Neuroprotektívne účinky a mechanizmy prokyanidínov in vitro a in vivo 1. časť

Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPre viac informácií

Abstrakt:Táto štúdia hodnotilaneuroprotektívneúčinky a mechanizmy prokyanidínov (PC). In vitro boli potkanie feochromocytómové bunky (PC12 bunky) vystavené PCs (1,2 alebo 4 ug/ml) alebo N-acetyl-L-cysteínu （NAC） （20 μM） počas 24 hodín a potom inkubované s 200 μM H, O, počas 24 hodín. V porovnaní so samotnou H2O2 PC významne zvýšili antioxidačné aktivity (napr. glutatiónperoxidáza (GSH-Px), superoxiddismutáza (SOD), kataláza (CAT), znížili hladiny reaktívnych foriem kyslíka (ROS) a malondialdehydu (MDA) a zvýšili jadrovú akumulácia faktora-erytroidného 2-faktora 2 (Nrf2) a zvýšená expresia chinónoxidoreduktázy 1 (NQO1), hemoxygenázy 1 (HO-1), podjednotky modifikátora glutamát-cysteín ligázy (GCLM) a katalytická podjednotka glutamát-cysteín ligáza (GCLC). In vivo boli larvy zebrafish (ABstrain) 3 dni po oplodnení (pdf) vystavené NAC (30 uM) alebo PC (4, 8 alebo 16 ug/ml) v neprítomnosti resp. prítomnosť 300 μM H, O počas 4 dní. V porovnaní so samotným H, O sa PC zvýšiliantioxidantaktivity (napr. GSH-Px, CAT a SOD), znížené hladiny ROS a MDA a zvýšená aktivácia prvku Nrf2/antioxidačnej odozvy (ARE) a zvýšené hladiny expresie NQO1, HO-1, GCLM a GCLC Na záver, tieto výsledky ukázali, že PC mali neuroprotektívne účinky prostredníctvom aktivácie dráhy Nrf2/ARE a zmiernenia oxidačného poškodenia.

Kľúčové slová:prokyanidíny; neuroprotektívne; zebra ryba; bunky PC12; Cesta Nrf2/ARE

Ak chcete vedieť viac, kliknite sem

1. Úvod

Neurodegeneratívne ochorenie označuje pomalú a postupnú degeneráciuneurónyv ľudskom mozgu, čo vedie k rôznym motorickým a/alebo kognitívnym problémom a nakoniec vedie k smrti neurónov[1]. So zvyšujúcim sa počtom starších ľudí rýchlo narastá miera výskytu senilných neurodegeneratívnych ochorení [2,3]. Hoci základné mechanizmy neurodegenerácie sú stále nejasné, značné dôkazy ukazujú, že oxidačný stres spôsobený nadprodukciou reaktívnych foriem kyslíka (ROS) a/alebo poškodením antioxidačného obranného systému hrá kľúčovú úlohu pri týchto ochoreniach [4-6]. V procese neurodegenerácie existuje nerovnováha medzi produkciou intracelulárnych ROS a schopnosťou antioxidačného obranného systému vyčistiť ROS a/alebo opraviť poškodenie sprostredkované ROS 7]I. Nadmerná produkcia ROS vedie k makromolekulárnemu poškodeniu. Preto akumulácia bunkového makromolekulárneho poškodenia vedie k nekróze [8,9. V dôsledku toho môže doplnenie antioxidantov na odstránenie prebytočného ROS pomôcť predchádzať neurodegeneratívnym ochoreniam. Prírodné bioaktívne zlúčeniny sú bezpečné s malými alebo žiadnymi vedľajšími účinkami. Preto sa stále viac pozornosti venuje objavovaniu antioxidačných zlúčenín z prírodných zdrojov.

Cistanche môže zlepšiť imunitu

Prokyanidíny (PC) sú prírodné fenolové zlúčeniny flavonoidov a obsahujú oligoméry monomérov katechínu aepikatechín[10-12]. PC sú prirodzené živiny a antioxidanty a ich antioxidačné účinky sú silnejšie ako u vitamínu C a vitamínu E [13]

Neuroprotektívne účinky a mechanizmus PC týkajúce sa oxidačného poškodenia in vivo a in vitro však zostávajú nejasné.

