Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Pls kliknite sem pre časť 1

Pls kliknite sem pre časť 3

Cistanche môže zlepšiť pamäť

Na základe týchto zistení sme ďalej skúmali, či upregulovaná hipokampálna miR-466f{1}}p expresia u myší pri priestorovom učení aPamäťtvorba tiež ovplyvnila morfológiu neurónov in vivo. Významne sme zistili, že priemerná hustota chrbtice hipokampálnych neurónov myší GLN bola vyššia ako hustota PLN myší, ako to odhalila Golgiho impregnácia pyramídovej

Obrázok 3. Účinky zmeny úrovní expresie hipokampu miR-466f-3p na výkonnosť myši MWM

(A) Experimentálna časová os úlohy MWM, analýza expresie alebo elektrofyziologické meranie mozgu myší po injekcii lentivírusu.

(B) Ľavé panely: expresia dsRed v myšom hipokampe. Reprezentatívne IF snímky hipokampu s nízkym a vysokým zväčšením od myší infikovaných rekombinantnými lentivírusmi s dsRed-only ako kontrola (ľavý stĺpec obrázkov) alebo miR-466f-3p plus dsRed (vpravo stĺpec obrázkov). Orámované oblasti dvoch horných obrázkov sú zväčšené a zobrazené nižšie. Mierka, 100 mm. Bodkované čiary označujú hranice DG. Jadrá boli zafarbené DAPI. GCL, vrstva granulových buniek; ML, molekulárna vrstva. Pravý histogram, relatívne hladiny expresie miR-466f-3p v myšom hipokampe infikovanom lentivírusom exprimujúcim kontrolu alebo miR-466f{10}}p, ako sa stanovilo pomocou RT-qPCR ( n=16 na skupinu).

(C) MWM výkony myší infikovaných rôznymi rekombinantnými lentivírusmi, zabalených s použitím piatich rôznych plazmidov exprimujúcich dsRed-only, miR-466f-3p, mut-miR-466f{ {5}}p a miR/SCR-špongie, v tomto poradí, do ich hipokampu (n=13, 26, 16, 19, respektíve 11 na skupinu). Ľavý panel: úniková latencia počas tréningu. Pravý panel: individuálna úniková latencia na 6. relácii.

Údaje uvedené v (B) sú uvedené ako priemer ± SD a údaje uvedené v (C) sú uvedené ako priemer ± SEM. Štatistická významnosť bola hodnotená nepárovým t testom (B), dvojcestným ANOVA s Bonferroniho post hoc porovnaním (C, ľavý panel) alebo jednou ANOVA s Tukeyho post hoc testom (C, pravý panel). Štatistické rozdiely: #p < 0.05,="" **/##p="">< 0,01="" a="" ****p="">< 0,0001;="" *mir-466f{10}}p="" oproti="" ostatným;="" #mir-huba="" verzus="">

neuróny v GLN a PLN myšom hipokampe (obrázok S3). Tieto zistenia ukazujú, že upregulácia hipokampálneho miR-466f{2}}p podporuje rast neuritov a tvorbu dendritickej chrbtice, čo je podobné indukcii hustoty chrbtice pozorovanej v hipokampe myší GLN v porovnaní s myšami PLN.

miR-466f{1}}p pozitívne moduluje priestorové učenie myši aPamäťvýkon, ako aj synaptickú plasticitu

Ak chcete zistiť, či miR-466f{1}}p pozitívne reguluje priestorové učenie myši aPamäťPri tvorbe sme použili prístup rekombinantnej lentivírusovej infekcie na nadmernú expresiu miRNA v myšom hipokampe. Myši sa analyzovali 7 dní po injekcii lentivírusu do DG (obrázok 3A). Reprezentatívne snímky hladín hip-expresie miR-466f{4}}p boli skutočne zvýšené v skupine s nadmernou expresiou miR-466f-3p v porovnaní s kontrolnou skupinou (pravý histogram na obrázku 3B). Zistili sme, že myši s hipokampálnou nadmernou expresiou miR-466f- 3p a podrobené úlohe MWM vykazovali únikové latencie 88 ± 5 s v 1. relácii a 19 ± 1 s v 6. relácii (červená bodková čiara, obrázok 3C), ktoré boli lepšie ako u myší s vektorovou kontrolou (čierna čiara) alebo mutantných kontrolných myší (čiara s červeným kruhom) a podobné únikovým latenciám myší GLN opísaným na obrázku 1A. Paralelne sme skúmali vplyv straty funkcie miR-466f{19}}p na priestorové učenie aPamäťinhibíciou miR-466f{1}}p pomocou miR-špongie. Je pozoruhodné, že výkon MWM myší, u ktorých bol hipokampálny miR-466f{4}}p zachytený miR-špongiou, bol podobný ako u myší PLN, tj nenaučili sa nájsť platformu ani po posledná relácia (plná zelená štvorcová čiara,

