Časť 1: Akteozid pôsobí proti interleukínom{1}}indukovaným katabolickým procesom prostredníctvom modulácie mitogénom aktivovaných proteínkináz a NFκB bunkovej signálnej dráhy

Akteozid pôsobí proti interleukínom-1 -indukovaným katabolickým procesom prostredníctvom modulácie mitogénom aktivovaných proteínkináz a NFκB bunkovej signálnej dráhy

HyangI Lim ,1 Do Kyung Kim ,1 Tae-Hyeon Kim ,1 Kyeong-Rok Kang ,1 Jeong-Yeon Seo ,1,2 Seung Sik Cho ,3 Younghee Yun ,4,5 Ye-yong Choi ,4,5 Jungtae Leem ,4,5 Hyoun-Woo Kim ,6 Geon-Ung Jo ,6

Chan-Jin Oh, 6 Deuk-Sil Oh, 6 Hong-Sung Chun, 2 a Jae-Sung Kim 1

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com

1Ústav zubných vied, Chosun University, Gwangju 61452, Kórejská republika

2Katedry biomedicínskych vied, Chosun University, Gwangju 61452, Kórejská republika

3Katedra biomedicíny, vied o konvergencii zdravia a života, BK21 Four, College of Pharmacy, Mokpo National University,

Jeonnam 58554, Kórejská republika

4Chung-Yeon Medical Institute, Gwangju 61949, Kórejská republika

5 Inštitút pre výskum a vývoj, CY Pharma Co., Soul 06224, Kórejská republika

6Jeollanamdo Forest Resources Institute, Naju, Jeollanamdo, 58213, Kórejská republika

Korešpondenciu treba adresovať Jae-Sung Kimovi; js_kim@chosun.ac.kr

Prijaté 2. júla 2020; Revidované 15. februára 2021; Prijaté 6. marca 2021; Zverejnené 25. marca 2021

Akademický redaktor: Joël R. Drevet

Copyright © 2021 HyangI Lim a kol. Toto je článok s otvoreným prístupom distribuovaný pod licenciou CreativeCommonsAttributionLicense,

ktorý umožňuje neobmedzené používanie, distribúciu,a rozmnožovanie na akomkoľvek médiu za predpokladu, že pôvodné dielo je riadne citované.

cistanche môže liečiť ochorenie obličiek zlepšiť funkciu obličiek

Osteoartritída (OA) je najčastejším degeneratívnym kĺbovým ochorením s chronickou bolesťou kĺbov spôsobenou progresívnou degeneráciou kĺbovej chrupavky v synoviálnych kĺboch.akteozid, kafeoylfenyletanoidový glykozid, má rôzne biologické aktivity, ako je antimikrobiálny, protizápalový, protirakovinový, antioxidačný, cytoprotektívny a neuroprotektívny účinok. Ďalej orálne podávanieakteozidpri vysokých dávkach nespôsobuje genotoxicitu. Cieľom tejto štúdie je preto overiť antikatabolické účinkyakteozidproti artróze a jej antikatabolickej signálnej dráhe.akteozidneznížili životaschopnosť myších fibroblastových buniek L929 používaných ako normálne bunky a primárne potkanie chondrocyty.akteozidpôsobilo proti IL-1 -indukovanej strate proteoglykánov v chondrocytoch a kĺbovej chrupavke potlačením expresie a aktivácie enzýmov degradujúcich chrupavku, ako sú matrix metaloproteináza- (MMP-) 13, MMP-1 a MMP{{ 6}}. ďalejakteozidpotlačil expresiu zápalových mediátorov, ako je indukovateľná syntáza oxidu dusnatého, cyklooxygenáza-2, oxid dusnatý a prostaglandín E2 v primárnych chondrocytoch potkanov liečených IL-1. Následne bola expresia prozápalových cytokínov znížená oakteozidv primárnych potkaních chondrocytoch liečených IL-1. Okrem toho akteozid potláčal nielen fosforyláciu mitogénom aktivovaných proteínkináz v primárnych chondrocytoch potkanov ošetrených IL-1, ale aj translokáciu NFκB z cytosolu do jadra potlačením jeho fosforylácie. Perorálne podanie 5 a 10 mg/kg akteozidu zoslabilo progresívnu degeneráciu kĺbovej chrupavky v modeli osteoartrózy u myší generovanú destabilizáciou mediálneho menisku. Naše zistenia naznačujú, že akteozid je sľubným potenciálnym antikatabolickým činidlom alebo doplnkom na zmiernenie alebo prevenciu progresívnej degenerácie kĺbovej chrupavky.

