Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Pls kliknite sem pre časť 2

I-Fang Wang,1,2 Yihan Wang,2 Yi-Hua Yang,1,3,4 Guo-Jen Huang,5,6 Kuen-Jer Tsai,3,4,* a Che-Kun James Shen1,2,7 ,*

1 Absolvent Inštitútu neurálnej regeneratívnej medicíny, Vysoká škola lekárskej vedy a technológie, Taipei Medical University, Taipei 11031, Taiwan

2Inštitút molekulárnej biológie, Academia Sinica, Taipei 11529, Taiwan

3Inštitút klinickej medicíny, College of Medicine, National Cheng Kung University, Tainan 70403, Taiwan

4Výskumné centrum klinickej medicíny, National Cheng Kung University Hospital, College of Medicine, National Cheng Kung University, Tainan 70403, Taiwan

5Katedra a postgraduálny inštitút biomedicínskych vied, College of Medicine, Univerzita Chang Gung, Taoyuan 33302, Taiwan

6 Neuroscience Research Center, Chang Gung Memorial Hospital, Linkou 33302, Taiwan

7Vedúci kontakt

* Korešpondencia: kjtsai@mail.ncku.edu.tw (K.-JT), ckshen@tmu.edu.tw (C.-KJS)

https://doi.org/10.1016/j.celrep.2021.109477

Cistanche môže zlepšiť pamäť

SÚHRN

Fenotypová variácia je základným predpokladom evolúcie buniek a organizmu prirodzeným výberom. Zatiaľ čo úloha stochastickej génovej expresie vo fenotypovej diverzite geneticky identických buniek je dobre študovaná, nie je veľa známe, pokiaľ ide o vzťah medzi stochastickou génovou expresiou a individuálnymi variáciami správania u zvierat. Ukazujeme, že špecifická miRNA (miR{0}}f{1}}p) je upregulovaná v hipokampe časti jednotlivých inbredných myší pri úlohe Morrisovho vodného bludiska. Významne, miR- 466f{3}}p pozitívne reguluje morfológiu neurónov, funkciu a priestorové učenie aPamäťschopnosti myší. Mechanisticky miR-466f{1}}p potláča preklad MEF2A, negatívneho regulátora učenia/Pamäť. Nakoniec sme ukázali, že rôzna upregulácia hipokampálneho miR-466f{1}}p je výsledkom randomizovanej fosforylácie hipokampálnej cyklickej AMP (cAMP)-response element-binding (CREB) u jednotlivcov. Toto zistenie modulácie priestorového učenia aPamäťprostredníctvom randomizovanej hipokampálnej signalizačnej osi po neuronálnej stimulácii predstavuje demonštráciu toho, ako variácie v expresii génov v tkanivách vedú k rôznorodému správaniu zvierat.

ÚVOD

Fenotypová variácia medzi jednotlivcami poskytuje evolučnú výhodu, pretože poskytuje populačnú diverzitu, na ktorú pôsobí prírodný výber (Pavlicev et al., 2011). Genetické pozadie a faktory prostredia prispievajú k vytvoreniu takejto prirodzenej variácie (Bendesky a Bargmann, 2011). Experimentálne sa inbredné myši často používali na štúdium molekulárneho a bunkového základu priemerných fenotypov a správania, aby sa minimalizovali účinky genetických rozdielov medzi testovanými jedincami (Casellas, 2011). Medzi jednotlivými izogénnymi myšami sa však preukázala variácia množstva transkriptov tkaniva. Gény vykazujúce vysoko variabilné hladiny expresie sú často spojené s imunitnými funkciami, stresovými reakciami a hormonálnou reguláciou, tj procesmi citlivými na environmentálne podnety (Vedell et al., 2011). Niektoré z týchto štúdií tiež ukázali, že rozdiely v génovej expresii alebo bunkovej signalizácii, s alebo bez vplyvu environmentálnych faktorov, ako je materské olizovanie, zásobovanie živinami v maternici alebo stresom vyvolaná odolnosť oproti náchylnosti (Bale, 2015; Danchin et al. ., 2011; Lorsch

a kol., 2019; Pedersen a kol., 2011), môže viesť k rozdielom vo fenotypoch a správaní (Casellas, 2011; Locke a kol., 2015; Loos a kol., 2015; Oey a kol., 2015).