Obrázok 3C). Okrem toho sa nezdalo, že myši, ktorým bol podaný lentivírus, narušili homeostatickú plasticitu, pretože niektoré myši v každej skupine sa naučili alebo aspoň boli v procese učenia počas poslednej relácie (obrázok 3C, pravý histogram).

Vzhľadom na to, že nadmerná expresia miR-466f{1}}p v myšom hipokampe zlepšila ich učenie aPamäťanalyzovali sme komparatívnu elektrofyziológiu kultivovaných hipokampálnych neurónov exprimujúcich rôzne úrovne miR-466f{1}}p. Miniatúrny excitačný postsynaptický prúd (mEPSC) z hipokampálnych neurónov DIV14 nadmerne exprimujúcich miR-466f-3p alebo mut-miR-466f-3p, miR-špongiu alebo kontrolu zaznamenané pomocou celobunkových náplasťových svoriek. Zatiaľ čo medzi štyrmi súbormi vzoriek neboli žiadne významné rozdiely v amplitúde mEPSC, vzostupe Tau alebo poklese Tau, frekvencia mEPSC neurónov nadmerne exprimujúcich miR-466f-3p bola významne vyššia v porovnaní s ďalšie skupiny (obrázok 4A), čo naznačuje, že postsynaptické glutamínergné receptory boli silnejšie aktivované po nadmernej expresii miR-466f{15}}p.

Potom sme merali dlhodobú potenciáciu (LTP), aby sme priamo určili úlohu miR-466f-3p v synaptickej plasticite in vivo. Do hipokampu myší sme injikovali rekombinantný lentivírus, ako je opísané na obrázku 3, a potom sme indukovali rezy hippocampalov LTP tetanickou stimuláciou (tri série vysokofrekvenčnej stimulácie [3xHFS]) Schafferovej kolaterálnej dráhy. Zistili sme, že náš protokol indukoval LTP vo všetkých skupinách, o čom svedčí pretrvávajúci nárast poľných excitačných postsynaptických potenciálov (fEPSP) v oblasti cornu ammonis 1 (CA1) (obrázok 4B, ľavý panel). LTP bol silnejší v rezoch s nadmernou expresiou miR-466f{10}}p (188 percent ± 2 percentá základnej hodnoty 40–50 minút po stimulácii, priemer ± SEM) v porovnaní s mutantmi (169 percent ± 1 percento východiskovej hodnoty), huba SCR (173 percent ± 3 percentá východiskovej hodnoty) a rezy infikované kontrolným vírusom (159 percent ± 2 percentá východiskovej hodnoty), ako inhibícia miR-466f-3p miR-huba znížila LTP (128 percent ± 1 percento základnej línie) v porovnaní s kontrolami (obrázok 4B, pravý panel). Tiež sme merali LTP skupín GLN a PLN po tréningu. Príslušné údaje tiež odhalili významné rozdiely v sklone fEPSP v oblasti CA1 medzi skupinami GLN a PLN (obrázok 4C). Zvýšená hladina miR-466f-3p teda zvyšuje LTP a synaptickú plasticitu, čo zase môže podporiť učenie aPamäťschopnosti myší. Údaje uvedené na obrázkoch 2, 3 a 4 spolu ukazujú, že miR-466f-3p hrá rozhodujúcu pozitívnu úlohu v priestorovom učení aPamäťformácie, pravdepodobne zvýšením tvorby chrbtice, LTP a sily synaptickej plasticity.

