Časť 1 Cistanche Deserticola Polysacharid inhibuje stratu kostnej hmoty vyvolanú OVX u myší a osteoklastogenézu vyvolanú RANKL

1. Zavedenie

Osteoporóza - ochorenie charakterizované zníženou kostnou hmotou, abnormálnou mikroštruktúrou kostného tkaniva, zvýšenou krehkosťou kostí a zlomeninami (De Martinis, Di Benedetto, Mengoli, & Ginaldi, 2006) - v súčasnosti postihuje viac ako 200 miliónov ľudí na celom svete a predstavuje značnú lekársku a sociálno-ekonomickú záťaž pre modernú spoločnosť (Strom et al., 2011). Klinická liečba osteoporózy sa zameriava hlavne na hormonálnu substituciu, bisfosfonát alebo liečbu denosumabom. Tieto metódy sú účinné, ale predstavujú dlhodobé vedľajšie účinky, ako je potenciálne riziko rakoviny prsníka a atypických zlomenín stehennej kosti (Black, Bauer, Schwartz, Cummings, & Rosen, 2012; Rachner, Khosla, & Hof- Bauer, 2011). Preto existuje naliehavá potreba preskúmať lieky, ktoré môžu nielen inhibovaťOsteoporózyAle majú tiež menej nežiaducich vedľajších účinkov.

Cistanche deserticola(CD), tonikum a liečivá potravina široko používaná v Číne, známa ako "púštny ženšen", je sušená sukulentná stonka s listom šupinyC. deserticolalaYC Ma (Gu, Yang, & Huang, 2016) a má rozmanité a efektívnefarmakologickýČinnosti, ako je imunitná regulácia, antioxidant a anti-Osteoporózynehnuteľnosti (Hu et al., 2020; Li a kol., 2012; Čang a kol., 2014). Predchádzajúce štúdie o účinných látkach CD na liečbu osteoporózy sa zamerali najmä nafenyletanoidglykozidy(Li, Jiang, & Gu, 2018; Xu, Zhang, Wang, Yao, & Ma, 2017). CD však obsahuje aj ďalšie účinné zložky, ako sú iridoidy, lignany,polysacharidy(Wang, Zhang, & Xie, 2012). Klinická aplikácia tradičnej čínskej medicíny (TCM) je hlavne dekódovanie vody.Polysacharidysú vo vode rozpustné zložky a s najväčšou pravdepodobnosťou sú hlavnými farmakodynamickými zložkami TCM. Polysacharidy extrahované z TCM boli divoko hlásené, že majú anti-Osteoporózyúčinok a niekoľko nežiaducich vedľajších účinkov, ktoré sa vo všeobecnosti používajú na klinikách (napr. polysacharidy extrahované z Epimedium brevicornum (Zheng, He, Wu, Cai, & Wei, 2020), Achyranthes bidentata (Zhang, Zhang, Zhang, Wang, & Yan, 2018) a Morinda officinalis (Yan et al., 2019)). Preto sme predpokladali, žeCistanche deserticolaPolysacharid(CDP) extrahované z CD môže byť potenciálne bezpečným liekom na liečbu osteoporózy.

Typicky resorpcia kostí a tvorba kostí udržiavajú dynamickú rovnováhu počas prestavby kostí v koordinácii s niekoľkými typmi buniek, vrátane osteoklastov, osteoblastov, buniek kostnej výstelky a osteocytov (Kular, Tickner, Chim, & Xu, 2012). Prerušenie tejto rovnováhy môže viesť k rôznym metabolickým ochoreniam kostí, ako súOsteoporózy(Zhu et al., 2018) a osteoskleróza (Ihde et al., 2011). Osteoklasty, ako end-diferencované bunky odvodené z mononukleárnej/makrofágovej línie, sú jediné bunky s funkciou resorpcie kostí (Teitelbaum, 2000). Existujú dva kľúčové cytokíny, ktoré sa podieľajú na diferenciácii a dozrievaní osteoklastu (Koga et al., 2004): faktor stimulujúci makrofágovú kolóniu (M-CSF) a receptorový aktivátor ligandu jadrového faktora κB (NF-κB) (RANKL). M-CSF sprostredkúva diferenciáciu krvotvorných kmeňových buniek na osteoklastických predchodcov a podporuje diferenciáciu osteoklastov zvyšovaním regulácie expresie RANK receptora (Takayanagi, 2007). Väzba RANKL a RANK na povrch osteoklastických buniek vedie k nasledovnému: (1) náboru molekúl signalizačného adaptéra, ako je faktor 6 spojený s TNF receptorom (TRAF6); (2) aktivácia viacerých nadväzujúcich cieľov vrátane NF- κB a proteínových kinázy aktivovaných mitogénom (MAPK); a (3) zvýšenie regulácie expresívnych úrovní jadrového faktora aktivovaných T-buniek, cytoplazmatických 1 (NFATc1) (Liu et al., 2019; Yamashita et al., 2007). Aktivácia týchto signálnych dráh priamo reguluje expresiu génov osteoklastu, vrátane kyslej fosfatázy 5 (Acp5) [kódovanie kyseliny fosfatázy rezistentnej na tartrát (TRAcP)], matricovej metaloproteinázy 9 (MMP9) a katépsínu K (CTSK) (Boyle, Simonet, & Lacey, 2003). Preto je inhibícia osteoklastických signálnych dráh súvisiacich s diferenciáciou vyvolaných RANKL potenciálnou terapeutickou metódou osteoporózy.

