Optogenetická inhibícia vstupov mediálneho entorinálneho kortexu do hipokampu počas krátkeho časového obdobia hneď po učení narúša kontextový strach formovanie pamäte

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Abstraktné

Vznik časovej asociáciePamäťa kontext špecifický strachPamäťPredpokladá sa, že vyžaduje vstupy mediálneho entorinálneho kortexu (MEC).hippocampuspočas vzdelávacích akcií. Či sa však vstupy MEC podieľajú aj na tvorbe pamäte počas obdobia po učení, ešte nebolo priamo testované. Na preskúmanie tejto možnosti sme optogeneticky inhibovali axóny a terminály pochádzajúce z bilaterálnych dorzálnych MEC excitačných neurónov v dorzálnychhippocampuspo dobu 5 minút hneď po kontextovom podmieňovaní strachu (CFC). Myši exprimujúce eNpHR3.0 vykazovali výrazne menšie zmrazenie v porovnaní s kontrolnými myšami exprimujúcimi samotný EGFP počas testu vyhľadávania v podmienenom kontexte 1 deň po učení. Na rozdiel od toho, rovnaká optogenetická inhibícia vstupov MEC vykonaná 30 minút pred testom vyhľadávania neovplyvnila zmrazenie počas testu vyhľadávania, s vylúčením možnosti nešpecifického škodlivého účinku optickej inhibície na proces vyhľadávania. Tieto výsledky podporujú, že tvorba kontextovej pamäte strachu vyžaduje vstupy MEC do hipokampu počas obdobia po učení.

Kľúčové slová: Mediálny entorinálny kortex, Hippocampus, Kontextové podmieňovanie strachu

Min Soo Kang a Jin-Hee Han

Systém hipokampus-entorinálny kortex je rozhodujúci pre epizodickéPamäťformácia [1]. Dôkazy naznačujú, že vstup z mediálneho entorinálneho kortexu vrstvy III (MECIII) dohippocampus, hlavne pre podoblasť CA1, je rozhodujúca pre dočasné asociatívne učenie, ako je napríklad podmieňovanie strachu, ale nie pre kontextové a oneskorené podmieňovanie strachu [2, 3]. Naproti tomu optogenetická inhibícia buniek mediálnej entorinálnej kôry vrstvy II (MECII) vyčnievajúcich do gyrus dentatus (DG) a CA3, ale nie buniek vyčnievajúcich do CA1, počas CFC zhoršuje tvorbu pamäte [4]. Predpokladá sa teda, že vstup z MECII do GR alebo CA3 je potrebný na kontextové učenie strachu. Nielen pri učení, ale vstup MEC do hipokampu sa podieľa aj na jedinečných vzorcoch fyziologickej aktivity pozorovaných v hipokampe počas odpočinku a spánku, ako sú vlnky a zubaté hroty, ktoré sú spojené sPamäťkonsolidačný proces [5–10]. Preto vstup MEC dohippocampusmôže zohrávať úlohu pri vytváraní pamäte počas obdobia po učení. Táto možnosť však zatiaľ nebola testovaná. Aby sme otestovali, či je vstup MEC do hipokampu potrebný počas obdobia po učení, prijali sme optogenetický prístup na umlčanie vstupnej aktivity MEC u hybridných myší 129/C57Bl/6 [11, 12]. Na manipuláciu vstupu MEC bol do bilaterálnej injekcie injikovaný adeno-asociovaný vírus (AAV) obsahujúci gény kódujúce eNpHR3.0 fúzovaný s fluorescenčným proteínom EYFP pod promótorom CaMKII (AAV-CaMKII - eNpHR3.0-EYFP). Zameranie MEC na vrstvu II a III (0,5 µl na stranu; AP: – 4,65 mm; ML: ± 3,4 mm; DV: – 3,3 mm) (obr. 1a). Ako kontrolu sme vstrekli AAV bez eNpHR3.{24}} (AAV CaMKII -EGFP), ktorý exprimuje iba fluorescenčný proteín. Expresia AAV bola obmedzená na vrstvy MEC II a III, ktoré posielajú projekciu do hipokampu (obr. 1b). V hipokampe boli axonálne projekcie MEC exprimujúce EYFP detegované v DG a CA3, pochádzajúce z MECII, a tiež v CA1, pochádzajúce z MECIII (obr. 1a). Tri týždne po operácii injekcie AAV boli myši opäť anestetizované na operáciu implantácie optických vlákien.

