcia pečene normálnej kontroly vykazovala nulové skóre pre všetky histologické lézie. Potkany s injekciou diklofenaku do pečene vykazovali rôzne stupne skóre histologických lézií v rozsahu od stupňa III po stupeň 0. Podávanie hesperidínu a naringínu potkanom s injekciou diklofenaku viedlo k pozoruhodným zlepšeniam histologických lézií vrátane hydropickej a vakuolárnej degenerácie, infiltrácie zápalových buniek, nekrózy, apoptózy, proliferácie Kupfferových buniek, tukových zmien, steatózy, preťaženia

FcuRE 2: Účinok naringínu, hesperidínu a ich kombinácie na expresiu mRNA p53 v pečeni potkanov, ktorým bol podávaný diklofenak. Prostriedky, ktoré zdieľajú rôzne symboly, sa výrazne líšia na str<0.05. blood="" vessels="" and="" sinusoids,="" and="" hyperplasia="" of="" the="" epithelial="" lining="" of="" the="" bile="" duct;="" thereby,="" the="" liver="" exhibited="" lower="" grades="" of="" histopathological="" change="" scores="" in="" the="" diclofenac-injected="" groups="" treated="" with="" naringin="" and/or="" hesperidin="" in="" comparison="" with="" diclofenac-injected="" control="" rats.="" the="" combinatory="" effect="" of="" naringin="" and="" hesperidin="" was="" the="" most="" potent="" in="" decreasing="" the="" histopathological="" lesion="">

3.6. Imunohistochemický test.

Imunohistochemicky zafarbené rezy pečene sú znázornené na obrázku 4 a výsledky analýzy obrazu sú znázornené na obrázku 5.

Mikrofotografie na obrázku 4 a údaje na obrázku 5 ukázali, že expresia kaspázy-3 bola významne zvýšená u potkanov s injekciou diklofenaku. Liečba potkanov s injekciou diklofenaku naringínom, hesperidínom a ich kombináciou viedla k významnému zníženiu zvýšenej expresie kaspázy-3 v pečeni. Kombinačný účinok naringínu a hesperidínu bol najúčinnejší pri znižovaní zvýšeného obsahu kaspázy-3. Liečba kombináciou normalizovala expresiu pečeňovej kaspázy-3.

Tento článok je prevzatý zo zväzku Oxidative Medicine and Cellular Longevity Volume 2021, ID článku 9990091, 14 strán https://doi.org/10.1155/2021/9990091