Neuroprotektívny účinok extraktu Bu-Shen-Huo-Xue proti apoptóze vyvolanej vysokou glukózou v bunkách PC12

Pre viac informácií:ali.ma@wecistanche.com

Shao-Yang Zhao, Xin Dong, Peng-Fei Tu, Ke-Wu Zeng, Xue-Mei Wang

1Výskumné štúdio integrácie tradičnej a západnej medicíny, Prvá nemocnica, Pekingská univerzita, Peking, Čína.

2 Štátne kľúčové laboratórium prírodných a biomimetických liečiv, Fakulta farmaceutických vied, Pekingská univerzita, Peking, Čína.

Zvýraznenie

Neurotoxicita vyvolaná vysokou glukózou (HG) sa podieľa na patológiidiabetikencefalopatia (DE). V našej štúdii extrakt Bu-Shen-Huo-Xue (BSHX), polybylinný vzorec, vykazujeneuroprotektívneaktivita na HG-indukovaných bunkách PC12 a možné mechanizmy môžu byť spojené s potlačením tvorby reaktívnych foriem kyslíka (ROS), ako aj mitochondrií sprostredkovaných kaspázových a JNK/p38 MAPK signálnych dráh. Táto štúdia poskytuje sľubný prostriedok na liečbu DE v klinických aplikáciách.

Kliknutím zobrazíte výhody extraktu cistanche a cistanche pre obličky

Cistancheje známa tonizujúca bylina, ktorá dokáže vyživovať a chrániťobličky. V teórii tradičnej čínskej medicínyCistancheje najlepšia bylinka naobličky.Cistancheje bohatý na echinakozid, akteozid a flavonoidy.Tieto účinné zložky vCistanchemôže znížiťobličkyapoptóza buniek a zvýšenieobličkybunkovej proliferácie. pretoCistancheje aprírodný doplnok obličiek.

Abstraktné

Cieľ: Skúmať neuroprotektívny účinok extraktu Bu-Shen-Huo-Xue (BSHX), polybylinnej receptúry, proti neurotoxicite vyvolanej vysokou glukózou (HG) v bunkách PC12. Metódy: Uskutočnil sa test bunkovej životaschopnosti, test laktátdehydrogenázy (LDH), detekcia reaktívnych druhov kyslíka (ROS), Hoechst 33258, dvojité farbenie akridínová oranž (AO)/etídiumbromid (EB) a test mitochondriálneho membránového potenciálu (MMP). Okrem toho sa pomocou Western blotu detegovali Bax, Bcl-2, kaspáza-3, štiepená kaspáza-3, PARP, štiepená PARP, cytochróm c a mitogénom aktivované proteínkinázy (MAPK). Výsledky: Extrakt BSHX zvýšil životaschopnosť buniek a znížil únik LDH spôsobom závislým od koncentrácie v bunkách PC12 indukovaných HG. Okrem toho extrakt BSHX znížil hladinu intracelulárneho ROS, zvýšil potenciál mitochondriálnej membrány, reguloval expresiu Bax a Bcl-2 a inhiboval uvoľňovanie cytochrómu c z mitochondrií. Okrem toho extrakt BSHX zoslabil aktiváciu kaspázy-3 a PARP a inhiboval fosforyláciu c-Jun N-terminálnej kinázy (JNK) a p38 MAPK. Záver: Extrakt BSHX vykazoval významný neuroprotektívny účinok na apoptózu indukovanú HG v bunkách PC12. Tento účinok môže byť spojený so supresiou tvorby ROS, ako aj mitochondriami sprostredkovaných kaspázových a JNK/p38 MAPK signálnych dráh.

Kľúčové slová:diabetická encefalopatia, tradičná čínska medicína, extrakt Bu-Shen-Huo-Xue,neuroprotektívne, vysoká hladina glukózy

Skratka: AO: akridínová oranž; BSHX: Bu-Shen-Huo-Xue; DE: Diabetická encefalopatia; DM: Diabetes Mellitus; DMSO: dimetylsulfoxid; EB: etídiumbromid; ERK: extracelulárne regulované proteínové kinázy; HG: Vysoká hladina glukózy; JNK: c-Jun N-terminálna kináza; LDH: laktátdehydrogenáza; MAPK: mitogénom aktivované proteínkinázy; MWP: predpis Wu-Zi-Yan-Zong; MTT: 3-[4, 5-dimetyltiazol-2-yl] 2, 5-difenyltetrazóliumbromid; PBS: fyziologický roztok s fosfátovým pufrom; PBST: fosfátom pufrovaný fyziologický roztok, 0,1 percenta Tween 20; ROS: druhy reaktívneho kyslíka; T2DM: diabetes mellitus 2. typu; TČM: Tradičná čínska medicína

Pozadie

V posledných rokoch sa širokej pozornosti venuje diabetickej encefalopatii (DE), komplikácii diabetes mellitus (DM), ktorá sa vyskytuje v centrálnom nervovom systéme (CNS). DE môže súvisieť s niekoľkými rizikovými faktormi, ako je vek, trvanie a glykemická kontrola diabetu [1, 2]. Klinickými prejavmi DE sú morfologické a fyziologické zmeny v mozgu a výsledná kognitívna dysfunkcia. Hyperglykémia, oxidačný stres a chronický zápal môžu byť dôležitými patogénnymi príčinami DE [3]. Hoci narastajúci počet experimentov ukázal, že dlhodobá pretrvávajúca hyperglykémia môže urýchliť starnutie mozgu, presná patogenéza DE nie je preskúmaná.