Cistanchemôže zlepšiťPamäť

Optické vlákna boli implantované do dorzálneho hipokampu (AP: - 2.0 mm; ML: ± 1,3 mm; DV: - 1,5 mm) na optickú supresiu dorzálnych MEC vstupov pomocou 561- nm laseru. Špičky optických vlákien boli umiestnené priamo nad molekulárnou vrstvou CA1 stratum lacunose, a preto 561-nm laser mohol pokryť MECII aferenty v molekulárnej vrstve DG/CA3 stratum radiatum a MECIII aferenty v molekulárnej vrstve CA1 stratum lacunose ( Doplnkový súbor 1: Obr. S1). Počas jednotýždňového obdobia zotavenia po operácii implantátu si myši počas 3 dní zvykli na vlákna. Boli pripojené k optickému prepojovaciemu káblu dodávajúcemu svetlo a umiestnené do privykacej klietky na 5 minút bez dodávania svetla. Po 3 dňoch zvyknutia boli myši EGFP a eNpHR3.{21}} trénované na CFC.

Myši vstúpili do klimatizačnej komory a dostali šok do nohy ({{0}} 0,5 mA, 2 s) o 3 minúty neskôr. Jednu minútu po šoku do nôh boli myši okamžite premiestnené do habituovanej klietky a dostávali nepretržité 561-nm svetlo (5 mW na špičke vlákna) počas 5 minút (obr. 1b). Po inhibícii po učení sa myši vrátili do svojich domovských klietok. Aby sa otestovalo, či bola kontextová pamäť správne vytvorená, testovala sa dlhodobá pamäť (LTM). Myši znovu vstúpili do kondicionačnej komory 24 hodín po CFC. Úrovne zmrazovania sa merali ako index LTM, monitorovali sa 3 minúty. Myši v skupine s eNpHR3.0 vykazovali výrazne menšie zamrznutie v porovnaní s myšami v kontrolnej skupine EGFP (obr. 1c), čo naznačuje deficit 24-h LTM inhibíciou vstupov MEC do hipokampu po učení. Toto zníženie tuhnutia nebolo spôsobené nešpecifickým škodlivým účinkom procesu optickej inhibície. Keď bola rovnaká optická inhibícia aplikovaná 30 minút pred testom LTM, medzi skupinami nebol žiadny významný rozdiel v zmrazení (obr. 1d, e).

Napriek tomu, že väčšina aferentných MEC sa zameriava na hipokampus, je známe, že MEC vysiela projekcie do mediálnych prefrontálnych kortikálnych oblastí, ako je prelimbická a infralimbická kôra [13]. Pretože expresia AAV bola v MEC náhodná, je možné, že naša optická inhibícia ovplyvnila axóny MEC, ktoré prechádzajú hipokampom, ak nejaké existujú, aby vyvolali svoj účinok na kontextovú tvorbu pamäte strachu. Aby sme túto možnosť vylúčili, retrográdne sme označili neuróny MEC, ktoré vyčnievajú do hipokampu. Do hipokampu sme vstrekli vírus CAV2-Cre, ktorý je retrográdne pohlcovaný neurónmi, ktoré sa premietajú do hipokampu cez zakončenia axónov (obr. 1f).

AAV-Ef1 - DIO-eNpHR3.0-EYFP alebo AAV-Ef1 -DIO-EYFP bol vstreknutý do MEC, takže neuróny MEC, ktoré vychytali CAV2-Cre, môžu express eNpHR3.{10}EYFP alebo EYFP (doplnkový súbor 1: obr. S2). Desať, podarilo sa nám inhibovať vstupy MEC v hipokampe hneď po CFC. Podobne ako v predchádzajúcich výsledkoch, optická inhibícia v tomto stave narušila vytváranie pamäte kontextu strachu (obr. 1g, h). Tieto údaje teda ďalej posilňujú náš záver, že vstupy MEC do hipokampu sú rozhodujúce pre tvorbu kontextovej pamäte počas obdobia po učení. Jedným obmedzením v tejto štúdii je nedostatok priestorovej špecifickosti v použitej optickej inhibícii.