Zebrafish sú sladkovodné tropické cyprinidové ryby obmedzené na Indiu. Je zaujímavé, že približne 87 percent génov súvisiacich s ľudskými chorobami je spojených s homológnymi génmi u zebričiek [14]. V porovnaní s experimentálnymi myšacími modelmi je využitie zebričiek ako modelového systému spojené s kratšími experimentálnymi obdobiami, zníženými nákladmi a prístupnejšími génovými manipuláciami[15]. Pokiaľ ide o modely in vitro, potkanfeochromocytómbunky (PC12 bunky) sú podobné neurónom z hľadiska morfológie, štruktúry a funkcie [16]. Ich vlastnosti sú vysoko konzistentné s vlastnosťami primárne kultivovaných neurónov a majú experimentálne výhody, pokiaľ ide o ľahké a stabilné udržiavanie v kultúre [17]. Okrem toho bunky PC12 boli široko používané ako in vitro modely na štúdium nervových buniek [18-20]. Peroxid vodíka (H, O2) je typ ROS, ktorý môže prenikať cez bunkové membrány a iniciovať oxidačný stres [21]. Početné správy ukázali, že H202 sa môže použiť na vytvorenie modelov oxidačného stresu [22-24]. V tejto štúdii sme hodnotili neuroprotektívne účinky a mechanizmy PC v bunkách PC12 a zebričkách.

2. Výsledky

2.1. Účinky PC na H2O2-Ošetrené poškodenie buniek PC12

Bunky PC12 boli vystavené 200 uM H, O počas 24 hodín a životaschopnosť buniek sa znížila na 56, 5 percent (obrázok la). Predbežné ošetrenie buniek samotnými PC v koncentrácii 1, 2 alebo 4 ug/ml nemalo žiadny vplyv na životaschopnosť buniek, zatiaľ čo liečba 1, 2 a 4 ug/ml PC významne chránila bunky PC12 pred cytotoxicitou2-liečenou H2O zlepšením životaschopnosť buniek (obrázok 1b, c, s<0.05 versus="" h,="" o2-treated="" group).="" however,="" pcs="" treatment="" alone="" at8ug/ml="" decreased="" cell="" viability="" (figure="" 1b).="" n-acetyl-l-cysteine="" (nac),="" whichis="" is="" known="" to="" protect="" against="" h2o2-induced="" oxidative="" damage,="" was="" used="" as="" a="" positive="">

2.2. Účinky PC na oxidačný stres buniek PC12 ošetrených H2O2

Hladiny ROS a malondialdehydu (MDA) naznačujú závažnosť oxidačného poškodenia. Bunky PC12 vystavené 200 μM H2O2 počas 24 hodín zvýšili hladiny ROS a MDA a predbežné ošetrenie 2 a 4 ug/ml PC inhibovalo hladiny ROS a MDA（obrázok 2a-c, s.<0.05 versus="" h,="" o2-induced="" group).="" to="" further="" evaluate="" the="" antioxidant="" effects="" of="" pcs="" in="" h,o,-induced="" pc12="" cells,="" we="" measured="">glutatiónaktivity peroxidázy (GSH-Px), katalázy (CAT) a superoxiddismutázy (SOD) a pozorovali, že liečba H, O potlačila aktivity GSH-Px, CAT a SOD. Účinky vyvolané H2O2- však boli zachránené predbežnou úpravou pomocou PC v množstve 2 a 4 ug/ml (obrázok 2d-f,p<0.05 versus="" h2o2-treated="">

2.3. Účinky počítačov na jadrový faktor – erytroidný 2-cesta súvisiaceho faktora 2 (Nrf2)/ARE v H2O2-ošetrených bunkách PC12