Apoptóza je programovaná bunková smrť riadená génmi na udržanie stability mikroprostredia. Proteíny zapojené do apoptózy zahŕňajú rodinu Bcl{0}}, kaspázy, p53 atď. Rodina Bcl{2}} je rozdelená do dvoch kategórií, jedna podporuje bunkovú smrť, ako je Bax, a druhá odoláva apoptóze, ako napríklad Bcl-2. Môžu regulovať apoptózu prostredníctvom kaspázovej signálnej dráhy, čo je kaskádová amplifikačná reakcia ireverzibilného konečného hydrolyzačného substrátu kaspázy [4-6]. Štúdie navyše ukázali, že apoptóza vyvolaná vysokou glukózou (HG) je spojená s mitochondriálnou dysfunkciou, poškodením DNA a nadmernou produkciou reaktívnych druhov kyslíka (ROS) [7]. Štúdia na diabetických myšiach ukázala, že adenozín 5'-monofosfátom (AMP)-aktivovaná proteínkináza (AMPK), intracelulárny energetický a stresový receptor, môže inhibovať apoptózu sprostredkovanú ROS. Okrem toho čoraz viac dôkazov preukázalo, že inhibícia mitogénom aktivovaných proteínkináz (MAPK) by mohla byť prospešná pre inhibíciu apoptózy neurónov. Ďalšia správa ukázala, že c-Jun N-terminálna kináza (JNK), extracelulárne regulované proteínkinázy (ERK), signálne dráhy p38 MAPK môžu potenciálne regulovať apoptózu neurónov [8,9].

Na základe teórie tradičnej čínskej medicíny,obličkynedostatok esencie a stáza krvi sa považujú za základnú patogenézu DE. Preto stratégia výživyobličkya aktivujúca krv sa bežne používa v klinických aplikáciách pre DE. Predchádzajúce štúdie mohli potvrdiť, že upravený predpis Wu-Zi-Yan-Zong (MWP), predpis zameraný na výživuobličkymôže zlepšiť kognitívne poškodenie a chrániť neuróny znížením toxicity A [10, 11]. Predpis Bu-Shen-Huo-Xue (BSHX), do ktorého sa pijavica pridáva na základe MWP, je špeciálne formulovaný tak, abyživiťobličkya aktivovať krv. Nedávne štúdie ukázali, že predpisovanie BSHX môže zlepšiť syndróm zhoršenia pamäti pacientov s DM, čo naznačuje silné neuroprotektívne vlastnosti [12]. Podrobný farmakologický mechanizmus pre BSHX však zostáva nejasný. V tejto štúdii sa zameriavame na pozorovanie ochranného účinku extraktu BSHX na bunky PC12 indukované HG a skúmanie potenciálnych molekulárnych mechanizmov.

Metódy

Materiály a činidlá

Všetky bylinky boli zakúpené od Kang Ren Tang Chinese Medicine Co., Ltd. (Peking, Čína) a overené Dr. PF Tu, farmakognozistom, podľa Čínskeho liekopisu (The Pharmacopoeia Commission of PRC, 2010). 3- [4, 5-dimetyltiazol-2-yl] 2, 5-difenyltetrazólium bromid (MTT) bol od Sigma Chemical Co. (Saint Louis, MO, USA). Testovacia súprava laktátdehydrogenázy (LDH) bola zakúpená od Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute. (Nanjing, Jiangsu, Čína). Súprava na dvojité farbenie akridínová oranž (AO)/etídiumbromid (EB) a Hoechst 33258 boli získané od Solar Co., Ltd. (Peking, Čína). Súprava na test mitochondriálneho membránového potenciálu s JC-1,2,7-dichlórfluoresceín diacetátom (DCFH-DA) bola zakúpená od Beyotime Institute of Biotechnology (Shanghai, Čína). Primárne protilátky pre kaspázu-3, štiepenú kaspázu-3, PARP, štiepenú PARP, cytochróm C, Bax, Bcl-2, p38, p-p38, ERK, p-ERK, JNK, p -JNK a -tubulín boli získané od Cell signaling Technology (Boston, MA, USA).

Príprava extraktu BSHX

BSHX pozostáva zo siedmich liečivých zložiek (tabuľka 1). Na prípravu extraktu BSHX Tsizi (Cuscuta Chinensis Lam.), Gouqi (Lycium barbarum L.), Fupenzi (Rubus chingii Hu), Wuweizi (Schizandra Chinensis (Turcz.) Baill.), Cheqiancao (Plantago Asiatica L.), Shuizhi ( Hirudo nipponica Whitman.) a Yinyanghuo (Epimedium brevican Maxim.) boli zmiešané v pomere 8:8:4:1:2:1:8 a ponorené do celkového objemu 10-krát (v/w) destilovanej vody na 30 minút. , potom sa varí 1 hodinu a znova sa varí 1 hodinu v celkovom objeme 5-krát (v/w) destilovanej vody. Supernatanty sa spojili a vysušili lyofilizáciou. Konečný sušený extrakt predstavoval 25 percent (w/w) hmotnosti surových bylín a exemplár poukážky bol uložený v Modernom výskumnom centre pre tradičnú čínsku medicínu, Peking University Health Science Center, Peking, Čína.

