Ochranné účinky a mechanizmy prokyanidínov pri Parkinsonovej chorobe in vivo a in vitro 2. časť

Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPre viac informácií

2.7. Účinky PC na oxidačný stres Zebrafish Larae liečených MPTP

Ošetrenie lariev zebrafish PCs znížilo MPTP-indukovanú zvýšenú intracelulárnu tvorbu ROS (obrázok 7a, b). Okrem toho výsledky testu peroxidácie lipidov ukázali, že expozícia PC （16 ug/ml） blokovala hladiny MDA indukované MPTP u lariev zebričiek (obrázok 7c). Okrem toho MPTP-indukované zníženie aktivity GSH-Px bolo zvrátené liečbou PC (16 ug/ml) (obrázok 7d) a PC (4, 8 a 16 ug/ml) zvýšilo MPTP-indukované zníženie CAT a SOD aktivita (obrázok 7e, f).

Figure 7. Effects of PCs on oxidative stress of zebrafish larvae treated with MPTP. (a)ROS levels were measured by fluorescent microscopy and imaging analysis;(b)ROS levels were measured via imageJ software;(c) MDA levels;(d) GSH-Pxactivity;(e)CATactivity;(f) SOD activity. F and p values of the one-way analysis of variance are presented above each chart.The results of Tukey's post hoc test are presented for selected comparisons: ns, p>0.05;*,p<><0.01;***, p=""><0.001; the="" error="" bars="" are="">

Ak sa chcete dozvedieť viac, kliknite sem

2.8. Účinky PC na Nr2/ARE Patlhroay u zebrafish Laroa indukovanej MPTP

Ošetrenie lariev zebrafish pomocou PC zdôraznilo predpoklad, že aktivácia dráh Nr2 / ARE sa podieľala na ochranných vlastnostiach sprostredkovaných PC. Expresia markerov Nrf2, HO-1, NQO1, GCLC a GCLM bola zvýšená pri liečbe PC v porovnaní so samotnou expozíciou MPTP (obrázok 8a-e).

Figure 8. Effects of PCs on Nrf2/ARE pathway in MPTP-induced zebrafish larvae. (a) Nrf2 levels;(b)HO-1 levels;(c)NQO1 levels;(d) GCLClevels;(e) GCLM levels. F and p values of the one-way analysis of variance are presented above each chart. The results of Tukey's post hoc test are presented for selected comparisons: ns,p>0.05;*,p<><><0.001:the error="" bars="" are="">

3. Diskusia

PC vykazujú silné schopnosti zachytávať radikály a antioxidačnú aktivitu a oxidačný stres, spôsobený nadmernou tvorbou ROS alebo/alebo narušeným antioxidačným obranným systémom, hrá rozhodujúcu úlohu pri PD[37-39]. Či však PC môžu hrať neuroprotektívnu úlohu prostredníctvom antioxidačných účinkov, zostáva nejasné. Cieľom tohto výskumu bolo preskúmať molekulárny mechanizmus PC proti modelom PD indukovanej MPP plus / MPTP.

Cistanche môže zlepšiť imunitu

V tejto štúdii v porovnaní so skupinou MPP plus/MPTP-samotné PC výrazne zvýšili hladinu aktivity antioxidačných enzýmov (vrátane GSH-Px, CAT a SOD) a znížili hladiny ROS a MDA. Súčasné zistenia sú v súlade s predchádzajúcou štúdiou, ktorá naznačuje, že doplnok s nízkym obsahom PC prostredníctvom stravy zlepšuje aktivity GSH-Px, CAT a SOD u odstavených prasiatok [40]. Ďalšia štúdia tiež naznačuje, že PC významne zvyšujú aktivity CAT a SOD a znižujú obsah MDA, čím zlepšujú kvalitu kozích spermií[41]. Tieto zistenia naznačujú, že PC majú ochranný účinok na oxidačné poškodenie nervových buniek. Okrem toho PC zlepšili životaschopnosť buniek v porovnaní so skupinou MPP plus-osamot v MPP plus-indukovaných bunkách PC12, výrazne zvýšili celkovú presunutú vzdialenosť a znížili hustotu buniek TH plus v porovnaní so skupinou MPTP u lariev zebričiek indukovaných MPTP. Tieto údaje naznačujú, že PC majú ochranný účinok na nervové bunky.