Priestorové učenie aPamäťformáciu riadenú mozgom možno rozdeliť do dvoch systémov: (1) egocentrická navigácia využívajúca vlastný pohyb a vnútorné podnety a (2) alocentrická navigácia primárne zahŕňajúca hipokampus a blízke mozgové štruktúry, ktorá je stimulovaná distálnymi podnetmi mimo organizmov (Ekstrom a kol., 2014). Schopnosť priestorového učenia aPamäťumožňuje väčšine živočíšnych druhov postupne prispôsobovať svoje správanie v priestorovo a časovo premenlivom prostredí, čo je rozhodujúce pre ich prežitie. To možno posúdiť na laboratórnych zvieratách použitím vzorov správania, ako je Morrisovo vodné bludisko (MWM) (Vorhees a Williams, 2014). Predovšetkým sa ukázalo, že geneticky identické inbredné hlodavce vykazujú fenotypové variácie v priestorovom učení aPamäť(Tsai et al., 2002), ale základné mechanizmy tejto variácie správania zostali neznáme.

Tvorba nových spomienok je komplexný proces vyžadujúci génovú transkripciu závislú od aktivity, novú syntézu bielkovín a

Obrázok 1. Korelácia medzi variáciou priestorového učenia aPamäťschopnosťou a miR-466f{1}}p indukciou

(A) Úloha MWM inbredných myší C57BL/6J divokého typu. Ľavý panel: MWM výkony GLN myší (bodky) a PLN myší (štvorce). Z celkového počtu 289 testovaných myší bolo 180 kategorizovaných ako GLN a 109 ako PLN. Pravý panel: test úlohy MWM (n=47 a 30 v každej skupine). V histograme sa porovnávajú priemery v každom zo štyroch kvadrantov a oblasti platformy. P, miesto chýbajúcej plošiny; T, cieľová zóna bez P; R, pravá zóna; O, opačná zóna; L, ľavá zóna. (B) RT-qPCR analýza expresie miRNA. Relatívne hladiny expresie šiestich miRNA umiestnených v miR-466-669 klastri a miR{10}}p, ako pozitívna kontrola obohatená mozgom, boli analyzované a normalizované pomocou internej kontroly U6 snRNA z GLN a PLN myšacieho hipokampu (n=9–18 na skupinu). I, miR-466f- 3p; II, miR-466}g; III, miR-466i-3p; IV, miR-467b-3p; V, miR-467f; VI, miR-669f; VII, miR-132-3s.

jemne vyladené špecifické neurónové siete akoPamäťengramy na vytvorenie nových neurónových spojení a trvalú plasticitu (Asok et al., 2019). Hipokampálne engramy, čo sú riedke populácie neurónov v gyrus dentatus (DG), predstavujú súbory neurónov vykazujúcich zvýšenú aktivitu poPamäťtvorenie. Zatiaľ čo neuróny DG engram vykazujú veľmi odlišný vzor génovej expresie (Rao-Ruiz et al., 2019), molekulárne mechanizmy špecifické pre engram sú základomPamäťkonsolidácia zostáva veľkou neznámou. Je známe, že rôzne faktory a signálne dráhy buď pozitívne alebo negatívne regulujú učenie aPamäťprocesy boli identifikované (Abraham a kol., 2019; Humeau a Choquet, 2019). Medzi nimi aktivovaná forma cyklického AMP (cAMP)-response element-binding protein (CREB) stimuluje génovú transkripciu ako odpoveď na aktivitu závislé zvýšenie intracelulárneho Ca2 plus v neurónoch (Kandel, 2012). Na druhej strane, camp/PKApathway potláča transkripčnú aktivitu myocyteenhancer faktora 2 (MEF2) tým, že bráni nukleárnemu exportu jeho korepresora, HDAC5, a nukleárnemu importu koaktivátora NFAT (Belfield et al., 2006). Okrem toho, na rozdiel od CREB, aktivita MEF2A obmedzujePamäťformácie (Cole et al., 2012). Okrem proteínových faktorov sa mikroRNA (miRNA) podieľajú aj na regulácii neuronálnych funkcií vrátane učenia a pamäte (McNeill a Van Vactor, 2012). miRNA sú malé (22 nt) nekódujúce RNA, ktoré primárne pôsobia ako post-transkripčné regulátory génovej expresie prostredníctvom sekvenčne špecifického párovania báz s ich rozpoznávacími miestami v 30 nepreložených oblastiach (30 UTR) špecifických mRNA (Daugaard a Hansen, 2017). miRNA sa podieľajú na rade signálnych dráh v postmitotických neurónoch a sprostredkúvajú bunkové procesy závislé od aktivity, vrátane dendritického rastu a vetvenia, tvorby synapsií a dozrievania. Reguláciou génovej expresie tiež hrajú dôležitú úlohu v dlhotrvajúcich formách synaptickej plasticity, ktoré sú základomPamäťformovanie, získavanie a konsolidácia (Chen a Shen, 2013; Wang et al., 2012b).