Bunková kultúra

Potkanie feochromocytómové bunkové línie (PC12 bunky) boli získané z Peking Union Medical College Cell Bank (Peking, Čína) a pestované v Dulbeccovom modifikovanom Eagle médiu (DMEM) (Macgene, Peking, Čína) doplnenom 10 percentným fetálnym hovädzím sérom (Biowest, Francúzsko ) a 1 percento penicilín-streptomycínu (100x, Macgene, Peking, Čína) vo zvlhčenom inkubátore obsahujúcom 95 percent vzduchu a 5 percent CO2 pri 37 stupňoch.

Vzorová liečba

V predbežnom teste boli bunky PC12 ošetrené samotným extraktom BSHX (20, 50, 100 mg/l) počas 48 hodín, aby sa vyhodnotila cytotoxicita. Na analýzu neuroprotektívneho účinku extraktu BSHX proti neurotoxicite vyvolanej vysokou glukózou (HG) sa bunky PC12 spoločne ošetrili extraktom BSHX (20, 50, 100 mg/l) a HG (75 mM) počas 48 hodín, po čom nasledoval test MTT pre životaschopnosť buniek. Všetky ostatné testy sa uskutočnili za rovnakých podmienok s rozsahom koncentrácie extraktu BSHX od 20 do 100 mg/l.

Test životaschopnosti buniek

Bunky PC12 sa naočkovali do 96-jamkových doštičiek v hustote 3,5 x 103 buniek na jamku. Po inkubácii s extraktom BSHX (s alebo bez HG) počas 48 hodín sa supernatant odstránil a pridal sa roztok MTT (0,5 mg/ml). Po inkubácii pri 37 stupňoch počas 4 hodín sa roztok MTT odstránil a bunky sa rozpustili v dimetylsulfoxide (DMSO) na trepanie počas 5 minút. Optická hustota (OD) sa merala pri 570 nm pomocou čítačky mikrodoštičiek. Životaschopnosť buniek ( percentá )=[OD (liečba) – OD (slepé)]/ [OD (neliečená kontrola) – OD (slepé)] × 100 percent.

LDH test

Bunky PC12 sa kultivovali a stimulovali na ošetrenie extraktom HG a BSHX, ako bolo opísané vyššie. Potom sa LDH uvoľnený z buniek detegoval pomocou komerčnej súpravy LDH podľa pokynov výrobcu. Absorbancia sa merala pri 45 0 nm. LDH (U/L)=[OD (liečba) – OD (slepé)] / [OD (štandardné) – OD (slepé)] × 0,2 (mmol/l) × 1000.

Farbenie Hoechst 33258 a farbenie AO/EB

Na farbenie Hoechst 33258 boli bunky fixované 4 percentami paraformaldehydu počas 30 minút. Potom sa bunky premyli 3-krát fosfátovým pufrom (PBS) a inkubovali sa s pracovným roztokom Hoechst 33258 (1 ug/ml) v tme počas 30 minút pri teplote miestnosti. Obrázky boli zachytené pomocou fluorescenčného mikroskopu (IX73, Olympus, Japonsko) pri excitačnej vlnovej dĺžke 352 nm/emisnej vlnovej dĺžke 461 nm. Na farbenie AO/EB odstráňte médium z 96-jamkových doštičiek a pridajte zmes AO/EB (zmiešané 100 ug/ml AO a 100 ug/ml EB) na 5 minút v tme pri izbovej teplote. Potom sa bunky trikrát premyli PBS. Bunky sa vizualizovali pomocou fluorescenčného mikroskopu pri excitačnej vlnovej dĺžke 490 nm/emisnej vlnovej dĺžke 530 nm pre AO farbenie a excitačnej vlnovej dĺžke 520 nm/emisnej vlnovej dĺžke 590 nm pre EB farbenie.

Intracelulárna detekcia ROS

Na intracelulárnu detekciu ROS sa bunky PC12 naočkovali do 6-jamkových doštičiek v hustote 5 x 105 a podrobili sa pôsobeniu extraktu HG a BSHX počas 24 hodín. Po inkubácii 24 hodín sa bunky PC12 trikrát premyli Dulbeccovým modifikovaným eagle médiom bez séra a pridali sa do 10 μΜ 2', 7'-dichlórfluoresceín diacetátu (DCF-DA), ktorý sa oxiduje na fluorescenčný 2', 7'-dichlórfluoresceín (DCF) hydroperoxidmi pri 37 stupňoch počas 30 minút v tme. Potom boli bunky 3-krát premyté studeným PBS a resuspendované v PBS. Intracelulárna hladina ROS bola detegovaná meraním strednej intenzity fluorescencie prietokovou cytometriou (BD FACSCaliburTM, USA). Excitačné/emisné vlnové dĺžky boli 488/525 nm. Na vzorku sa započítalo minimálne 10{23}} udalostí. Hodnoty boli vyjadrené ako priemerná absorbancia normalizovaná na percento kontrolnej hodnoty.

Test potenciálu mitochondriálnej membrány

Mitochondriálna depolarizácia bola hodnotená pomocou komerčnej testovacej súpravy JC{0}}. Po ošetrení extraktom HG a BSHX sa bunky inkubovali s pracovným roztokom JC-1 (1 x) pri 37 stupňoch počas 15 minút v tme. Potom odstráňte supernatant a premyte bunky 2-krát JC-1 tlmivým roztokom (1x). Bunky boli vizualizované pomocou fluorescenčného mikroskopu pri excitačnej vlnovej dĺžke 460 nm/emisnej vlnovej dĺžke 530 nm pre JC-1 monomér (detegovaný v bunkách s depolarizovanými mitochondriami) a excitačnej vlnovej dĺžke 520 nm/emisnej vlnovej dĺžke 590 nm pre JC{13 }} polymér (prítomný v polarizovaných mitochondriách). Bunky so zelenou (monomérnou) fluorescenciou boli považované za bunky s depolarizovanými mitochondriami; bunky s červenou (polymérnou) fluorescenciou sa považovali za normálne mitochondrie.