Pls kliknite sem pre časť 2

1. Úvod

Osteoartritída (OA) je najčastejším degeneratívnym kĺbovým ochorením s chronickou bolesťou kĺbov spôsobenou progresívnou degeneráciou kĺbovej chrupavky v synoviálnych kĺboch ​​[1].

V dôsledku predĺženia strednej dĺžky života sa prevalencia OA so stratou pohyblivosti a chronickou bolesťou kĺbov spôsobenou progresívnou degeneráciou kĺbovej chrupavky v synoviálnych kĺboch ​​odhaduje na 18 percent a 9,6 percent u žien po menopauze au mužov [2] ]. Hoci celosvetová prevalencia OA každoročne narastá, patofyziologická etiológia OA je stále neznáma. Môže to byť spôsobené veľmi zložitými a multifaktoriálnymi rizikovými faktormi, ako je starnutie, pohlavie, genetická dedičnosť, traumatické poranenie kĺbov a silné mechanické zaťaženie kĺbov. Okrem toho nie sú známe neuropatologické vzťahy medzi progresívnou degeneráciou kĺbovej chrupavky a rozvojom chronickej bolesti kĺbov [3]. Cieľom klinického manažmentu u pacientov s OA je teda udržanie telesnej pohyblivosti a mechanickej funkcie kĺbov prostredníctvom úľavy od chronickej bolesti kĺbov pomocou farmakologických a nefarmakologických prístupov a chirurgických náhrad kĺbov. Požiadavka na rozvoj efektívnej intervencie alebo suplementácie s dlhodobou biologickou bezpečnosťou na prevenciu alebo zmiernenie OA na udržanie kvality života prostredníctvom zachovania mechanickej funkcie kĺbov u staršej populácie.

Ako je znázornené na obrázku 1,akteozid(CAS č. 61276-17-3; C29H36O15) je kafeoylfenyletanoidový glykozid izolovaný z niekoľkých bylinných rastlín, ako sú Verbascum chloridy [4], Buddleja globosa [5] a Plantago australis [6]. Acteoide má rôzne biologické aktivity, ako sú antimikrobiálne [5], protizápalové [7], protirakovinové [8], antioxidačné [9], cytoprotektívne [9] a neuroprotektívne účinky [10]. Ďalej orálne podávanieakteozidpri vysokých dávkach nespôsobuje genotoxicitu[11].

Preto sme predpokladali, že akteozid s protizápalovou biologickou bezpečnosťou má antikatabolické účinky spojené s ochranou kĺbovej chrupavky pred progresívnou degeneráciou kĺbovej chrupavky prostredníctvom potlačenia katabolických faktorov, ako sú prozápalové cytokíny, zápalové mediátory a chrupavky gradujúce v synoviálnej chrupavke. . Preto bolo cieľom tejto štúdie preskúmaťakteozid-indukovali antikatabolické účinky a jeho bunkovú signálnu dráhu ako in vitro, s použitím primárnych chondrocytov izolovaných z kĺbovej chrupavky kolenného kĺbu potkana, tak aj in vivo s použitím zvieracieho modelu OA vytvoreného chirurgickou destabilizáciou mediálneho menisku v kolennom kĺbe myší.

akteozidvcistanchemôcťzlepšiťimunita

2. Metódy

2.1. Bunková kultúra.

Primárne potkanie chondrocyty boli izolované z kĺbovej chrupavky potkaních (5-dňových; Sprague-Dawley) kolenných kĺbov v súlade s protokolom (CIA-CUC2019-A0027) schváleným ústavom Výbor pre starostlivosť a používanie zvierat Chosun University, Gwangju, Kórejská republika. Izolované primárne potkanie chondrocyty sa udržiavali v Dulbeccovom modifikovanom Eagleovom médiu/živinovej zmesi F-12 (DMEM/F12) (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) doplnenom 10 percentným fetálnym bovinným sérom (FBS) (Life Technologies , Grand Island, NY, USA), antibiotiká (50 U/ml penicilínu a 50 ug/ml streptomycínu) a 50 ug/ml kyseliny askorbovej. Normálna myšacia fibroblastová L-929 bunková línia bola zakúpená od American Type Culture Collection (ATCC). Podľa inštrukcií poskytnutých z ATCC boli L-929 bunky kultivované v Eagleovom minimálnom esenciálnom médiu obsahujúcom 10 percent FBS a boli pestované vo zvlhčenom inkubátore pri 37 stupňoch s 5 percentami CO2.