Ďalej sme pozorovali, že PC významne zvýšili akumuláciu jadrového Nrf2 v porovnaní s akumuláciou samotného MPP plus v bunkách PC12. V skutočnosti PC výrazne zvýšili hladiny expresie NQO1, HO-1, GCLM a GCLC[42]. Okrem toho sa umlčanie génu Nfr2 prostredníctvom siRNA Nrf2 použilo na skúmanie úlohy aktivácie Nrf2/ARE v neuroprotekcii sprostredkovanej PC proti oxidačnému poškodeniu indukovanému MPP plus: bunky transfekované Nrf{10}}siRNA indikovali výrazné zníženie expresie Nrf2. Táto súčasná štúdia tiež zistila, že knockout Nrf2 zrušil ochranu sprostredkovanú PC proti poškodeniam životaschopnosti buniek liečených MPP plus a antioxidačným účinkom PC. Tieto výsledky sú v súlade s predchádzajúcou štúdiou naznačujúcou, že zlepšenie aktivácie dráhy Nrf2/ARE prispieva k neuroprotekcii [43].

Dráha Nrf2/ARE je významnou antioxidačnou dráhou [44-46]. Normálne sa Nrf2 nachádza v cytoplazme, kde sa viaže na inhibičný proteín Keapl [47,48]. Keď bunky podliehajú oxidačnému stresu, Nrf2 sa disociuje z Keap1, iniciuje endogénny antioxidačný obranný systém a následne sa translokuje do jadra [46,49,50]. Potom interaguje s ARE a aktivuje sériu bunkových ochranných a antioxidačných génov vrátane GCLC, GCLM, NQO1 a HO-1 [51-54]. V reakcii na oxidačný stres sa Nrf2 disociuje z Keap1 v cytosóle a potom sa translokuje do jadra, pričom sa viaže na sekvenciu ARE, aby sa aktivovala transkripcia kryoprotektívnych génov [53-58]. Súčasné výsledky naznačujú, že PC môžu aktivovať dráhu Nrf2/ARE, prenášať Nrf2 z cytoplazmy do jadra, akumulovať sa v jadre, regulovať expresiu GCLC, GCLM, NOO1 a HO-1 a zlepšiť schopnosť bunky odolávajú oxidačnému stresu. Dráha Nrf2/ARE môže skutočne predstavovať farmakologický cieľ PC na prevenciu PD.

4. Materiály a metódy

4.1. Chemické zlúčeniny a činidlá

Agensy MPP plus a MPTP boli zakúpené od spoločnosti Sigma (St. Louis, MO, USA) a súprava na počítanie buniek-8 bola získaná od spoločnosti Beyotime (Shanghai, Čína). Diagnostické súpravy PCs,2',7/-dichlórfluorescín diacetát, MDA, GSH-Px, SOD a CAT boli všetky získané od Solarbio (Peking, Čína). RNAiso Plus, PrimeScriptTMRT Reagent Kit s gDNA Eraser a SYBRPremix Ex TaqTMⅡI boli zakúpené od Takara (Shiga, Japonsko); Nrf2-siRNA, kontrolná siRNA a Lipofectamine 2000 boli získané od GenePharma (Shanghai, Čína). Nakoniec boli primárne protilátky Nrf2, HO-1, GCLC, GCLM, NAD(P)H: NQO1, Lamin B, GAPDH, antityrozínhydroxyláza (TH) a zodpovedajúce sekundárne protilátky získané od spoločnosti Proteintech (Wuhan, Čína ).

4.2. Bunková kultúra

Bunky PC12 boli získané z National Collection of Authenticated Cell Cultures. Bunky sa udržiavali v DMEM doplnenom 10 percentným fetálnym hovädzím sérom a penicilín-streptomycínom (100 U/ml; 100 ug/ml) v inkubátore s vlhkou atmosférou pri 37 stupňoch s 5 percentami CO2 [59].

4.3. Test bunkovej životaschopnosti

Bunky PC12 (1 x 104 buniek/jamka) sa inkubovali s 1,2 alebo 4 ug/ml PCsor deprenvl （30 μM） počas 24 hodín a potom sa inkubovali s 1,5 mM MPP plus počas 24 hodín. Potom sa do každej jamky pridalo 10 μl roztoku Cell Counting Kit{12}} a inkubovalo sa 1 hodinu. Absorbancia sa merala pri 450 nm [60].