V nasledujúcom texte uvádzame dôkazy o príčinnej súvislosti medzi génovou expresiou stochastického tkaniva a individuálnymi variáciami správania u zvierat. Predovšetkým ukazujeme, že stochastická aktivácia hipokampálnej osi CREB-pCREB / miR- 466f-3p-MEF2A moduluje individuálnu variáciu priestorového učenia aPamäťschopnosť u inbredných myší.

VÝSLEDKY

Individuálna variácia priestorového učenia aPamäťschopnosť koreluje s indukciou miR-466f{1}}p zo špecifického klastra miRNA

Identifikovať miRNA zapojené do regulácie učenia aPamäťsme použili úlohu MWM na rozlíšenie inbredných myší divokého typu C57BL/6J s dobrou alebo slabou schopnosťou učenia a pamäte (obrázok 1A). Myši, ktoré dokončili úlohu do 30 s v poslednej (6.) relácii, sme definovali ako „dobré učiace sa“ (GLN), zatiaľ čo myši, ktoré nedokázali nájsť platformu do 30 s v poslednej relácii, boli považované za „zlé učiace sa“ “ (PLN). Ako je znázornené na obrázku 1A (ľavý panel), 62 percent myší patrilo do skupiny GLN (180 z 289 myší), pričom vykazovali výrazné zníženie únikovej latencie z 98,1 s (1. relácia) na 21,8 s (6. relácia). Naopak, úniková latencia zostávajúcich 38 percent myší, skupiny PLN (109 z 289 myší), sa medzi prvým a šiestym sedením znížila len mierne (zo 111,8 s v 1. relácii na 82,1 s v 6. relácii). . Test sondy, ktorý naznačuje, že myši sa skutočne naučili úlohu počas šiestich relácií, tiež ukázal, že myši GLN zostali dlhšie v oblasti platformy ako myši PLN (obrázok 1A, ľavý pár stĺpcov na pravom paneli).

Ďalej sme analyzovali RNA z hipokampu myší GLN a PLN pomocou miRNA microarray hybridizácie (n=4 v každej skupine). Vo všeobecnosti sme pozorovali relatívne malé rozdiely v expresných profiloch hipokampálnych miRNA z myší GLN a PLN. Poznamenali sme však, že 10 najlepších miRNA, pre ktoré boli hladiny expresie vyššie u myší GLN ako u myší PLN (údaje nie sú uvedené), bolo všetkých odvodených z rovnakého klastra miRNA špecifického pre hlodavce, miR-466-669, ktorý sa nachádza v intróne 10 gén mSfmbt2 (pozri nižšie). Na základe analýzy hladiny expresie vybraných miRNA v klastri s reverznou transkripciou a kvantitatívnou polymerázovou reťazovou reakciou (RT-qPCR) sme na ďalšie skúmanie vybrali miR-466f{9}}p (obrázok 1B). Priemerná expresia tejto miRNA bola 1.{12}}krát vyššia v hipokampe myší GLN v porovnaní s myšami PLN. Je pozoruhodné, že priemerné hladiny hipokampálneho miR-466f{14}}p boli podobné v skupine PLN, kontrolnej skupine v domácej klietke (HC) a kontrolnej skupine plávania (obrázok 1C), čím sa vylúčili účinky súvisiace s cvičením počas plávanie a ďalšie podporovanie myšlienky, že miR-466f-3p bol vyvolaný počas priestorového učenia aPamäťtvorenie.