2.2. Test bunkovej životaschopnosti.

Test dimetyltiazolyldifenyltetrazoliovej soli (MTT) sa uskutočnil na vyhodnotenie životaschopnosti buniek myšacej fibroblastovej bunkovej línie L929 použitých ako normálne bunky a primárnych potkaních chondrocytov ošetrených akteozidom. Stručne povedané, bunky L929 a primárne potkanie chondrocyty sa kultivovali pri hustote buniek 8 x 105 buniek/ml v kultivačných platniach počas 24 hodín a potom sa ošetrili 2,5, 5, 10, 25, 50 a 100 uMakteozidpočas 24h. Po ošetrení roztokom MTT sa bunky L929 aj chondrocyty ďalej kultivovali počas 4 hodín. Po inkubácii boli vytvorené MTT kryštály úplne suspendované v dimetylsulfoxide a meraná absorbancia pri 570 nm pomocou spektrometra (Epoch microplate spectrophotometer, BioTek®, Winooski, VT, USA) na posúdenie životaschopnosti buniek.

2.3. Cell Live/Dead Assay.

Prežitie buniek sa uskutočnilo pomocou testovacej súpravy Cell Live/Dead (Molecular Probes, Carlsbad, CA, USA), ktorá sa skladá zo zeleného kalceínu-AM na značenie živých buniek (so zelenou fluorescenciou) a homodiméru etídia-1 na značenie mŕtvych buniek bunky (s červenou fluorescenciou). V stručnosti, bunky L929 aj primárne potkanie chondrocyty sa kultivovali pri hustote buniek 8 x 105 buniek/ml na komorových sklíčkach (systém Nunc® Lab-Tek® Chamber Slide™; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) počas 24 hodín a potom sa ošetrili 50 a 100 uM akteozidu počas 24 hodín. Po kultivácii sa uskutočnil test prežitia buniek podľa pokynov výrobcu. Potom sa zafarbené bunky zobrazili pomocou fluorescenčného mikroskopu (Eclipse TE200; Nikon Instruments, Melville, NY).

2.4. Test dimetylmetylénovej modrej (DMMB).

Test DMMB sa uskutočnil na vyhodnotenie zmeny obsahu proteoglykánu v primárnych chondrocytoch potkanov liečených akteozidom počas 21 dní v prítomnosti alebo neprítomnosti IL-1. Aby sa zachovali charakteristiky primárnych potkaních chondrocytov počas 21 dní, primárne potkanie chondrocyty (2 x 106 buniek) boli suspendované v 1 ml 1,2 percentného alginátu a potom zapuzdrené kvapkaním suspenzie buniek/alginátu do roztoku 105 mM CaCl2. Primárne potkanie chondrocyty zapuzdrené v algináte sa kultivovali 24 hodín v DMEM/F12 (obsahujúcom 10 percent FBS, 50 U/ml penicilínu, 50 ug/ml streptomycínu a 50 ug/ml kyseliny askorbovej) a potom sa adaptovali 24 hodín v DMEM/F12 s obsahom percent mini-inzulín-transferín-selén (mini-ITS) a 50 ug/ml kyseliny askorbovej. Následne boli chondrocyty ošetrené 50 alebo 100 uMakteozidv prítomnosti alebo neprítomnosti 1 ng/ml IL-1 počas 21 dní. V deň 21 sa odobrali primárne potkanie chondrocyty na vyhodnotenie obsahu proteoglykánu pomocou testu DMMB, ako bolo opísané vyššie [12]. Okrem toho, aby sa kvantifikoval obsah proteoglykánu na bunku a vyhodnotila sa proliferácia primárnych potkaních chondrocytov, počet buniek sa meral pomocou DNA testu s použitím PicoGreen (Molecular Probes, Carlsbad, CA), podľa pokynov výrobcu. prítomnosť alebo neprítomnosť 10 ng/ml IL-1 počas 7 dní. Na konci kultivačného obdobia boli vzorky odobraté a fixované v 4% paraformaldehyde počas 72 hodín na histologickú analýzu.

