Časť 1: Bioaktívne zlúčeniny z Ephedra Fragilis: Optimalizácia extrakcie, chemická charakterizácia, antioxidačné a antiglykačné aktivity

Pre viac info. kontakttina.xiang@wecistanche.com

Abstraktné: Metodológia povrchu odozvy (RSM) s dizajnom Box-Behnken (BBD) bola použitá na optimalizáciu extrakcie bioaktívnych zlúčenín z Ephedra fragilis. Výsledky naznačujú, že extrakcia 61,93 percentným etanolom pri 44,43 stupňoch počas 15,84 h bola najlepším riešením pre túto kombináciu premenných. Surový etanolový extrakt (CEE) získaný za optimálnych extrakčných podmienok bol postupne frakcionovaný rozpúšťadlami so zvyšujúcou sa polaritou. Obsah celkových fenolových (TP) a celkových flavonoidov (TF), ako ajantioxidanta merali sa antiglykačné aktivity. Fytochemický profil odtlačkov prstov frakcie s najvyššou aktivitou bol charakterizovaný pomocou RP-HPLC. Etylacetátová frakcia (EAF) mala najvyšší obsah TP a TF a vykazovala najsilnejšie antioxidačné a antiglykačné aktivity. Výsledky Pearsonovej korelačnej analýzy ukázali, že obsahy TP a TF vysoko významne korelovali s antioxidačnými a antiglykačnými aktivitami. Celkovo bolo v EAF E. fragilis identifikovaných šesť zlúčenín, vrátane štyroch fenolových kyselín a dvoch flavonoidov. Okrem toho analýza molekulárneho dokovania tiež ukázala možné spojenie medzi identifikovanými bioaktívnymi zlúčeninami a ich mechanizmami účinku. Naše výsledky naznačujú nové dôkazy o antioxidačných a antiglykačných aktivitách bioaktívnych zlúčenín E. fragilis, ktoré možno použiť pri liečbe a prevencii starnutia a komplikácií spojených s glykáciou.

Kľúčové slová: Ephedra fragilis; metodika povrchu odozvy; Box-Behnken dizajn; bioaktívne zlúčeniny; RP-HPLC; antioxidačné a antiglykačné aktivity

Kliknutím sem sa dozviete viac produktov

1. Úvod

Neustála expozícia agresorom z rôznych zdrojov môže viesť k nárastuvoľné radikályprodukciu v ľudskom tele, prekračujúcu jeho schopnosť ich regulovať, a časom prispieva k rozvoju niekoľkých chorôb spojených s oxidačným stresom vrátane starnutia a cukrovky[1]. tedaantioxidantysuplementácia môže pomôcť udržať optimálny biologický systém odstránením nadmerných koncentrácií voľných radikálov [2]. Bolo preukázané, že voľné radikály sa podieľajú na procese glykácie. Glykácia, spontánna neenzymatická reakcia medzi dostupnými aminoskupinami aminokyselinových zvyškov v proteínoch a redukujúcich cukroch, sa vyskytuje vo väčšej miere pri starnutí a hyperglykémii, čo vedie k produkcii a akumulácii pokročilých konečných produktov glykácie (AGE) 3]. Okrem toho, že AGE interferujú s proteínmi a menia ich funkčnosť, môžu tiež

zapojiť sa s receptorom pre AGE (RAGE), 45 kDa multiligandovým bunkovým povrchovým receptorom patriacim do superrodiny imunoglobulínov [4] a aktivovať niekoľko downstream intracelulárnych signálnych dráh sprevádzaných zvýšením produkcie voľných radikálov, ktoré prispievajú k patologickým komplikáciám súvisiacim s na cukrovku [5].

Je dobre známe, že antioxidanty a molekuly lapačov radikálov sú dobrými ochrancami pred týmito procesmi [6]. Používanie liečivých rastlín pri prevencii a vyrovnávaní chorôb spojených s oxidačným stresom je starou lekárskou tradíciou. Nedávno mnohé štúdie preukázali, že sekundárne metabolity, ako sú taníny, fenolové kyseliny a flavonoidy s duálnym antioxidačným a antiglykačným potenciálom, sú účinnejšie pri liečbe diabetes mellitus [7]. Preto je veľmi zaujímavé identifikovať nové zdroje fytochemikálií, ktoré účinne zachytávajú voľné radikály a znižujú neenzymatickú glykáciu.