Western blot analýza

Bunky PC12 boli zozbierané a lyzované v studenom RIPA pufri s 1 x inhibítorom koktailovej proteázy. Supernatant sa zozbieral vysokorýchlostnou centrifugáciou pri 12,000 otáčkach za minútu počas 10 minúty pri 4 stupňoch. Koncentrácie proteínov boli stanovené Bradfordovým testom. Cytosol a frakcie obohatené o mitochondrie boli izolované pomocou súpravy na izoláciu mitochondrií (Pierce, Rockford, USA) na analýzu cytochrómu c. V prípade iných proteínov sa celkové bunkové lyzáty oddelili pomocou SDS-PAGE (10 percent -15 percent) a preniesli sa na membrány z polyvinylidénfluoridu (PVDF). Polyvinylidénfluoridové membrány boli potom blokované 5 percentným odtučneným mliekom a inkubované s uvedenými primárnymi protilátkami pri 4 stupňoch cez noc. Membrány sa trikrát premyli PBST (fyziologický roztok pufrovaný fosfátom, 0,1 % Tween 20) a inkubovali sa so sekundárnymi protilátkami pri teplote miestnosti počas 2 hodín. Potom sa membrány ešte trikrát premyli PBST a vizualizovali sa použitím vylepšeného chemiluminiscenčného substrátu a skenovali sa pomocou Kodak Digital Imaging System (Gel Logic 2200Pro, Kodak, USA).

Štatistická analýza

Všetky hodnoty sú vyjadrené ako priemer ± štandardná odchýlka (SD). Významnosť rozdielov medzi priemernými hodnotami bola stanovená jednosmernou analýzou rozptylu (ANOVA) s použitím softvéru Statistical Package for Social Sciences (SPSS 16.0). P < 0,05="" v="" porovnaní="" s="" kontrolnou="" skupinou="" sa="" považovalo="" za="" štatisticky="">

Výsledky

Extrakt BSHX chráni bunky PC12 pred poškodením buniek vyvolaným HG

Aby sme zistili, či extrakt BSHX môže chrániť bunky PC12 pred urážkou HG, ošetrili sme bunky PC12 rozsahom koncentrácií extraktu BSHX (20, 50 a 100 mg/l) počas 48 hodín v podmienkach HG (75 mM). Hodnotenie životaschopnosti buniek pomocou testu MTT ukázalo, že poškodenie HG spôsobilo významné zníženie životaschopnosti buniek PC12 (životaschopnosť buniek bola približne 56,9 ± 6,7 percent) a že ošetrenie extraktom BSHX významne zabránilo bunkovej smrti spôsobom závislým od koncentrácie. Životaschopnosť buniek sa zvýšila na 87,8 ± 9,2 percent, keď boli bunky súčasne ošetrené extraktom BSHX (100 mg/l) (obrázok 1A). Laktátdehydrogenáza (LDH) sa uvoľňuje z poškodených buniek, a preto sa môže použiť aj ako indikátor bunkovej toxicity. V súlade s výsledkami testu MTT sme zistili, že urážka HG významne zvýšila uvoľňovanie LDH z buniek PC12 a že ošetrenie extraktom BSHX zabránilo uvoľňovaniu LDH spôsobom závislým od koncentrácie (obrázok 1B). Tieto výsledky naznačujú, že extrakt BSHX zvyšuje životaschopnosť buniek v HG-indukovaných bunkách PC12.

Extrakt BSHX inhibuje apoptózu buniek PC12 cestou závislou od kaspázy-9/3-

Na stanovenie účinku extraktu BSHX na apoptózu buniek sme použili farbivo DNA Hoechst 33258 ako citlivý test na apoptózu. Jadrá normálnych buniek zafarbené Hoechst 33258 vykazovali jednotnú modrú fluorescenciu, zatiaľ čo apoptotické bunky, ktoré nukleárny chromatínový zákal pyknózy vykazovali hyperchromatické a husté fluorescenčné častice. Percento apoptózy sa vypočítalo podľa počtu apoptotických buniek oproti celkovému počtu buniek. Naše údaje odhalili, že urážka HG (75 mM) dramaticky zvýšila podiel apoptotických buniek (51,7 ± 4,3 percenta) a ošetrenie extraktom BSHX významne chránilo pred apoptózou indukovanou HG v bunkách PC12 (obrázok 2A). Tieto výsledky boli ďalej podporené analýzou dvojitého farbenia AO/EB. AO vstupuje do normálnych aj apoptotických buniek a vyžaruje zelenú fluorescenciu, zatiaľ čo EB vstupuje iba do apoptotických buniek a vyžaruje červenú fluorescenciu [13]. Test AO/EB ukázal, že percento apoptotických buniek sa významne zvýšilo po urážke HG (75 mM) (47,8,7 ± 2,6 percenta) a znížilo sa po ošetrení extraktom BSHX v bunkách PC12 (obrázok 2B), čo naznačuje, že extrakt BSHX by mohol účinne inhibujú apoptózu buniek PC12 indukovanú HG.