Mef2a mRNA je regulačným cieľom miR-466f-3p

Vykonali sme bioinformatickú analýzu s cieľom identifikovať potenciálne cieľové mRNA regulované väzbou miR-466f{1}}p na ich 30 UTR. Medzi kandidátmi, ktorých sme identifikovali, bola Mef2a mRNA kódujúca MEF2A. Je zaujímavé, že predtým sa zistilo, že expresia MEF2A bola po tréningu MWM znížená a nadmerná expresia tohto faktora mala negatívny vplyv na výkon myší (Cole et al., 2012). Preto sme použili luciferázový reportérový test na preskúmanie, či miR-466f{8}}p reguluje transláciu mRNA Mef2a väzbou na jej 30 UTR. Vložili sme divoké alebo mutantné sekvencie Mef2a 30 UTR downstream od cDNA luciferázy riadenej SV40-promótorom (Luc), čo viedlo k reportérovému plazmidu psiCHECK2-MEF2A 30 UTR alebo psiCHECK2- mut-MEF2A 30 UTR (obrázok 5A). Ako je znázornené na ľavom histograme na obrázku 5B, koexpresia miR-466f-3p zoslabila expresiu luciferázy riadenej Mef2a 30 UTR. Zdá sa, že tento účinok závisí od interakcie medzi miR-466f-3p a Mef2a 30 UTR, pretože mutácia buď predpovedaného väzbového miesta miR-466f-3p na Mef2a 30 UTR (50-UGU- GUAU-30) alebo počiatočná oblasť miR-466f-3p (50-AUACACA-30) rozpoznanie Mef2a 30 UTR zrušilo inhibičný účinok miR-466f-3p na aktivitu luciferázy (obrázok 5B, stredný histogram). Okrem toho spoločná expresia miR-špongie, ale nie CR špongie, tiež eliminovala represívny účinok miR-466f-3p na aktivitu luciferázy (obrázok 5B, pravý histogram). Pozoruhodné je, že ani nadmerná expresia miR-466f-3p, ani miR-huba nemali žiadny vplyv na hladiny mRNA Mef2a v primárnych hipokampálnych neurónoch (obrázok 5C), ale znížili alebo zvýšili, resp. hladina proteínu MEF2A (obrázok 5D). Zistili sme tiež, že nadmerná expresia miR-466f{63}}p alebo miR-špongie znížila alebo zvýšila hladinu mRNA cytoskeletálneho asociovaného proteínu (Arc) regulovaného aktivitou v primárnych hipokampálnych neurónoch (obrázok 5C) , čo bol známy downstream cieľ pozitívne regulovaný MEF2A (Flavell et al., 2006)

Vykonali sme tiež fluorescenčnú in situ hybridizáciu (FISH) na detekciu miR-466f{1}}p a skombinovali sme ju s IF značením MEF2A v primárnych hipokampálnych neurónoch DIV14 bez liečby forskolínom alebo s ňou. Je známe, že forskolín indukuje chemický LTP a aktivuje adenylylcyklázu, čím zvyšuje intracelulárne hladiny cAMP. Pozorovali sme jadrovú kolokalizáciu MEF2A s miR-466f- 3p, ako ilustrujú reprezentatívne obrázky na obrázku 5E. Po stimulácii forskolínom sa však signál miR-466f-3p zvýšil v soma aj v dendritoch, zatiaľ čo signál MEF2A v

jadro sa zmenšilo, ako ukazujú recipročné zmeny intenzít signálov MEF2A a Fast Red jednotlivých neurónových buniek (obrázok 5E). V súhrne údaje na obrázkoch 5A–5E naznačujú, že miR-466f{5}}p negatívne reguluje expresiu proteínu MEF2A väzbou na 30 UTR mRNA Mef2a a následne potláča jeho transláciu.

V súlade s vyššie opísanými výsledkami sme zistili, že hipokampálne hladiny proteínu MEF2A boli znížené u myší GLN po tréningu MWM, ale nie u myší PLN (obrázok 5F). Okrem toho relatívne hladiny MEF2A u jednotlivých myší GLN (bodky) a myší PLN (štvorce) nepriamo korelovali s hladinami miR-466f-3p (R=0,60, Obrázok 5G). Teda heterogénne vzorce priestorového učenia aPamäťschopnosti sú modulované stochastickým zvýšením hipokampálnej miR- 466f{1}}p u jednotlivých myší a následným znížením MEF2A po stimulácii neuronálnej aktivity.