2.6. Histologická analýza.

Uskutočnila sa histologická analýza s použitím safranínu-O a rýchleho zeleného farbenia na overenie straty proteoglykánu v kĺbovej chrupavke ošetrenej 100 uM akteozidom v prítomnosti alebo neprítomnosti 10 ng/ml IL-1 počas 7 dní. Stručne, vzorky fixovanej kĺbovej chrupavky sa odvápnili v kyseline etyléndiamíntetraoctovej a potom sa vložili do parafínu. Potom sa pripravené paraffinové bloky obsahujúce kĺbovú chrupavku sériovo narezali na hrúbku 5 μm a umiestnili sa na sklíčka. Safranín-O a rýchle zelené farbenie sa následne uskutočnili na vyhodnotenie straty proteoglykánu v základnej látke kĺbovej chrupavky. Okrem toho sa uskutočnilo farbenie hematoxylínom a eozínom, aby sa pozorovala všeobecná morfológia kĺbovej chrupavky.

2.7. Western blotting.

Western blotting sa uskutočnil na skúmanie expresie katabolických faktorov vrátane MMP-13, MMP-1, MMP-3, indukovateľnej syntázy oxidu dusnatého (iNOS) a cyklooxygenázy-2 (COX -2) a zmena bunkových signálnych molekúl, ako sú mitogénom aktivované proteínkinázy a nukleárny faktor-kappa B (NFκB). V stručnosti, primárne chondrocyty potkanov boli ošetrené 50 alebo 100 uM akteozidom v prítomnosti alebo neprítomnosti 10 ng/ml IL{10}} počas 24 hodín. Potom boli potkanie primárne chondrocyty zozbierané centrifugáciou a boli lyzované s použitím lyzačného pufra (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) podľa inštrukcií výrobcu. Okrem toho, na overenie jadrovej translokácie NFκB, boli potkanie primárne chondrocyty ošetrené 50 alebo 100 uM akteozidom v prítomnosti alebo neprítomnosti 10 ng/ml IL-1 počas 24 hodín. Potom boli cytosolické a jadrové frakcie extrahované použitím NE-PER™ nukleárnych a cytoplazmatických extrakčných činidiel (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) podľa pokynov výrobcu. Koncentrácia celkového proteínu extrahovaného z primárnych potkaních chondrocytov sa stanovila pomocou súpravy na testovanie proteínu kyseliny bicinchonínovej (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) podľa pokynov výrobcu. Okrem toho sa zozbieralo upravené médium na detekciu hladín enzýmov degradujúcich chrupavku vylučovaných z chondrocytov. Rovnaké množstvá proteínu a upraveného média boli podrobené elektroforéze na dodecylsulfátovo-polyakrylamidovej gélovej elektroforéze (SDS-PAGE) a potom prenesené na nitrocelulózové membrány. Potom sa uskutočnil Western blotting s použitím cielených primárnych protilátok proti MMP-13, MMP-1, MMP-3, iNOS, COX-2, fosfo-ERK1/2, celk. -ERK1/2, fosfo-p38, celkový-p38, fosfo-JNK, celkový JNK, fosfo-NFκB, celkový NFκB, - aktín a lamin B. Imunoreaktívne pásy boli vizualizované pomocou vylepšeného chemiluminiscenčného systému (Thermo Sci- entific, Rockford , IL, USA) podľa pokynov výrobcu a následne zosnímané zariadením Microchemi (DNR Bioimaging Systems, Jerusalem, Izrael).