Potom sme skúmali účinok extraktu BSHX na dráhu kaspázy{0}/PARP, čo je dôležitá dráha apoptózy súvisiacej s mitochondriami [14]. Western blot odhalil, že urážka HG (75 mM) významne zvýšila expresiu aktívnych foriem kaspázy-3 a PARP a znížila expresiu celkovej kaspázy-3 a PARP v bunkách PC12 a tento účinok bol výrazne zvrátený ošetrením extraktom BSHX (obrázok 2C), čo naznačuje, že extrakt BSHX účinne chránil bunky PC12 proti apoptóze prostredníctvom regulácie mitochondriálne závislej kaspázovej{10}}/PARP dráhy.

Extrakt BSHX inhibuje intracelulárnu produkciu ROS v bunkách PC12 indukovaných HG

Pretože HG by mohol zvýšiť tvorbu intracelulárnych ROS [15], testovali sme hladinu intracelulárnych ROS, aby sme určili, či extrakt BSHX môže inhibovať tvorbu ROS. V bunkách PC12, ktoré boli vystavené 75 mM HG počas 48 hodín v porovnaní s kontrolou, bolo pozorované 3.23--násobné zvýšenie strednej intenzity fluorescencie. Na rozdiel od toho spoločná liečba extraktom BSHX významne znížila priemernú intenzitu fluorescencie na približne 0.76-, 0.{{10}} a 0.{101} {12}}násobok modelovej skupiny, čo naznačuje, že extrakt BSHX by mohol inhibovať produkciu ROS indukovanú HG (obrázky 3A, B).

Extrakt BSHX udržuje mitochondriálnu homeostázu v HG-indukovaných bunkách PC12 reguláciou expresie Bax a Bcl{2}}

Potenciál mitochondriálnej membrány je dôležitým parametrom mitochondriálnej funkcie, ktorý sa používa ako indikátor zdravia buniek. JC-1 je lipofilné katiónové farbivo, ktoré môže selektívne vstúpiť do mitochondrií a reverzibilne meniť farbu zo zelenej na červenú, keď sa zvyšuje membránový potenciál. V zdravých bunkách s vysokým mitochondriálnym membránovým potenciálom JC-1 spontánne vytvára komplexy známe ako J-agregáty s intenzívnou červenou fluorescenciou. Na druhej strane v apoptotických bunkách s nízkym mitochondriálnym membránovým potenciálom zostáva JC-1 v monomérnej forme, ktorá vykazuje iba zelenú fluorescenciu [16, 17]. Pomer zelenej fluorescencie k červenej fluorescencii teda môže odrážať mitochondriálnu depolarizáciu. V našej štúdii sa počet buniek s depolarizovanými mitochondriami (zelená fluorescencia) významne zvýšil po HG (75 mM) počas 48 hodín a toto zvýšenie bolo zvrátené ošetrením extraktom BSHX spôsobom závislým od koncentrácie (obrázok 4A).

Ďalej sme detekovali mitochondriálne a cytoplazmatické distribúcie cytochrómu c, kľúčového hráča v aktivačnej dráhe apoptózy závislej od kaspázy. Zistili sme, že HG (75 mM) inzult počas 48 hodín vyvolal dramatickú translokáciu cytochrómu c z mitochondrií do cytoplazmy a tomuto premiestneniu sa významne zabránilo ošetrením extraktom BSHX (obrázok 4B), čo naznačuje, že extrakt BSHX by mohol inhibovať uvoľňovanie cytochróm c z mitochondrií.

Okrem toho sú proteíny rodiny Bcl{0}} dôležitými regulátormi rôznych apoptotických dráh. Bcl-2 môže inhibovať bunkovú apoptózu spôsobenú rôznymi cytotoxickými faktormi a je inhibítorom uvoľňovania cytochrómu c z mitochondrií do cytoplazmy. Bax, ako člen rodiny Bcl-2, je však proapoptóznym faktorom. Keď je indukovaná apoptóza, Bax migruje z cytoplazmy do mitochondrií a ničí mitochondriálnu integritu [5, 18]. V našej štúdii bola hladina proteínu Bcl-2 znížená a Bax bola zvýšená urážka HG (75 mM) počas 48 hodín, tento účinok bol v závislosti od koncentrácie zvrátený extraktom BSHX (obrázok 4C). Všetky tieto výsledky vyššie naznačujú, že extrakt BSHX chránil bunky PC12 pred mitochondriálnou depolarizáciou vyvolanou HG reguláciou expresie Bax a Bcl-2.

Účinok extraktu BSHX na apoptózu buniek prostredníctvom signálnych dráh JNK/p38 MAPK

Niektoré štúdie ukázali, že zvýšená produkcia ROS bola spojená s aktiváciou dráh MAPK na spustenie bunkovej apoptózy9 [19, 20]. Skúmali sme teda účinok extraktu BSHX na signálnu dráhu mitogénom aktivovanej proteínkinázy (MAPK), aby sme určili, či extrakt BSHX môže zmierniť apoptózu indukovanú HG. Ako je znázornené na obrázku 5, inzult HG (75 mM) počas 48 hodín zvýšil fosforyláciu c-Jun NH{9}}terminálnej kinázy (JNK) a p38 v bunkách PC12, ktoré boli významne inhibované extraktom BSHX v koncentrácii- závislým spôsobom. Avšak podobný výsledok nebol pozorovaný s extracelulárne regulovanou proteínkinázou (ERK) MAPK. Výsledky naznačujú, že extrakt BSHX by mohol inhibovať apoptózu buniek indukovanú HG prostredníctvom signálnych dráh JNK/p38 MAPK.