Na obrázku 1C údaje odhaľujú, že úrovne expresie hipokampálnej miR-466f{2}}p u viac ako 42 percent myší GLN boli aspoň 1.5-krát vyššie ako priemerná úroveň expresie myší HC kontrolné myši, zatiaľ čo hladiny u 15 percent PLN myší boli polovičné ako u HC myší. Približne 25 percent myší GLN a 55 percent myší PLN malo podobné úrovne miR-466f{{10}}p (0.8- až 1.2- násobok vzhľadom na HC). Pearsonov korelačný bodový graf ukazujúci pozitívnu koreláciu medzi úrovňami miR-466f{16}}p a percentuálnym trvaním na platforme počas testu sondy je znázornený na obrázku 1D. Vykonali sme tiež miR-466f{19}}p a U6 malú jadrovú RNA (snRNA) in situ hybridizáciu (ISH) mozgových rezov u myší GLN aj PLN (obrázok 1E). Štatistická analýza signálov miR- 466f-3p prostredníctvom ISH potvrdila, že indukcia miR-466f- 3p bola skutočne väčšia v DG GLN myší v porovnaní s indukciou

PLN myši, zatiaľ čo pri porovnaní signálov U6 snRNA sa nezistil žiadny rozdiel (pravý histogram, obrázok 1E). Aj keď signály miR-466-3p neboli rovnaké medzi jednotlivými bunkami granúl v DG, stále sa výrazne a všade zvyšovali v hipokampe myší GLN v porovnaní s myšami PLN. Preto k indukcii miR-466f{5}}p nedošlo iba v malej časti buniek, napr. v engramových neurónoch. Tieto údaje naznačujú, že zvýšená regulácia miR-466f-3p počas úlohy MWM je úzko spojená s lepším priestorovým učením aPamäťschopnosť u významnej časti GLN myší.

Analyzovali sme tiež priemerné hladiny expresie niekoľkých miRNA špecifických pre mozog pomocou RT-qPCR. Medzi nimi bol miR-132-3p upregulovaný v myšom hipokampe po úlohe MWM, ale nepozorovali sme významné rozdiely medzi skupinami GLN a PLN (pár stĺpcov VII, obrázok 1B). Hladiny expresie miR-335-5p a miR-22 boli podobné medzi skupinami GLN, PLN a HC (obrázok S1A). Na rozdiel od miR-466f-3p teda hipokampálna expresia týchto miRNA počas tréningu MWM nekoreluje s priestorovým učením aPamäťschopnosti myší.