2.8. Kvantitatívna polymerázová reťazová reakcia (qPCR) a kvantitatívna PCR v reálnom čase (qRT-PCR).

Primárne potkanie chondrocyty boli ošetrené 50 alebo 100 uMakteozidv prítomnosti alebo neprítomnosti 10 ng/ml IL-1 počas 24 hodín. Potom sa z primárnych potkaních chondrocytov izolovala celková RNA pomocou činidla TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) podľa pokynov výrobcu. Celková koncentrácia RNA bola meraná pomocou NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA). Na syntézu cDNA sa 1 ug RNA reverzne transkriboval pomocou systému ThermoScript reverznej transkripcie-PCR (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) podľa pokynov výrobcu. qPCR cDNA sa uskutočnilo s použitím 2x TOPsimple™ DyeMIX-Taq (Enzynomics, Soul, Kórejská republika) a špecifických primerov na zariadení TaKaRa PCR Thermal Cycler Device (TaKaRa Bio Inc., Shiga, Japonsko). Potom boli produkty PCR podrobené elektroforéze na agarózovom géli, aby sa určili úrovne expresie cieľových génov. Glyceraldehyd 3-fosfátdehydrogenáza (GAPDH) sa použila ako endogénna kontrola. Okrem toho pre qRT-PCR bola cDNA amplifikovaná pomocou systému Eco™ Real-Time PCR (illumine Inc., San Diego, CA, USA). -Aktín bol použitý ako endogénna kontrola. Sekvencie primérov použitých v qPCR a qRT-PCR sú zhrnuté v tabuľkách 1 a 2, v tomto poradí.

2.9. Želatínová zymografia.

Na vyhodnotenie aktivácie MMP v primárnych chondrocytoch potkanov sa uskutočnila želatínová zymografia. Stručne povedané, primárne potkanie chondrocyty boli ošetrené 50 alebo 100μM akteozidom v prítomnosti alebo neprítomnosti 10 ng/ml IL-1 počas 24 hodín. Potom sa rovnaký objem upraveného média podrobil elektroforéze na 10 percentnom polyakrylamidovom géli kopolymerizovanom s 0,2 percentami (1 mg/ml) želatínou z bravčovej kože. Po elektroforéze bol gél inkubovaný v zymogramovom renaturačnom tlmivom roztoku (50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM CaCl2, 50 mM NaCl a 0,05 percent Brij-35) pri 37 stupňoch počas 72 hodín. Po renaturácii MMP sa gél zafarbil 0,1 % Coomassie Brilliant Blue R250. Želatinolytické pásy boli odhalené ako číre pásy na pozadí rovnomerne zafarbené svetlomodrou farbou a potom zobrazené pomocou digitálneho fotoaparátu.

2.10. Meranie oxidu dusnatého (NO).

Primárne potkanie chondrocyty boli ošetrené 50 alebo 100 uM akteozidom v prítomnosti alebo neprítomnosti 10 ng/ml IL-1 počas 24 hodín. Potom 50 ul upraveného média reagovalo s 50 ul sulfanilamidu a 50 ul dihydrochloridu N-1-naftyletyléndiamínu. Absorbancia sa potom merala pri vlnovej dĺžke 540 nm pomocou spektrofotometra (Epoch Spectrophotometer, BioTek, Winooski, VT, USA).

2.11. Test prostaglandínu E2 (PGE2).

Primárne potkanie chondrocyty boli ošetrené 50 alebo 100 uMakteozidv prítomnosti alebo neprítomnosti 10 ng/ml IL-1 počas 24 hodín. Potom sa merala koncentrácia PGE2 pomocou súpravy na testovanie parametrov PGE2 (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA) podľa pokynov výrobcu.

2.12. Cytokínové pole.

Primárne potkanie chondrocyty boli ošetrené 50 uM akteozidom v prítomnosti alebo neprítomnosti 10 ng/ml IL-1 počas 24 hodín. Potom boli extrahované celkové proteíny a kvantifikované, ako už bolo opísané [13]. Ďalej sa uskutočnil súbor cytokínov, aby sa preskúmala zmena produkcie cytokínov podľa pokynov výrobcu (RayBiotech, Inc., Norcross, GA, USA).

2.13. Test jadrovej translokácie.

Primárne potkanie chondrocyty boli ošetrené 50 a 100 ug/mlakteozidv prítomnosti 10ng/ml IL-1 . Po 30 minútach boli primárne potkanie chondrocyty fixované 1% paraformaldehydom, permeabilizované v 0,2% Tritone X-100 a dôkladne premyté fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátmi. Nešpecifické signály boli blokované použitím normálneho kozieho séra. Po viacnásobnom premytí boli chondrocyty inkubované s králičími anti-NFKB protilátkami, po čom nasledovala inkubácia s FITC-konjugovaným kozím anti-králičím IgG (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) cez noc pri 4 stupňoch. Potom sa zafarbené bunky zobrazili pomocou systému laserového konfokálneho skenovacieho mikroskopu (Leica Microsystems, Wetzlar, Nemecko) v pobočke Gwangju Kórejského základného vedeckého inštitútu (Gwangju, Kórejská republika).