Diskusia

Diabetická encefalopatia (DE) je častou komplikáciou diabetes mellitus 2. typu (T2DM). Môže spôsobiť kognitívne poškodenie mozgu a je významným rizikovým faktorom mortality a invalidity u pacientov s diabetes mellitus 2. typu na celom svete [3]. Preto je dôležité študovať mechanizmus DE, ako aj stratégie prevencie a liečby.

V Číne sa tradičné čínske lieky (TCM) používajú na liečbu DM už mnoho rokov a majú liečivý účinok. Niektoré klinické štúdie naznačujú, že TCM založené na vyživovaní obličiek a aktivácii krvných stratégií môžu znižovať hladinu glukózy v krvi, podporovať cirkuláciu a zlepšovať kognitívnu dysfunkciu mozgu. Receptúra ​​BSHX je zástupcom týchto TCM. Naša predbežná klinická štúdia ukázala, že predpisovanie BSHX by mohlo účinne zlepšiť hladinu glukózy v krvi, homocysteín (HCY) a vysoko citlivý C-reaktívny proteín (hs-CPR) v sére a zlepšiť kognitívne funkcie diabetických pacientov s miernou kognitívnou poruchou (MCI). [12]. Zatiaľ však chýbajú dôkazy na preukázanie účinnosti a farmakologického mechanizmu.

V tejto štúdii sme zistili, že extrakt BSHX by mohol zmierniť zníženie životaschopnosti buniek vyvolané HG, ako sa meralo pomocou testu MTT, LDH. Aby sme ďalej preskúmali ochranný účinok extraktu BSHX na životaschopnosť buniek, študovali sme apoptózu pomocou Hoechst 33258 a analýzu farbenia AO / EB. Výsledky ukázali, že extrakt BSHX by mohol významne znížiť apoptózu indukovanú HG. Ako marker apoptózy boli kaspáza-3 a PARP významne zvýšené po liečbe HG, ale aktivácia týchto proapoptotických faktorov bola inhibovaná BSHX extraktom spôsobom závislým od koncentrácie. Vyššie uvedené výsledky naznačujú, že extrakt BSHX mal ochranný účinok na poškodenie buniek PC12 vyvolané HG.

ROS vzniká pri procese oxidatívnej fosforylácie buniek a jeho zvýšenie produkcie alebo poškodenie antioxidačných systémov môže viesť k oxidačnému stresu v bunkách [21]. Štúdie ukázali, že vysoká hladina glukózy by mohla viesť k akumulácii intracelulárnych ROS a prípadne k aktívnej apoptotickej signálnej dráhe. A spoločným mechanizmom diabetických komplikácií je oxidačný stres [22, 23]. Naše výsledky ukázali, že vysoká hladina glukózy by mohla viesť k zvýšeniu ROS v bunkách PC12, čo bolo v súlade s predchádzajúcimi štúdiami [24]. Predpokladá sa, že toxicitu vysokej hladiny glukózy pre bunky možno dosiahnuť prostredníctvom apoptózy indukovanej ROS. Mitochondrie sú hlavnými miestami intracelulárnej produkcie ROS a tiež hlavným cieľovým orgánom pre útok ROS [25]. Za patologických podmienok môže rýchly nárast ROS viesť k mitochondriálnej dysfunkcii, kolapsu potenciálu mitochondriálnej membrány a prípadne viesť k apoptóze buniek [26]. Takže sme zistili integritu mitochondrií. Naše výsledky ukázali, že vysoká hladina glukózy významne znížila potenciál mitochondriálnej membrány, zvýšila pomer Bax/Bcl-2, ktorý kontroloval prepnutie pórov prechodu mitochondriálnej permeability (MPTP), a podporil únik cytochrómu c, zatiaľ čo extrakt BSHX mohol zvrátiť tieto zmeny. Tieto naznačujú, že neuroprotektívum extraktu BSHX proti bunkám PC12 indukovaným HG môže byť výsledkom zachovania integrity mitochondrií.

Signálna dráha MAPK tiež hrá dôležitú úlohu v bunkovej apoptóze. JNK, ERK a p38 MAPK sú najviac študovanými členmi rodiny MAPK. Ich hlavným spôsobom účinku je fosforylovať ich špecifické miesta, čím regulujú apoptózu buniek [8, 27, 28]. Štúdie navyše ukázali, že nadmerná produkcia ROS môže spustiť fosforyláciu p38MAPK [29-31] a ROS môže vyvolať alebo sprostredkovať aktiváciu dráh MAPK [32]. Niekoľko bunkových stimulov, ktoré indukujú produkciu ROS aj paralelne, môže aktivovať dráhy MAPK vo viacerých typoch buniek [32, 33]. Potenciálne mechanizmy aktivácie MAPK prostredníctvom ROS môžu zahŕňať inaktiváciu a degradáciu fosfatáz MAPK, ktoré udržiavajú dráhu v neaktívnom stave [19]. Na druhej strane, aby sa ďalej potvrdilo, či boli dráhy MAPK aktivované generovaním ROS, bunky boli vopred ošetrené antioxidantmi (napr. NAC, lapač ROS), aby sa zabránilo akumulácii ROS. A výsledky ukázali, že aktivácia MAPK bola takmer inhibovaná po bunkovej stimulácii bunkovými stimulmi [32, 33], čo naznačuje zapojenie ROS inaktivácie MAPK dráh. Okrem toho štúdie ukázali, že keď boli bunky ošetrené špecifickým inhibítorom JNK SP600125, apoptóza indukovaná kardiotoxínom III mohla byť blokovaná [34]. Naša predchádzajúca štúdia zistila, že modifikovaný predpis Wu-Zi-Yan-Zong (MWP) by mohol inhibovať aktiváciu ERK/p38 MAPK v A-aktivovanej mikroglii BV2 [10]. V tejto štúdii sme však zistili, že extrakt BSHX by mohol inhibovať fosforyláciu JNK a p38 MAPK a rovnaký výsledok sme nedosiahli s p-ERK. Predpokladáme, že pijavice hrajú v extrakte BSHX inú úlohu. Výsledky naznačujú, že ďalší ochranný mechanizmus extraktu BSHX proti apoptóze v HG-indukovaných bunkách PC12 môže byť prostredníctvom regulácie signálnych dráh JNK/p38 MAPK.