Stochastická aktivácia hipokampálneho CREB a následná transkripčná upregulácia miR- 466-669 klastra počas tréningu MWM

Skúmali sme mechanizmy, pomocou ktorých môže byť miR-466f{1}}p v myšom hipokampe stochasticky regulovaný úlohou MWM. Existujú tri prekurzory miRNA kódujúce miR-466f{3}}p, z ktorých všetky patria do klastra miR-466-669 špecifického pre hlodavce, ktorý sa nachádza v intróne 10 jeho hostiteľského génu, mSfmbt2 (Inoue et al. ., 2017) (obrázok 6A). Zaujímavé je, že na rozdiel od miR-466f-3p nebol medzi skupinami GLN a PLN žiadny významný rozdiel v hladinách expresie mSfmbt2 (obrázok 6B), čo naznačuje, že klaster miR{14}} môže kódovať samostatný transkript namiesto toho, aby bol súčasťou primárneho prepisu mSfmbt2. V súlade s tým sme navrhli niekoľko súborov primérov na identifikáciu predpokladaného primárneho transkriptu miR-466-669 klastra pomocou RT-qPCR. Ako je znázornené na obrázku 6A, dlhý fragment PCR (plus 282 až 2381) spolu so sériou prekrývajúcich sa pásov qPCR, konkrétne A (plus 282 až 115), B (131 až 406), C (388 až 686), D ( 662 až 1 028), E ( 1 004 až 1 299), F ( 1 242 až 1 629), G ( 1 605 až 2 029) a H ( 2 005 až 2 381) bolo možné detegovať v myšom hipokampe, ale nie v časti I. až 7 76 ( 2, 3 ) (údaje nie sú uvedené). Tieto údaje podporujú, že miR-466-669 klaster kódoval dlhý transkript v blízkosti približne 2 388 bp upstream od prvého miRNA prekurzora (tj pre-mir-466}m, označený plus 1 na obrázku 6A). Je pozoruhodné, že podobne ako to, čo sme našli pre miR-466f{59}}p, bola priemerná hladina tohto transkriptu v hipokampe myší GLN vyššia ako u myší PLN (obrázok 6C). Takto sa zlepšilo učenie aPamäťschopnosť GLN myší je spôsobená transkripčnou aktiváciou miR-466-669 klastra.

Aktivácia jadrového CREB fosforyláciou počas úloh MWM alebo v iných formách učenia je kritickým krokom na premenu krátkodobého na dlhodobé.Pamäť(Lisman a kol., 2018; Rogerson a kol., 2014). Preto sme skúmali, či môžu rôzne úrovne miR-466f{4}}p medzi jednotlivými myšami, ktoré podstúpili úlohu MWM, korelovať so stavom aktivácie CREB. Aby sme túto myšlienku preskúmali, najprv sme skúmali hladiny fosforylácie hipokampálneho CREB u jednotlivých myší. Ako je znázornené na obrázku 6D, aktivácia CREB (fosforyláciou na zvyšku S-133) bola zvýšená u myší GLN v porovnaní s myšami PLN a HC. Tiež sme potvrdili, že miR-466f{8}}p bol skutočne koexprimovaný s pCREB v neurónoch vykonaním miRNA ISH v kombinácii s IF farbením pCREB a MAP2 v primárnych hipokampálnych neurónoch (obrázok S2A). Okrem toho hladiny primárnych transkriptov klastra miR- 466-669 pozitívne korelovali s pCREB u myší GLN (R=0.52), kým negatívne korelovali s pCREB u myší PLN (R=0 71) (obrázok 6E). Skontrolovali sme koreláciu medzi hladinami ďalšieho aktívneho faktora, fosfo-extracelulárnym signálom regulovanej kinázy (pERK), a hladinami primárnych transkriptov miR-466-669 klastra. Zistili sme, že oba typy myší trénovaných MWM vykazovali pozitívne korelácie medzi miR-466-669 klastrovým signálom a pERK (R=0,59 a 0,48, v tomto poradí; obrázok S4A) a nebol žiadny rozdiel v pERK/ Expresia tERK medzi týmito dvoma skupinami (obrázok S4B). Aby sme ďalej objasnili vplyv aktivácie CREB na transkripčnú lupreguláciu ich R-466-669klastra a následne,