V tejto štúdii sme sa zamerali na určenie účinkov liečby CDP na ovariectomized (OVX) indukovanúOsteoporózymyšací model in vivo a na ranklom indukovanú osteoklastickú aktivitu in vitro so zameraním na expresiu génov špecifických pre osteoklastu a aktiváciu NFATc1 a signálnych dráh NF-κB a MAPKs. Naše zistenia môžu poskytnúť nový pohľad na potenciál CDP ako bezpečného a účinného lieku na liečbu osteoporózy.

Pre viac informácií kontaktujte:Joanna.jia@wecistanche.com

Polysacharid Cistanche deserticola má mnoho účinkov pri osteoporóze, kliknite sem a dozviete sa viac

2. Materiály a metódy

2.1. Chemikálie a odber vzoriek

CD (č. 180801) bolo zakúpené od spoločnosti Anhui Jishun Traditional Chinese Medicine Co., Ltd. (Anhui, Čína) a identifikované profesorom Haibo Huangom zo Školy farmaceutických vied, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou, Čína. Tablety Estradiol valerate boli zakúpené v spoločnosti Bayer (Leverkusen, Severné Porýnie- Vestfálsko, Nemecko). Alfa-modifikované minimálne základné médium

(α-MEM) a sérum pre hovädzí dobytok plodu (FBS) boli získané z Gibco (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Penicilín/streptomycín a súprava na farbenie TRAcP boli získané od spoločnosti Solarbio (Peking, Čína). Rekombinantná myš M-CSF a rekombinantná myš RANKL boli pro-vyliečené z R&D Systems (Minneapolis, MN, USA). Dosky potiahnuté hydroxyapatitom boli zakúpené od spoločnosti Corning Life Sciences (St. Lowell, MA, USA). Primárne protilátky pre NFATc1 a CTSK (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA); IκB-α, p65, P-p65, p38, P-p38, ERK1/2, P-ERK1/2, JNK a P-JNK (Technológia bunkovej signalizácie, Dan- vers, MA, USA); a získal sa aj β-actin (CWBIO, Peking, Čína). Ostatné činidlá použité v tejto štúdii boli analytickej kvality a voda bola čistená systémom čistenia vody Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA).

2.2. Extrakcia CDP

CD bolo rozomleté na jemný prášok a trikrát zmiešané s ropným éterom, aby ho porazilo. Pevné zvyšky sa zbierali filtráciou a potom sa sušili pri izbovej teplote. Tápolysacharidyboli trikrát extrahované z vopred ošetrených vzoriek vodou počas 2 h, koncentrované, vyzrážané pridaním bezvodého etanolu do konečnej koncentrácie 80% (v/ v) a skladované pri teplote 4 ◦C počas 24 hodín. Zrazeniny sa zbierali odstreďovaním pri 3000 ot/min po dobu 20 minút, rozpúšťali sa v destilovanej vode a čistili (odstraňovanie voľných bielkovín) metódou Sevag (Zhao et al., 2019). Zotavenýpolysacharidyboli dialyzované, sušené a skladované až do ďalšieho použitia. Okrem toho výsledky chemického zloženia ukázali, že celkový obsah cukru, kyseliny urónovej, síranu a bielkovín CDP bol 67,63 0,98%, 21,05 0,49%, 1,90 0,24% a 8,81 0,36%.

Monosacharidové zloženie a Fourierova transformačná infračervená analýza CDP boli znázornené na doplnkovom obr. 1 a 2.