Záver

Extrakt BSHX, polybylinný prípravok, vykazuje neuroprotektívne účinky na bunky PC12 proti inzultácii HG. Extrakt BSHX účinne inhiboval apoptózu buniek PC12 indukovanú HG prostredníctvom znižovania tvorby intracelulárnych ROS, udržiavania integrity mitochondriálnej membrány a blokovania signálnych dráh kaspázy-3 a JNK/p38 MAPK (obrázok 6). Naše zistenia spoločne naznačujú, že extrakt BSHX je sľubným činidlom na liečbu DE v klinických aplikáciách.

Autorské príspevky

Navrhli a navrhli experimenty: Zeng KW, Wang XM. Uskutočnil experiment: Zhao SY. Analyzované údaje: Zhao SY, Zeng KW a Wang XM. Prispievané činidlá/materiály/analytické nástroje: Zhao SY, Dong X, Tu PF, Zeng KW a Wang XM. Napísal páter: Zhao SY.

Referencie

1 Riederer P, Korczyn AD, Ali SS, a kol. Diabetický mozog a kognícia. J Neural Transm 2017, 124: 1-24.

2. Hamed SA. Poranenie mozgu s diabetes mellitus: dôkazy, mechanizmy a liečebné dôsledky. Expert Rev Clin Phar 2017, 10: 409-428.

3. Testa R, Bonfigli AR, Prattichizzo F, a kol. Teória "metabolickej pamäte" a včasná liečba hyperglykémie pri prevencii diabetických komplikácií. Nutr 2017, 9: 437-445.

4. Ly JD, Grubb DR, Lawen A. Mitochondriálny membránový potenciál (Δψm) pri apoptóze; aktualizácie. Apoptóza 2003, 8: 115-128.

5. Aouacheria A, Baghdiguian S, Lamb HM, Huska JD, Pineda FJ, Harwick J M. Prepojenie mitochondriálnej dynamiky a udalostí života a smrti prostredníctvom proteínov rodiny Bcl-2. Neurochem Int 2017, 109: 141-161.

6. Bernardi P., Scorrano L., Colonna R. a kol. Mitochondrie a bunková smrť. Mechanistické aspekty a metodologické otázky. Feb J 1999, 264: 687-701.

7. Yang L, Wu L, Du S a kol. 1,25-(OH)2D3 inhibuje apoptózu indukovanú vysokou glukózou a produkciu ROS v ľudských peritoneálnych mezoteliálnych bunkách prostredníctvom MAPK/P38 dráhy. Mol Med Rep 2016, 14: 839-844.

8. Tabakman R, Jiang H, Schaefer E, a kol. Predbežné ošetrenie nervovým rastovým faktorom zoslabuje c-Jun amino-terminálnu kinázu 1 a stresom aktivované kinázy p38 a p38 indukovanú depriváciou kyslíka a glukózy a poskytuje neuroprotekciu v modeli feochromocytómu PC12. J Mol Neurosci 2004, 22: 237-250.

9. Zou W, Zeng J, Zhuo M, Xu W, Sun L, Wang J a kol. Zapojenie kaspázy-3 a mitogénom aktivovanej proteínkinázy p38 do apoptózy v bunkách PC12 indukovanej chloridom kobaltnatým. J Neurosci Res 2002, 67: 837-843.

10. Yu Q, Song FJ, Chen JF a kol. Antineurozápalové účinky modifikovaného predpisu Wu-Zi-Yan-Zong v mikroglii BV2 stimulovanej amyloidom prostredníctvom signálnych dráh NF-KB a ERK/p38 MAPK. Evid-Based Compl Alt 2017, 2017: 1-10.

11. Zeng KW, Zhang T, Fu H a kol. Modifikovaný predpis Wu-Zi-Yan-Zong, tradičný čínsky polybylinný prípravok, potláča neurozápalové procesy vyvolané lipopolysacharidmi v potkaních astrocytoch prostredníctvom signálnych dráh NF-KB a JNK/p38 MAPK. Phytomed 2012, 19: 122-129.

12. Fu H, Lin WW, Wang H, a kol. Účinok predpisu Bushen Huoxue na liečbu mierneho zhoršenia kognície diabetu 2. typu. Chin J Integr Trad West Med 2017, 37: 661-665.

13. Baskić D, Popović S, Ristić P a kol. Analýza cykloheximidom indukovanej apoptózy v ľudských leukocytoch: Fluorescenčná mikroskopia s použitím anexín V/propídium jodid versus akridínová oranž/etidium bromid. Cell Biol. Int 2006, 30: 924-932.