indukcia miR-466f{1}}p, použili sme špecifický inhibítor CREB,666- 15 (Xie et al., 2015), v kombinácii s forskolínovou liečbou primárnych hipokampálnych neurónov DIV14. Je známe, že forskolín aktivuje fosforyláciu CREB (Malhotra et al., 2015). Zistili sme, že predbežné ošetrenie primárnych hipokampálnych neurónov pomocou 666-15 blokovalo forskolínom indukovanú aktiváciu CREB (obrázok 6F) a znížilo hladiny miR-466f{10}}p a miR{11}} klastra transkript (obrázky 6G a 6H). Súčasne sa po liečbe 666-15 znížili aj hladiny mRNA známych cieľových génov pCREB nurr1 a homer1a (Bridi a kol., 2017; Jensen a kol., 2017) (obrázok 6H). Celkovo, obrázok 6 ukazuje, že stochastická aktivácia CREB v hipokampe subpopulácie inbredných myší podstupujúcich úlohu MWM indukuje transkripciu klastra miR-466-669 a následne indukciu miR-466f{{23 }}p, čím sa zlepší ich priestorové učenie aPamäťschopnosť vykonávať lepšie úlohy.

DISKUSIA

Skúmali sme možnú úlohu miRNA pri modulácii rôznych schopností priestorového učenia aPamäťmedzi inbrednými myšami C57BL/6J. Navrhujeme, že stochastická aktivácia CREB a následná upregulácia hipokampálneho miR-466f{3}}p zodpovedá za väčšie priestorové učenie aPamäťschopnosť podskupiny našich testovacích myší, pravdepodobne v dôsledku miR-466f{1}}p sprostredkujúcej inhibíciu translácie Mef2a mRNA, ktorá kódujePamäťnegatívny regulátor MEF2A. Naše zistenia poskytujú scenár demonštrujúci funkčnú a evolučnú úlohu špecifickej miRNA pri regulácii poznania prostredníctvom stochastickej indukcie osi CREB-pCREB-miR-466f{4}}p-MEF2A stimulmi prostredia.

Úloha MWM sa široko používa na preskúmanie rôznych schopností priestorového učenia aPamäťpre hlodavce. Za normálnych podmienok používajú hlodavce distálne signály na orientáciu, čo im umožňuje naučiť sa a zapamätať si polohu skrytej plošiny v úlohe. Väčšina našich testovaných inbredných myší C57BL/6J (62 percent) vykazovala normálny vzor únikovej latencie, pričom platformu našli do 30 s pri reláciách 3.-6 (obrázok 1A, GLN). Naproti tomu skupina myší (38 percent ) sa úlohu nenaučila ani do 6. sedenia (PLN). Pozoruhodné je, že sme myši podrobili aj dvom ďalším testom rozpoznávania. Prvým bol test rozpoznávania nových objektov (NOR), čo je jediná skúška založená na vrodenom skúmaní bez posilňovania alebo stresu na motiváciu správania (Leger a kol., 2013). Korelácia medzi úlohami NOR a MWM, pokiaľ ide o výkonnosť myši, je slabá (R {{1{{20}}}}.13), čo je podobné ako korelácia medzi výkonnosťou NOR a úrovňami expresie v hipokampe miR-466f-3p (R=0.01; údaje nie sú zobrazené). Test NOR tiež neodhalil žiadne rozdiely v diskriminačnom indexe medzi skupinami MWM GLN a PLN (0,36 ± 0,25 oproti 0,29 ± 0,18; obrázok S1B). Ostatné priestorové učenie aPamäť-závislou úlohou, ktorú sme použili, je Barnesov bludisko (BM), ktoré je podobné MWM. Vychádza z predpokladu, že hlodavce umiestnené do averzívneho prostredia by sa mali naučiť a zapamätať si umiestnenie únikového boxu umiestneného pod povrchom plošiny. Ako je znázornené na obrázku S1C, zistili sme, že výkony myší v štúdiách so sondou BM tiež pozitívne korelujú s hladinami hipokampálnej expresie miR-466f-3p. Indukcia osi CREB-pCREB-miR-466f-3p-MEF2A v hipokampe počas učenia aPamäťformovanie je priestorovo závislé od kontextu.