2.3. Model myši s osteoporózou vyvolaný OVX

Všetky pokusy na zvieratách boli schválené Etickou komisiou na zvieratách Univerzity čínskej medicíny v Guangzhou (schválené SYXK 2019-0202). Tridsať 6-týždňových myší C57BL/6 bolo dodaných Experiment Animal Center z Guangzhou University of Chinese Medicine. Po aklimatizácii po dobu 1 týždňa bola jednej skupine myší podaná falošná operácia (Sham group), zatiaľ čo zvyšné myši boli podrobené operácii ovariektómie (skupina OVX). Po operácii sa myši mohli zotaviť po dobu 1 týždňa. Potom boli myši úspešne modelované náhodne rozdelené do 5 skupín, pričom 6 myší na skupinu:

(1) Falošná skupina: ošetrená destilovanou vodou, (2) skupina OVX: ošetrená destilovanou vodou, (3) skupina OVX E2 (E2): ošetrená 0, 13 mg/kg estradiol valeračných tabliet, (4) skupina s nízkymi dávkami OVX CDP (CDP-L): ošetrená 300 mg/kg CDP, (5) vysokodávkovou skupinou OVX CDP (CDP- H): liečená 600 mg/kg CDP. Destilovaná voda, E2 alebo CDP bola podávaná gavage raz denne. Všetky myši boli obetované po 12- týždňovom období liečby (obr. 1A). Maternice sa zbierali a vážili a ľavé holenné kosti sa zbierali na následné vyšetrenia. Odobrali sa celé vzorky krvi a odstredili pri 5000 ot/min.

15 min pri 4 ◦C. Supernatanty séra boli nasávané a skladované na

—80 ◦C až do ďalšej analýzy.

2.4. Analýza mikroúverovej tomografie (mikro-CT) a histomorfometria kostí

Ľavá holenná kosť bola upevnená 4% paraformaldehydom počas 48 hodín a následne umiestnená do odstredivkových skúmaviek obsahujúcich normálny fyziologický roztok. Pevné vzorky boli skenované mikro-CT prístrojom Skyscan 1172 (Bruker micro-CT, Skyscan, Kontich, Belgicko) pomocou týchto nastavení: napätie, 80 kV; zdrojový prúd, 100 μA; Al, 0,5 mm filter; pixel

veľkosť, 9,76 μm; a krok otáčania, 0,6◦. Niekoľko parametrov

trabekulárna kosť vrátane hustoty minerálov v kostiach (BMD), frakcie objemu kostí (BV/TV), povrchu kostí na celkový objem (BS/TV), trabekulárneho čísla (Tb. N) a trabekulárneho rozstupu (Tb. Sp) sa merali pomocou softvéru CT- Analyser® (Bruker micro-CT, Skyscan). Trojrozmerné obrázky boli generované pomocou softvéru CTVol (Bruker micro-CT. Skyscan).

Po mikro-CT analýze boli ľavé holenné kosti odvápnené v 14% roztoku EDTA a vložené do parafínu na rezanie. Vzorky boli nakrájané na 5 μm sekcií pomocou mikrotómu pred experimentmi farbenia hematoxylínu a eozínu (H&E) a TRAcP. Zafarbené časti boli preskúmané a zdokumentované pomocou mikro-rozsahu Olympus CX 31 (Olympus Optical Co., Ltd, Tokyo, Japonsko).

Cistanchemôže zvýšiť hustotu kostí a zmierniť osteoporózu

2.5. Analýza séra

Koncentrácie vápnika (Ca) a fosforu (P) boli stanovené podľa pokynov súpravy navrhnutých Bioinžinierskym inštitútom Nanjing Jiancheng (Nanjing, Čína). Hladiny TRAcP-5b a RANKL v sére boli analyzované pomocou súpravy TRAcP-5b ELISA (CUSABIO, Wuhan, Čína) a súpravy RANKL ELISA (Cloud-CloneCorp., Wuhan, Čína).

2.6. Skúška osteoklastogenézy in vitro

BMM boli izolované od holennej kosti a stehennej kosti 6-týždňovej samice myší C57BL/6. Izolované bunky boli kultivované v α-MEM médiu obsahujúcom 25 ng/ml M-CSF, 10% FBS a 1% penicilín/streptomycín. Po dosiahnutí sútoku boli BMM (1 104 buniek / jamka) nasadené do 96-jamkových dosiek a ošetrené CDP v prítomnosti 50 ng / ml RANKL. Médium a CDP sa vymieňajú každé 2 dni. Po 7 dňoch boli bunky fixované 4% paraformaldehydom a zafarbené na prítomnosť TRAcP. Počet osteoklastov definovaných ako TRAcP- pozitívne bunky s tromi alebo viacerými jadrami, bol spočítaný a zdokumentovaný pomocou svetelného mikroskopu.

2.7. Skúška proliferácie buniek

BMM (1 × 104 buniek / jamka) boli nasadené do 96-jamkovej dosky a inkubované cez noc. Potom boli bunky ošetrené rôznymi koncentráciami CDP (0, 0, 625, 1, 25, 2, 5, 10, 20 a 40 μg/ml) počas 48 hodín. Bunkový sútok bol detekovaný a analyzovaný pomocou IncuCyte ZOOM® (Essen BioScience, Ann Arbor, MI, USA), dlhodobého dynamického zobrazovacieho systému živých buniek v reálnom čase.