Zistili sme, že hladina Nrf2 bola upregulovaná a expresia Keapl bola znížená po predbežnom ošetrení PC (2 a 4 ug/ml) pred liečbou H202 v porovnaní s týmito hladinami v skupine indukovanej H20 (obrázok 3a-c ,s<0.05 versus="" h,o,-induced="" group）.="" furthermore,="" pcs="" （4="" μg/ml）="" facilitated="" nuclear="" localization="" of="" nrf2="" under="" h,o,-lesioning="" conditions="" (figure=""><0.05 versus="" h2o2-induced="" group).addition-ally,="" western="" blotting="" showed="" that="" heme="" oxygenase="" 1="" (ho-1),="" quinone="" oxidoreductase="" 1(nqo1),="" glutamate-cysteine="" ligase="" catalytic="" subunit(gclc),="" and="" glutamate-cysteine="" ligase="" modifier="" subunit="" (gclm)="" levels="" were="" upregulated="" following="" pcs(2="" and="" 4="" ug/ml)treatment="" compared="" with="" h2o2="" alone="" (figure="" 3g-k,=""><0.05 versus="" h2o2-induced="">

Obrázok 3. Účinky PC na dráhu Nrf2/ARE v bunkách PC12 ošetrených H, O2-. (a) Hladiny proteínov Nrf2 a Keap1, ako sa stanovilo pomocou Western blotting; (b) relatívna expresia proteínu Nrf2/GAPDH (pomer ku kontrole); (c) relatívna expresia proteínu Keap1/GAPDH (pomer ku kontrole); (d) hladiny proteínovej expresie jadrového Nrf2 a cytoplazmatického Nrf2, ako bolo určené Western blotovaním; (e) relatívna expresia jadrového proteínu Nrf2/LaminB (pomer ku kontrole); (f) relatívna expresia cytoplazmatického proteínu Nrf2/GAPDH (pomer ku kontrole); (g) hladiny proteínu HO-1, NOO1, katalytickej podjednotky glutamát-cysteínligázy (GCLC) a GCLM, ako sa stanovilo pomocou Western blottingu; (h) relatívna expresia proteínu HO-1/GAPDH (pomer ku kontrole); (i) relatívna expresia proteínu NQ01/GAPDH (pomer ku kontrole); (j)relatívna expresia proteínu GCLC/GAPDH (pomer ku kontrole); (k) Relatívna expresia proteínu GCLM/GAPDH (pomer ku kontrole). Údaje sú vyjadrené ako priemer ± SD. Všetky experimenty sa uskutočnili trikrát. Hodnoty s rôznymi písmenami vyššie sa výrazne líšia (s<0.05, one-way="">

2.4. Signalizácia Nrf2/ARE je zodpovedná za antioxidačné účinky sprostredkované počítačmi

Ako je znázornené na obrázku 4a, b, Nrf2 siRNA inhibovala expresiu Nrf2. Medzitým liečba Nrf2 siRNA eliminovala ochranné účinky PC proti oxidačnému poškodeniu ošetrenému H2O2-, o čom svedčí znížená životaschopnosť buniek v skupine transfekovanej Nrf{7}}siRNA (obrázok 4c). Súčasne boli účinky počítačov na obsah MDA a aktivitu SOD zvrátené knockdownom Nrf2 v podmienkach poškodenia H2O{12}} (obrázok 4d, e).

Obrázok 4. Signalizácia Nrf2/ARE je zodpovedná za antioxidačné účinky sprostredkované PCs v bunkách PC12 ošetrených H2O2-.(a)Účinnosť knock-out sa zistila stanovením expresie proteínu Nrf2 pomocou Western blotting;(b)Nrf2/ Relatívna expresia proteínu GAPDH (pomer ku kontrole); (c) životaschopnosť buniek; (d) hladiny MDA; (e) aktivita SOD. Údaje sú vyjadrené ako priemer ± SD. Všetky experimenty sa uskutočnili trikrát. Hodnoty s rôznymi písmenami vyššie sú výrazne odlišné (s<0.05, **p="" <="" 0.01="" relative="" to="" control="" group,="" one-way="">