4.4. Údržba rýb

Etický súhlas na použitie na zvieratách udelil výbor pre ochranu a používanie zvierat Centra pre experimentálne zvieratá, Univerzita Zhejiang (ZJU20200125). Dospelé zebričky (kmeň AB) boli získané z laboratórneho zvieracieho centra Zhejiang University (Hang Zhou, Čína) a udržiavané pri 28 ± 1 stupni v cykloch 14 hodín svetlo/10 hodín tma. Ryby boli kŕmené Artemia nauplii dvakrát denne [61]. Na produkciu embryí sa dospelé zebričky umiestnili cez noc do chovných nádrží v pomere samec: samica 1:1. Trenie bolo spustené po zapnutí svetiel nasledujúce ráno a dokončené za 2 hodiny. Embryá boli pestované vo vode embryí (13,7 mM NaCl, 540 μM KCl, 25 μM Na2HPOA44 uM KHPOA, 300 μM CaCl2, 100 μM MgSO, 420 μM NaHC03, pH 7,4） pri 23 66 stupňoch.

4.5. Meranie ROS

Na meranie produkcie ROS boli bunky PC12 (2×104 bunky/jamka) vystavené 1,2 alebo 4 ug/ml PC alebo deprenylu （30 μM） počas 24 hodín a potom inkubované s 1,5 mM MPPt počas 24 hodín 【64】. Bunky boli vystavené 10 uM roztoku 2',7'-dichlórfluorescín diacetátu v tmavých podmienkach počas 30 minút; roztok farbiva sa potom odstránil a bunky sa trikrát premyli fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom (PBS). Obrázky buniek boli pozorované pomocou laserového skenovacieho konfokálneho mikroskopu Olympus (Olympus, hlavné mesto Tokio, Japonsko). Intenzita fluorescencie buniek bola kvantifikovaná pomocou softvéru Image J v1.8.0 (Olympus, hlavné mesto Tokia, Japonsko). Výsledky sú vyjadrené ako percento plochy oblastí ROS v kontrolnej skupine.

Na meranie produkcie ROS boli larvy zebrafish 3 dni po oplodnení (dpf) vystavené deprenylu (40 μM) alebo 4, 8 alebo 16 ug / ml PC s alebo bez 400 μM MPTP počas 4 dní. Larvy zebrafish pri 7 dpf boli prenesené na 24-jamkovú platňu (10 lariev na skupinu), ošetrené 20 μM roztokom 2',7'-dichlórfluorescín diacetátu a inkubované 60 minút v tme pri 28,5 stupňoch [65 ]. Larvy sa potom trikrát premyli embryonálnym médiom, aby sa odstránil nadbytok 2',7'-dichlórfluorescín diacetátu. Obrazy zafarbených lariev boli pozorované pomocou laserového skenovacieho konfokálneho mikroskopu Olympus. Intenzita fluorescencie jednotlivých lariev bola kvantifikovaná pomocou softvéru Image J. Výsledky sú vyjadrené ako percento plochy oblastí ROS v kontrolnej skupine. 4.6. Hodnotenie MDA, GSH-Px, SOD a CAT

Bunky PC12 (2 x 104 buniek/jamka) boli vystavené 1, 2 alebo 4 ug/ml PC alebo deprenylu (30 μM) počas 24 hodín a potom inkubované s 1,5 mM MPP plus počas 24 hodín. Potom sa k bunkám s veľkosťou 4 x 10 stupňov pridal 1 ml extraktu a bunky sa rozbili ultrazvukovým odstreďovaním pri 8000 ot./min. pri 4 stupňoch počas 10 minút. Supernatant sa potom dal na ľad na testovanie a pridali sa činidlá na stanovenie MDA, GSH-Px, SOD a CAT. Každý index sa opakoval trikrát.

Larvy zebrafish v 3dpf boli inkubované s deprenylom（40 μM） alebo 4,8 alebo 16 ug/ml PC s alebo bez 40 0 μM MPTP počas 4 dní. Potom sa 0,05 g tkaniva lariev zebrafish a 0,5 ml extraktu homogenizovalo v ľadovom kúpeli a potom sa centrifugovalo pri 4 stupňoch počas 10 minút. Supernatant sa umiestnil na ľad na testovanie. Následne sa pridali činidlá na stanovenie MDA, GSH-Px, SOD a CAT. Každý index sa opakoval trikrát.

4.7. Príprava celobunkového, cytoplazmatického a jadrového proteínu

Na extrakciu celobunkového proteínu sa bunky zhromaždili a inkubovali sa s RIPA lyzačným pufrom obsahujúcim 1 % PMSF a 1 % koktail inhibítora proteázy počas 30 minút na ľade. Bunkové lyzáty sa centrifugovali a supernatant sa zozbieral a uskladnil. Na prípravu subcelulárnej frakcionácie boli vzorky buniek spracované pomocou súpravy na extrakciu jadrových a cytoplazmatických proteínov. Obsah proteínu bol testovaný pomocou testu BCA (Beyotime, Shanghai, China).