2.8. Test hydroxyapatitovej resorpcie

BMM (1 104 buniek/jamka) boli nasadené do dosky potiahnutej hydroxyapatitom, ošetrené CDP v indikovaných koncentráciách (0, 5 a 10 μg/ml) a kultivované v kompletnom α-MEM obsahujúcom 25 ng/ml M-CSF a 50 ng/ml RANKL. Po 7 dňoch sa bunky umyli 10% bieliacim roztokom na odstránenie bunkových zložiek. Obrázky hydroxyapatitových resorpčných oblastí boli zachytené pomocou IncuCyte ZOOM® a analyzované pomocou softvéru ImageJ (NIH, Bethesda, MD, USA) (Abramoff, Magelhaes, & Ram, 2003).

2.9. Izolácia RNA a analýza reverznej transkripcie v reálnom čase -kvantitatívna PCR (RT-qPCR)

BMM (1 105 buniek/jamka) boli nasadené do 6-jamkovej platne a stimulované RANKL a M-CSF v prítomnosti CDP v rôznych koncentráciách (0, 5 a 10 μg/ml) počas 5 dní. Celková RNA bola izolovaná z buniek alebo kostného tkaniva myší pomocou TRIzolovho činidla (Sigma- Aldrich). Komplementárna DNA bola syntetizovaná z 2 μg celkovej RNA pomocou súpravy reverznej transkriptázy (TransGen Biotech, Peking, Čína). Rt-qPCR reakcie boli pripravené pomocou PerfectStart™ Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech) a detekované systémom ABI 7500 (Aplikované

Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA). Parametre cyklistiky pre PCR boli nastavené nasledovne: 95 ◦C po dobu 5 minút, po ktorých nasledovalo 40 cyklov 95 ◦C pre 15 s a 60 ◦C pre 30 s. Použité špecifické priméry sú znázornené v tabuľke 1 a množstvo každého cieľového génu sa normalizovalo na GAPDH (vnútorná kontrola).

2.10. Analýza západných škvŕn

BMM (5 105 buniek / jamka) boli nasadené do 6-jamkovej dosky. Pri experimentoch s krátkym časovým priebehom boli bunky predinkubované rôznymi koncentráciami CDP (0, 5 a 10 μg / ml) počas 1 h a potom ošetrené 50 ng / ml RANKL po dobu 30 minút. Po dlhú dobu boli bunky stimulované 50 ng / ml RANKL v dňoch 3, 5 a 7 v prítomnosti CDP (0, 5 a 10 μg / ml). Celkové bielkoviny boli extrahované pomocou tlmivého roztoku ripa lysis (CWBIO). Proteíny boli oddelené 10% SDS-PAGE a prenesené na PVDF membrány. Membrány boli blokované 5% odstredeným mliekom pri izbovej teplote po dobu 2 hodín, inkubované primárnym

protilátky cez noc pri teplote 4 °C a potom s príslušným sekundárnym

protilátky na 1,5 h. Membrány boli vyvinuté pomocou ECL činidiel (Millipore Corp., Billerica, MA, USA) a snímky boli zhotovené pomocou tanon 5200 chemiluminiscenčného zobrazovacieho systému (Tanon Science and Technology, Šanghaj, Čína).

CistancheMôže zvýšiť hustotu kostí

2.11. Detekcia translokácie NFATc1 pomocou imunofluorescenčného testu

BMM boli nasadené na 12-jamkové kryty, stimulované RANKL a M-CSF a ošetrené 10 μg / ml CDP po dobu 5 dní. Bunky boli fixované 4% paraformaldehydom po dobu 15 minút, trikrát umyté PBS a permeabilizované 0,1% Triton X-100 po dobu 10 minút. Bunky boli zmiešané s 10% kozím sérom (CWBIO) a inkubované počas 2 hodín. Následne boli bunky inkubované primárnou protilátkou cez noc pri teplote 4 ◦C a potom so sekundárnou protilátkou Alexa Fluor 488 kozieho proti myši (Abcam, Cambridge, MA, USA) v tme po dobu 1 h. Kryty boli umyté PBS, namontované v prolong gold antifade reagent s 4′, 6-diamidino-2-fenyl in-dole (DAPI) (Solar) a

skontrolované pomocou Zeiss LSM 800 konfokálnym mikroskopom Airyscan (Carl Zeiss, Oberkochen, Nemecko).

2.12. Štatistická analýza

Všetky experimentálne údaje boli analyzované pomocou štatistického softvéru SPSS 25.0 (IBM Corporation, Armonk, NY, USA). Údaje pre štúdie na zvieratách a bunkách sú vyjadrené ako prostriedky ± SEM a prostriedky ± SD. Výsledky sú pomocou jednosmernej analýzy rozptylu alebo Študentského t-testu. Hodnoty p< 0.05="" were="" considered="" statistically="">

CistancheMôže znížiťapoptózaa zvýšiť kosťhustota