2.5. Účinky PC na pohyblivosť lariev zebrafish po liečbe H2O2

Oxidačné poškodenie vyvolané H2O2- znížilo celkovú vzdialenosť lariev zebričiek. Ošetrenie PC (4, 8 a 16 ug/ml) zachránilo H2O2-indukované lokomotorické deficity, o čom svedčí väčšia vzdialenosť pohybu v porovnaní so vzdialenosťou v skupine H2O2 (obrázok 5a,b,p<0.05 versus="" h2o2-treated="" group).="" nac,="" which="" is="" known="" to="" protect="" against="" h2o2-induced="" oxidative="" damage,="" was="" used="" as="" a="" positive="" control.="" moreover,="" pcs(16ug/ml)or="" nac（30="" μm）="" alone="" did="" not="" affect="" the="" locomotor="" behavior="" of="" normal="" zebrafish="">

Obrázok 5. Účinky PC na motilitu lariev zebričiek ošetrených H2O2-. a)Typické vzory stôp plávania lariev zebričiek v každej skupine;b)Priemerná celková vzdialenosť lariev zebričiek v každej skupine. Údaje sú uvedené ako priemer ± SD. Všetky experimenty sa opakovali trikrát. Hodnoty s rôznymi písmenami vyššie sa výrazne líšia (s<0.05, one-way="">

2.6. Účinky PC na oxidačný stres lariev zebrajish ošetrených H2O2

Ošetrenie PC (4, 8 a 16 ug/ml) na larvy zebričiek znížilo H2O2-indukované zvýšenie tvorby intracelulárnych ROS (obrázok 6a,b, s.<0.05 versus="" h,="" o,-treated="" group).="" lipid="" peroxidation="" assays="" also="" indicated="" that="" pcs(4,8,="" and="" 16="" ug/ml)="" dose-dependently="" blocked="" h2o2-induced="" increases="" in="" mda="" levels="" in="" zebrafish="" larvae="" (figure="" 6c,=""><0.05 versus="" ho2-induced="" group).="" furthermore,="" gsh-px="" activity="" was="" reversed="" by="" pc's="" (4,8,="" and="" 16="" μg/ml）="" treatment="" （figure=""><0.05 versus="" h2o2-treated="" group）.="" additionally,="" pcs（8="" and="" 16="" μg/ml）increased="" h2o2-induced="" reductions="" in="" cat="" and="" sod="" activities（figure="" 6e,f,p=""><0.05 versus="" h2o2-induced="">

Obrázok 6. Účinky PC na oxidačný stres u lariev zebričiek ošetrených H2O2-. (a) Reprezentatívne fluorescenčné mikrofotografie lariev zebričiek; (b) Hladiny ROS sa merali pomocou zobrazovacieho softvéru; (c) hladiny MDA; (d) aktivita GSH-Px; (e) aktivita CAT; (f) aktivita SOD. Údaje sú vyjadrené ako priemer ± SD. Všetky experimenty sa uskutočnili trikrát. Hodnoty s rôznymi písmenami vyššie sú výrazne odlišné (p < 0,05,="" jednosmerná="">

2.7. Účinky počítačov na dráhy Nrf2/ARE v H2O2-liečených Zebrafish Laroae

Ochranné účinky liečby PC u lariev zebrafish ošetrených H2O2-naznačovali, že mohli byť zapojené dráhy Nrf2/ARE. Hladiny expresie Nrf2, HO-1, NQO1, GCLC a GCLM (obrázok 7a-e,p<0.05 versus="" h,="" o,-induced="" group)were="" up-regulated="" following="" pcs(16="" ug/ml)="" treatment="" compared="" to="" levels="" after="" h2o,="" treatment="">

Figure 7. Effects of PCs on the Nrf2/ARE pathway in H>O,-ošetrené larvy zebričiek. (a) hladiny Nrf2; (b) hladiny GCLC; (c) hladiny GCLM; (d) hladiny HO-1; (e) hladiny NQO1. Údaje sú vyjadrené ako priemer ± SD. Hodnoty s rôznymi písmenami vyššie sa výrazne líšia (s<0.05, one-way="" anova="">

Tento článok je extrahovaný z Molecules 2021, 26, 2963. https://doi.org/10.3390/molecules26102963 https://www.mdpi.com/journal/molecules