Upregulácia miR-466f{1}}p podporuje rast neuritov a tvorbu dendritickej chrbtice

Aby sme potvrdili, že miR-466f{1}}p bol skutočne exprimovaný v neurónoch, vykonali sme miRNA ISH v kombinácii s imunofluorescenčným (IF) farbením NeuN a MAP2 v primárnych hipokampálnych neurónoch. Výsledky ukázali, že podobne ako iné miRNA (Cohen et al., 2011; Thomas et al., 2017), miR-466f-3p sa exprimoval hlavne v oblasti neurónového soma, s niektorými ďalšími signálmi v dendritoch (obrázok S2A). Pochopiť molekulárny a bunkový základ asociácie upregulovaného miR-466f-3p s učením aPamäťsme najprv prechodne nadmerne exprimovali miR-466f{1}}p spolu s fúznym polypeptidom dsRed pod kontrolou promótora ubikvitínu z pFUGW- miR-466f-3p- dsRed plazmid do primárnych hipokampálnych neurónov DIV10 (obrázok S2B). Prostredníctvom miRNA ISH sme potvrdili, že signál miR-466f{9}}p je silnejší v skupine nadmernej expresie miR-466f-3p v porovnaní s vektorovou kontrolou alebo mutantnou miR{{ 12}}f{13}}p skupina (šípky, obrázok S2B). Paralelne sme tiež vytvorili platformu na skúmanie účinku straty funkcie miR-466f{16}}p inhibíciou miR-466f-3p pomocou miR-špongie umiestnenej v 30 UTR EGFP mRNA exprimovanej z plazmidu pFUGW-miR-huba-EGFP (obrázok S2C). Reportér EGFP v plazmide huby slúžil ako indikátor účinnosti transfekcie aj ako senzor bunkovej aktivity miRNA (Kluiver et al., 2012). Vo významnej časti transfekovaných buniek HEK293T sa signál EGFP znížil po koexpresii s miR-466f-3p divokého typu, ale nie s mutantnou miR-466f{{32 }}p, v dôsledku inhibície translácie EGFP mRNA väzbou miR-466f-3p na miR- špongiu v 30 UTR (porovnaj ľavé štyri obrázky a dva his- program, obrázok S2C) . Na rozdiel od toho sme nepozorovali znížený signál EGFP pri koexpresii kontrolnej špongie kódujúcej osem kópií zmiešanej sekvencie z plazmidu pFUGW-SCR-huba-EGFP buď s miR-466f-3p alebo jeho mutant (porovnajte pravé štyri obrázky a dva histogramy).

Ako je znázornené na obrázku 2A, ektopická expresia miR-466f{2}}p viedla k morfologickým zmenám neurónov, najmä k zvýšenému rastu neuritov v porovnaní s kontrolnými neurónmi transfekovanými vektorom pFUGW- exprimujúcim dsRed dsRed alebo mutantný miR-466f{7}}p-exprimujúci plazmid pFUGW-mut-miR- 466f-3p-dsRed. Kvantifikačné údaje ukázali, že priemerný počet dendritických vetiev na neurón sa významne nelíšil medzi skupinou nadmerne exprimujúcou miR-466f-3p (stĺpec II) a vektorovou alebo mutantnou kontrolou (stĺpce I a III) (vpravo horný histogram, obrázok 2A). Priemerná celková dĺžka dendritov a priemerná dĺžka primárnych dendritov sa však zvýšili po nadmernej expresii miR-466f{19}}p (porovnajte stĺpec II so stĺpcami I a III, pravý dolný histogram na obrázku 2A). Paralelne sme inhibovali endogénnu miR-466f-3p pomocou miR-huby. Ako je vidieť, medzi miR-466f-3p-inhibíciou a kontrolnou skupinou nebol žiadny významný rozdiel v počte dendritických vetiev (porovnajte stĺpec IV so stĺpcami I a V, histogram vpravo hore, obrázok 2A) , ale skupina s inhibíciou miR-466f{30}}p vykazovala značné zníženie priemernej celkovej dĺžky dendritov, ako aj priemernej dĺžky primárnych a sekundárnych dendritov v porovnaní s inými skupinami (porovnajte stĺpec IV s stĺpcami I a V, pravý dolný histogram na obrázku 2A). Okrem toho farbenie IF ukázalo, že nadmerná expresia miR- 466f-3p, ale nie inhibícia, tiež zvýšila hustotu dendritických tŕňov (obrázok 2B, horné panely a dolný ľavý histogram). Uskutočnili sme aj spoločné farbenie proteínu postsynaptickej hustoty 95 (PSD-95) a spočítali sme hustotu kolokalizovaných dendritických tŕňov, aby sme stanovili presný počet excitačných synapsií (obrázok 2B, histogram vpravo dole), čo odhalilo, že miR{{40 Nadmerná expresia }}f-3p zvýšila hustotu PSD-95-pozitívnych tŕňov v porovnaní s inými kontrolnými skupinami. Inhibícia miR-466f-3p však signifikantne nezmenila hustotu PSD-95- pozitívnych tŕňov v porovnaní s hustotou kontrolných skupín (obrázok 2B, histogram vpravo dole). Tieto údaje spolu naznačujú, že v neprítomnosti neuronálnej stimulácie samotná inhibícia miR-466f-3p neovplyvňuje hustoty excitačných synapsií alebo celkových dendritických tŕňov.