14. Galluzzi L, Lópezsoto A, Kumar S, a kol. Kaspázy spájajú signalizáciu bunkovej smrti s homeostázou organizmu. Imunita 2016, 44: 221-231.

15. Hamed S, Brenner B, Roguin A. Oxid dusnatý: kľúčový faktor za dysfunkciou endotelových progenitorových buniek pri diabetes mellitus typu-2. Cardiovasc Res 2011, 91: 9-15.

16. Perelman A, Wachtel C, Cohen M, a kol. JC-1: Alternatívne vlnové dĺžky excitácie uľahčujú cytometriu potenciálu mitochondriálnej membrány. Cell Death Dis 2012, 3: e430.

17. Perry SW, Norman JP, Barbieri J a kol. Mitochondriálne membránové potenciálové sondy a protónový gradient: praktický návod na použitie. Biotech 2011, 50: 98-115.

18. Chipuk JE, Green D R. Ako BCL-2 proteíny indukujú permeabilizáciu mitochondriálnej vonkajšej membrány? Trends Cell Biol 2008, 18:157-164.

19. Son Y, Cheong YK, Kim NH a kol. Mitogénom aktivované proteínkinázy a reaktívne formy kyslíka: ako môže ROS aktivovať dráhy MAPK? J Signal Transduct 2011: 792639.

20. Zhang L, Zhang Z, Chen F, a kol. Aromatické heterocyklické estery podofylotoxínu vykazujú anti-MDR aktivitu v bunkách ľudskej leukémie K562/ADR prostredníctvom signálnej dráhy ROS/MAPK. Eur J Med Chem 2016, 123:226-235.

21. Kanninen K, White AR, Koistinaho J, et al. Zacielenie na glykogénsyntázovú kinázu-3 pre terapeutický prínos proti oxidačnému stresu pri Alzheimerovej chorobe: Zapojenie dráhy Nrf2-ARE. Int J Alzheimers Dis 2011, 2011:985085.

22. Babizhayev MA, Strokov IA, Novikov VV, et al. Úloha oxidačného stresu pri diabetickej neuropatii: Generovanie voľných radikálov v glykačnej reakcii a génové polymorfizmy kódujúce antioxidačné enzýmy na genetickú náchylnosť k diabetickej neuropatii v populácii pacientov s diabetom I. typu. Cell Biochem Biophys 2015, 71: 1425-1443.

23. Volpe C, Villardelfino PH, Dos PA a kol. Bunková smrť, reaktívne formy kyslíka (ROS) a diabetické komplikácie. Cell Death Dis 2018, 9: 119-127.

24. Chen K, Zhang M, Chen BD a kol. Ginkgolid B inhibuje apoptózu v endoteliálnych bunkách ľudskej pupočníkovej žily stimulovaných vysokým obsahom glukózy. Chinese Pharmacological Bulletin 2017, 33: 378-383.

25. Goldsteins G, Keksa-Goldstein V, Ahtoniemi T, a kol. Škodlivá úloha superoxiddismutázy v mitochondriálnom medzimembránovom priestore. J Biol Chem 2008, 283: 8446-8452.

26. Cowan KJ, poschodie KB. Mitogénom aktivované proteínkinázy: nové signálne dráhy fungujúce v bunkových odpovediach na environmentálny stres. J Exp Bio 2003, 206: 1107.

27. Wu N, Lin X, Zhao X, a kol. MiR-125b pôsobí ako onkogén v bunkách glioblastómu a inhibuje apoptózu buniek prostredníctvom dráh nezávislých od p53 a p38MAPK. Brit J Cancer 2013, 109: 2853.

28. Shi L, Yu X, Yang H, a kol. Koncové produkty pokročilej glykácie indukujú apoptózu epiteliálnych buniek ľudskej rohovky prostredníctvom vytvárania reaktívnych foriem kyslíka a aktivácie dráh JNK a p38 MAPK. Plus One 2013, 8: e66781.

29. Chung H, Kim E, Lee DH a kol. Ghrelín inhibuje apoptózu v hypotalamických neurónových bunkách počas nedostatku kyslíka a glukózy. Endokrinológia 2007, 148: 148.

30. Palanivel K, Kanimozhi V, Kadalmani B. Verrukarín A mení regulačné proteíny bunkového cyklu a indukuje apoptózu prostredníctvom aktivácie p38MAPK závislej od reaktívnych foriem kyslíka v bunkovej línii ľudského karcinómu prsníka MCF-7. Tumor Biology 2014, 35: 10159.

31. Hua X, Chi W, Su L a kol. Oxidačné poškodenie vyvolané ROS zapojené do patogenézy hubovej keratitídy prostredníctvom aktivácie p38 MAPK. Sci Rep 2017, 7: 10421.

32. Mccubrey JA, Lahair MM, Franklin RA. Aktivácia signálnych dráh MAP kinázy indukovaná reaktívnymi druhmi kyslíka. Antioxid Redox Signal 2006, 8: 1775-1789.

33. Torres M, Forman H J. Redoxná signalizácia a MAP kinázové dráhy. Biofactors 2003, 17: 287-296.

34. Chien CM, Yang SH, Yang CC, Chang LS, Lin SR. Kardiotoxín III indukuje apoptózu závislú od c-jun N-terminálnej kinázy v HL-60 ľudských leukemických bunkách. Cell Biochem Funct 2008, 26: 111-118.