2.14. Generácia osteoartróznych zvierat.

Na vytvorenie osteoartróznych zvierat bol chirurgicky destabilizovaný mediálny meniskus (DMM) v kolenných kĺboch ​​myší BALB/c (priemerná telesná hmotnosť 19:3±0:5g) v súlade s usmerneniami IACUC (CIACUC{{4} }A0029). Zvieratá indukované OA boli liečené perorálne 5 a 10 mg/kg akteozidu rozpusteného v 5 percentách etanolu (experimentálna skupina; n =5) alebo vehikule (5 percent etanolu) (skupina DMM; n =5) každý iný deň po dobu 8 týždňov. Na konci kultivačného obdobia boli kolenné kĺby vypreparované a fixované pomocou 5 percent paraformaldehydu počas 7 dní na vykonanie histologického hodnotenia. Po farbení safranínom-O a rýchlym zeleným zafarbením boli zobrazené tkanivá kĺbovej chrupavky vyšetrené v súlade s Mankin grade [14, 15].

2.15. Štatistická analýza.

Experimentálne údaje sú prezentované ako priemer ± štandardná odchýlka a boli porovnané pomocou analýzy rozptylu, po ktorej nasledovali post hoc viacnásobné porovnania (Tukeyho test) s použitím softvéru SPSS verzie 25 (IBM Corp.). Všetky údaje, okrem štúdie na zvieratách, boli získané z troch nezávislých experimentov.

akteozidvcistanche

3. Výsledky

3.1. Akteozid neovplyvňuje životaschopnosť buniek L929 a primárnych potkaních chondrocytov.

Myšia fibroblastová bunková línia L929 použitá ako normálne bunky bola ošetrená 2,5, 5, 10, 25, 50 a 100 uM akteozidom počas 24 hodín. Potom sa uskutočnil test MTT na vyhodnotenie cytotoxicity akteozidu na bunky L929. Ako je znázornené na obrázku 2(a), relatívna životaschopnosť buniek L929 bola stanovená na 94:8±8 percent, 93:6±7 percent, 100 ± 5 percent, 103:9±5 percent, 126:1±8 percent a 122:7 ± 4 percentá pri 2,5, 5, 10, 25, 50 a 100 uM akteozidu, v tomto poradí, v porovnaní s kontrolou (100:02 ± 3 percentá). Ďalej, aby sa overila cytotoxicita akteozidu na primárnych potkaních chondrocytoch, vykonal sa test MTT, ako je znázornené na obrázku 2(b). Životaschopnosť primárnych potkaních chondrocytov ošetrených 2,5, 5, 10, 25, 50 a 100 uM akteozidom bola stanovená ako 114 ± 4 percentá, 117:8 ± 6 percent, 123:9 ± 5 percent, 132:6 ± 4 percentá, 153:1±7 percent a 142:1±6 percent v porovnaní s kontrolou (100:4±5 percent). Ďalej, aby sa potvrdil účinok akteozidu na životaschopnosť buniek L929 a primárnych potkaních chondrocytov, uskutočnil sa test živé/mŕtve bunky, ako je znázornené na obrázku 2 (c). Počet mŕtvych buniek zafarbených ako červená fluorescencia sa nezvýšil pre bunky L929 ani pre primárne potkanie chondrocyty ošetrené 50 a 100 uM akteozidom počas 24 hodín. Tieto údaje konzistentne preukazujú, že definovaná dávkaakteozidneovplyvnil životaschopnosť buniek L929 a primárnych potkaních chondrocytov. 50 μM akteozidu a 100 μM akteozidu, čo sú netoxické dávky v bunkách L929 aj v primárnych chondrocytoch potkanov, sa teda použili na overenie jeho antikatabolických účinkov v štúdiách in vitro s použitím primárnych chondrocytov potkanov.