4.8. Transfekcia Nrf2 siRNA

Nrf2-siRNA bola použitá na potlačenie Nrf2. Bunky PC12 boli transfekované Nrf2-siRNA (80 nM) alebo kontrolná siRNA s použitím Lipofectamine 2000, podľa manuálu. 4.9. Western blotovanie

Vzorky proteínov boli rozdelené pomocou SDS-PAGE a prenesené na polyvinylidéndifluoridové (PVDF) membrány. Bloty boli vystavené príslušným primárnym protilátkam: Nrf2, Keap1, HO-1, NQ01, GCLC, GCLM, Lamin B, GAPDH a sekundárnym protilátkam konjugovaným s peroxidázou. Proteínové pásy boli vizualizované pomocou ECL (Beyotime, Shanghai, Čína) plus detekčných činidiel Western blotting [36,43].

4.10. Lokomočný behaviorálny test

Larvy zebrafish pri 3dpf boli inkubované s deprenylom (40 μM) alebo 4, 8 alebo 16 ug / ml PC s alebo bez 400 uM MPTP počas 4 dní. Zebrafish 7 dpf sa potom umiestnil do 24-jamkových platní (1 ryba na jamku a 12 lariev na skupinu) a zaznamenala sa celková vzdialenosť, ktorú každá ryba preplávala počas 10 minút. Správanie zebrafish sa monitorovalo a analyzovalo pomocou automatizovaného video sledovacieho systému (Any-bludisko 4.73, Stoelting, Wood Dale, IL, USA)[66].

4.11. Celková extrakcia RNA, reverzná transkripcia a kvantitatívna polymerázová reťazová reakcia v reálnom čase

RNA bola extrahovaná pomocou RNAiso Plus podľa pokynov výrobcu. RNA bola reverzne transkribovaná pomocou reagenčnej súpravy PrimeScriptTMRT s gDNA Eraser podľa pokynov výrobcu. Kvantitatívna PCR analýza v reálnom čase sa uskutočnila na systéme Applied Biosystems ViATM 7 Real-Time PCR s použitím SYBRPremix Ex TaqTM II (Takara, Shiga, Japonsko). -aktín sa použil ako referenčný gén a relatívna génová expresia sa vypočítala pomocou 2-△Ct metódy. Primérové ​​sekvencie použité vo výskume sú uvedené v tabuľke 1.

4.12. Celoplošné imunofarbenie antityrozínhydroxylázou (TH) zebrafish

Larvy zebrafish pri 1 dpf boli inkubované s deprenylom （40 μM） alebo 4,8 alebo 16 ug/ml PC s alebo bez 400 uM MPTP počas 2 dní (10 rýb/skupina šarží). Larvy boli fixované 4 percentami paraformaldehydu v PBS počas 30 minút. Po fixácii boli liečení na imunofarbenie TH v celom rozsahu [67]. Pri izbovej teplote boli 2 percentá (v/o) jahňacieho séra a 0,1 percenta (w/ø) hovädzieho sérového albumínu (BSA) blokované vo fosfátom pufrovanom fyziologickom roztoku Tween-20 (PBST) počas 1 hodiny. Potom boli vystavené v blokovacom pufri pôsobeniu antityrozínhydroxylázová protilátka (1:200 zriedená, Proteintech) počas 2 hodín a potom 6-krát premytá PBST. Konečný krok imunofarbenia celého súboru sa uskutočnil vo farbiacom pufri s 488 kozím antikrálikom (1:500) počas 1 hodiny a znova sa premyl PBST. Po dostatočnom sfarbení boli zebričky naplocho nasadené s 3,5 percentamimetylcelulózaa zobrazené pomocou laserového skenovacieho konfokálneho mikroskopu Olympus.

4.13. Štatistická analýza

Na porovnanie priemerov rôznych skupín sa použila jednosmerná analýza rozptylu (ANOVA), po ktorej nasledoval Tukeyho viacnásobný porovnávací test. Na štatistickú analýzu a vykreslenie grafov sa použil Graphpad Prism v6.01 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).

5. Závery

Na záver, naše zistenia naznačujú, že PC majú neuroprotektívne účinky prostredníctvom aktivácie dráhy Nrf2/ARE a jej downstreamdetoxikáciaaantioxidant enzýmy. Celkovo tieto poznatky naznačujú, že PC môžu byť užitočné na liečbu PD.

Tento článok je extrahovaný z Molecules 2021, 26, 5558. https://doi.org/10.3390/molecules26185558 https://www.mdpi.com/journal/molecules