Nie je teda jasné, do akej miery a kde presne v hipokampálnom okruhu boli rozšírené vstupy MEC potlačené optickou inhibíciou v našom stave. Presná inhibícia vstupov MEC zameraných na špecifické podpole, ako je CA1 alebo DG hipokampu, môže byť potrebná na objasnenie mechanizmu, ktorým vstupy MEC prispievajú k vytvoreniu kontextovej pamäte strachu v budúcej štúdii. Aj keď sme v tejto štúdii netestovali účinok optickej inhibície vstupov MEC do hipokampu v rôznych časových bodoch po kontextovom kondicionovaní strachu, predchádzajúce štúdie uvádzajú časovo závislú úlohu mozgových aktivít po učení pri konsolidácii spomienok závislých od hipokampu, ako je kontextové podmieňovanie strachu. Napríklad pomocou optogenetickej stratégie predchádzajúca štúdia umelo manipulovala s indukciou spánku s pomalými vlnami (SWS) v rôznych časových bodoch po rôznych vzdelávacích úlohách a ukázalo sa, že existuje kritické časové okno (do 30 minút), počas ktorého SWS vyvolal svetlom môže zlepšiť spomienky závislé od hipokampu [14].

Obr. 1 inhibícia vstupu MEC do hipokampu bezprostredne po zarobení zhoršuje dlhodobú kontextovú tvorbu pamäte strachu. a Schematické znázornenie bilaterálnej AAVinekcie a miesta implantácie optického ferule (vľavo). Reprezentatívne obrázky conkocalmikroscopk zobrazujúce expresiu EGFP a eNpHR0-EYFP v MEC hore) a v hipokampe (dole). Hviezdička označuje približnú polohu hrotu optického vlákna. b Schéma správania. Histogram znázorňujúci úroveň zamrznutia počas testeNpHR30 okolo（3589主 3,21 percenta ,n=】1】 ukázal výrazne menej mrzutého šperku v porovnaní s kontrolnou skupinou EGFP (53,13±265 percent ,n{12}}) v LTM test.**s<00005; students="" t-test.behavior="" scheme.e="" histogram="" shoving="" freezing="" level="" during="" the="" test.enphr3.0(5031±290%,n="1l)and" egfp(4831±427%,n="10group" showed="" similar="" feinglevelin="" utm="" tes.p="">005:Test študentov nie je významný,f Stratégia iniciácie CAV a AAV alebo retrográdne značenie MEC neurónového poškodenia hipokampu(f) Schematické znázornenie obojstrannej CW injekcie AW injekcie a schémy správania v mieste implantácie optického ferule (vpravo). h Histogram zobrazujúci úroveň zamŕzania počas testu.eNpHR3.0 skupina (33,71±4,06 percent ,n=11) ​​ukázal výrazne nižšiu úroveň zmrazenia v porovnaní s kontrolnou skupinou EYFP (50,13±3,18 percenta,n=12) v teste LIM .**s<0005; student's="" t-test="" data="" are="" presented="" as="">

Je zaujímavé, že ďalšia štúdia na potkanoch ukázala, že selektívne elektrolytické lézie priamej entorinálnej projekcie (temporoammonická, TA) do oblasti hipokampu CA1 24 h, ale nie 3 týždne po tréningu Morrisovho vodného bludiska, narušili vytváranie priestorovej pamäte na diaľku čas, čo naznačuje, že interakcia MEC-hipocampus cez vstupnú dráhu TA počas tohto časového obdobia je potrebná na konsolidáciu systémov [15]. Vzhľadom na tieto zistenia je vysoko pravdepodobné, že vstupy MEC do hipokampu majú časovo závislú úlohu pri vytváraní nedávnej a vzdialenej kontextovej pamäte strachu.

V našej štúdii je zaujímavé, že taká krátka doba (5 minút) post-tréningovej optogenetickej inhibície stačila na to, aby sa zhoršila tvorba kontextovej pamäte. Jedna interpretácia je, že naše výsledky môžu odrážať čiastočný blok konsolidačných udalostí, ktoré sú potrebné na normálnu tvorbu pamäte. V súlade s týmto popisom bola v našom stave čiastočne narušená pamäť. Ďalšou možnosťou je, že v tomto krátkom časovom bode potrebnom na vytvorenie kontextovej pamäte strachu môže nastať kritická udalosť. Jednou z možností je, že vstup MEC môže byť rozhodujúci pre spustenie zvlnenia alebo zubatých hrotov v hipokampe, ktoré sú v korelácii s prehrávaním predtým zažitých udalostí [7, 9, 10, 16] a optogenetická inhibícia vstupu MEC môže narušiť takéto vzorce aktivity. Alternatívne môže krátka inhibícia vstupu MEC ovplyvniť následný spánok s pomalými vlnami, ktorý má tiež rozhodujúce časové okno z hľadiska konsolidácie pamäte závislej od hipokampu [14].