3.2. Akteozid pôsobí proti IL-1 -indukovanej strate proteoglykánov v primárnych chondrocytoch potkanov.

Primárne potkanie chondrocyty vložené do alginátových guľôčok boli ošetrené 50 a 100 uM akteozidom v prítomnosti alebo neprítomnosti 1 ng/ml IL- 1 počas 21 dní. Potom sa uskutočnil test DMMB na vyhodnotenie zmeny obsahu proteoglykánu, ako je znázornené na obrázku 3 (a). Relatívny obsah proteoglykánov bol stanovený ako 88:3±18:1 percent a 86:8±16:3 percent v primárnych potkaních chondrocytoch ošetrených 50 a 100 uM akteozidom, v tomto poradí, v porovnaní s kontrolou (103:8± 32:3 percentám). Hoci relatívny obsah proteoglykánov bol znížený akteozidom, tieto výsledky neboli významné. Relatívny obsah proteoglykánu sa však výrazne znížil o 37:1 ± 14:7 percent v primárnych chondrocytoch potkanov liečených 1 ng/ml IL-1, ale 50 a 100 μM akteozidu významne znížilo obsah proteoglykánu o 57 ± 12:4 percent a 64 ± 14:5 percent, v tomto poradí, v prítomnosti 1 ng/ml IL-1. Následne, aby sa overilo, či akteozid potláča IL-1 - indukovanú stratu proteoglykánu, bola kĺbová chrupavka vyrezaná z kolenných kĺbov potkana ošetrená 100 μM akteozidom v prítomnosti alebo neprítomnosti 10 ng/ml IL-1 počas 7 dní. Potom sa uskutočnili histologické hodnotenia s použitím farbenia H&E a farbenia safranínom-O a rýchleho zeleného farbenia, ako je znázornené na obrázku 3 (b). Morfologická zmena nebola pozorovaná pri použití farbenia H&E; avšak farbenie safranínom-O a rýchle zelené zafarbenie odhalilo, že proteoglykán zafarbený ako červená farba sa nezmenil v kĺbových chrupavkách ošetrených 100 uM akteozidom v porovnaní s kontrolou. Avšak vážna strata proteoglykánu bola vyvolaná 10 ng/mlIL-1 v kĺbovej chrupavke a 100μM akteozid významne potláčal stratu proteoglykánu v kĺbovej chrupavke liečenej 10ng/ml IL- 1. Súhrnne tieto údaje konzistentne ukazujú, že akteozid má antikatabolický účinok, ktorý spomaľuje degeneráciu kĺbovej chrupavky prostredníctvom pôsobenia proti IL{50}}indukovanej strate proteoglykánov.

akteozidvcistanchemajú dobré účinky naantioxidant

3.3. Akteozid má antikatabolický účinok, ktorý potláča expresiu a aktiváciu MMP v primárnych chondrocytoch potkanov liečených IL-1.

Aby sa zistilo, či je antikatabolický účinok indukovaný akteozidmi spojený so supresiou expresie a aktivácie MMP, primárne potkanie chondrocyty boli ošetrené 50 a 100 μM akteozidom v prítomnosti alebo neprítomnosti 10 ng/ml IL-1 počas 24 hodín. Potom sa skúmali zmeny v MMP. Ako je znázornené na obrázku 4(a), hoci expresia enzýmov degradujúcich chrupavku, ako sú MMP-13, MMP-1 a MMP{10}}, bola významne zvýšená v kondicionovanom médiu primárnych potkanov chondrocytoch liečených 10 ng/ml IL-1, bola znížená oakteozidspôsobom závislým od dávky. Okrem toho výsledky qPCR (obrázok 4(b)) a qRT-PCR (obrázok 4(c)) odhalili, že IL-1 významne zvýšil hladiny mRNA MMP, ako sú MMP-13, MMP{ {6}} a MMP-3 v primárnych chondrocytoch potkanov. Znižovali sa však v závislosti od dávky v primárnych potkaních chondrocytoch ošetrených 50 a 100 uM akteozidom. Okrem toho 50 a 100 μM akteozidu účinne potlačilo aktiváciu MMP v primárnych chondrocytoch potkanov ošetrených 10 ng/ml IL-1 (obrázok 4(d)). Celkovo tieto údaje konzistentne naznačujú, že akteozid má antikatabolický účinok, ktorý potláča expresiu a aktiváciu enzýmov degradujúcich chrupavku.