Referencie

1. Eichenbaum H. Kortikálno-hipokampálny systém pre deklaratívnu pamäť. Nat Rev Neurosci. 2000;1(1):41–50.

2. Suh J, Rivest AJ, Nakashima T, Tominaga T, Tonegawa S. Vstup vrstvy III entorhinálnej kôry do hipokampu je rozhodujúci pre časové spojenie

3.pamäť. Veda. 2011;334(6061):1415–20. Kitamura T, Pignatelli M, Suh J, Kohara K, Yoshiki A, Abe K, et al. Ostrovné bunky riadia dočasnú asociačnú pamäť. Veda. 2014;343(6173):896–901.

4. Kitamura T, Sun C, Martin J, Kitch LJ, Schnitzer MJ, Tonegawa S. Entorhinálne bunky kortikálneho oceánu kódujú špecifické kontexty a poháňajú kontextovo špecifickú pamäť strachu. Neuron. 2015;87(6):1317–31.

5. Buzsaki G, Horvath Z, Urioste R, Hedtke J, Wise K. Vysokofrekvenčná sieť

6.kmitanie v hipokampe. Veda. 1992;256(5059):1025–7.Bragin A, Jando G, Nadasdy Z, Vanlandeghem M, Buzsaki G. Dentate EEG hroty a súvisiace interneuronálne populačné výbuchy v hipokampálnej hilovej oblasti potkana. J Neurophysiol. 1995;73(4):1691–705.

7. Chrobak JJ, Lorincz A, Buzsaki G. Fyziologické vzorce v systéme hipokampálno-entorinálnej kôry. Hippocampus. 2000;10(4):457–65.

8. Girardeau G, Zugaro M. Hippokampálne vlnky a konsolidácia pamäte. Curr Opin Neurobiol. 2011;21(3):452–9.

9. Yamamoto J, Tonegawa S. Priamy vstup mediálneho entorinálneho kortexu do hipokampálneho CA1 je rozhodujúci pre predĺžené prehrávanie v pokojnom stave. Neuron. 2017;96(1):217–27.

10. Nokia MS, Gureviciene I, Waselius T, Manila H, Penttonen M. Elektrická stimulácia hipokampu narúša asociatívne učenie, keď je zameraná na zubaté hroty. J Physiol-London. 2017;595(14):4961–71.

11. Wehner JM, Silva A. Význam kmeňových rozdielov pri hodnotení procesov učenia a pamäte u nulových mutantov. Ment Retard Dev Disabil Res Rev. 1996; 2 (4): 243–8.

12. Vetere G, Kenney JW, Tran LM, Xia F, Steadman PE, Parkinson J a kol. Chemogenetické skúmanie siete pamäte strachu v celom mozgu u myší. Neuron. 2017;94(2):363–74.

13. Insausti R, Herrero MT, Witter MP. Entorhinálna kôra potkana: cytoarchitektonické pododdelenia a pôvod a distribúcia kortikálnych aferentov. Hippocampus. 1997;7(2):146–83.

14. Lu Y, Zhu ZG, Ma QQ, Su YT, Han Y, Wang X a kol. Kritické časové okno pre selektívnu indukciu konsolidácie hipokampálnej pamäte krátkou epizódou spánku s pomalými vlnami. Bulletin neurovedy. 2018;34(6):1091–9.

15. Remondes M, Schuman EM. Úloha kortikálneho vstupu do hipokampálnej oblasti CA1 pri konsolidácii dlhodobej pamäte. Príroda. 2004;431(7009):699–703.

16. O'Neill J, Boccara CN, Stella F, Schoenenberger P, Csicsvari J. Povrchové vrstvy mediálneho entorinálneho kortexu sa prehrávajú nezávisle od hipokampu. Veda. 2017;355(6321):184–8.