Ephedra fragilis je členom rodu Ephedra (čeľaď Ephedracea), ktorý obsahuje viac ako 60 druhov rastúcich v púštnych a semiaridných podmienkach na oboch hemisférach na šiestich kontinentoch [8]. Už viac ako 5000 rokov sa mnohé druhy z rodu Ephedra bežne používajú v tradičnej čínskej medicíne (TCM) na liečbu niekoľkých chorôb; niekoľko štúdií uvádza ich viaceré zdravotné prínosy, ako sú protizápalové [9, antiinvazívne, antiangiogénne, [10], antimikrobiálne, antiproliferatívne, proapoptotické[11], neuroprotektívne [12], hepatoprotektívne a proti -oxidačné vlastnosti [13]. Flavonoidy, alkaloidy, fenolové kyseliny a ďalšie zlúčeniny v rastlinách Ephedra boli považované za hlavné fytochemické zložky pre tieto farmakologické vlastnosti [14]. Vo farmaceutickom priemysle sa vysokoúčinná kvapalinová chromatografia s reverznou fázou (RP-HPLC) široko používa ako analytická metóda na detekciu a identifikáciu chemických zlúčenín na základe ich rôznych hydrofóbnych vlastností, hoci v literatúre je opísaných len málo štúdií na chemickú analýzu Druhy Ephedra.

Proces extrakcie týchto bioaktívnych zlúčenín z rôznych rastlinných zdrojov je prvým dôležitým krokom zahrnutým do ich kvalitatívnej a kvantitatívnej analýzy [15]. Rôzne faktory, napr. extrakčná metóda, typ a koncentrácia rozpúšťadla, teplota, čas a iné môžu významne ovplyvniť zloženie a rýchlosť extrakcie týchto zlúčenín [16]. Preto je potrebná optimalizácia extrakčných procesov na získanie vysokého obsahu rastlinných účinných látok. Metodológia povrchu odozvy (RSM), pôvodne vyvinutá v 50. rokoch 20. storočia Boxom a Wilsonom, je v súčasnosti najbežnejšie používaným nástrojom na vykonávanie, zlepšovanie a optimalizáciu takých procesov, v ktorých majú nezávislé faktory kombinovaný účinok na požadovanú odozvu. Jedným z najčastejšie vyberaných návrhov v RSM výskumníkmi je Box-Behnken design (BBD), pretože potrebuje obmedzený test, a preto predstavuje alternatívu, ktorá sa vyhýba dlhodobým experimentom a znižuje náklady [17-19].

Doposiaľ nie sú v literatúre dostupné žiadne štúdie týkajúce sa optimalizácie extrakcie bioaktívnych zlúčenín E. fragilis. Preto sa táto štúdia zamerala na optimalizáciu extrakcie celkového obsahu fenolov (TP) a flavonoidov (TF) z E. fragilis aplikáciou BBD. Surový etanolový extrakt (CEE) získaný za optimálnych extrakčných podmienok bol postupne frakcionovaný rozpúšťadlami so zvyšujúcou sa polaritou a ich antioxidačné a antiglykačné aktivity boli skúmané pomocou rôznych in vitro testov. Nakoniec sme vykonali analýzu in silico, aby sme ďalej pochopili mechanizmy, ktorými sa bioaktívne zlúčeniny v EAE, identifikované vysokoúčinnou kvapalinovou chromatografiou s reverznou fázou (RP-HPLC), viažu na BSA a RAGE ako cieľové proteíny.

2. Výsledky a diskusia

2.1. Montáž modelov

RSM with a BBD was applied to investigate the effect of ethanol concentration (%, Xj), temperature(°C, X2), and time (h, X3)on the extraction yield of TP and TF from E. fragilis. The results of 15 trials after the BBD are given in Table 1. Analysis of variance(ANOVA)(Table 2) indicates that the models were significant as evidenced by F and p-values. The coefficient of multiple determinations (R')of the models were 0.9935 and 0.9939 for TP and TF, respectively, suggesting that only 0.65 and 0.61%of the total variations are not explained by the models. A comparable value of adjusted R2 to R2 represents an excellent statistical model. As given in Table 2, the adjusted R2(0.9818 and 0.983 for TP and TF contents, respectively) is close to R2, which means that the insignificant terms were not included in the models. Moreover, predicted R2(0.9012 and 0.9338 for TP and TF contents, respectively) is in reasonable agreement with adjusted R2 and confirms that the models are highly significant. The"fitness" of the models was also confirmed using the lack of fit test The insignificant p-value for lack of fit (p >{{0}}.05) pre dve odpovede označuje vhodnosť modelov na presnú predpoveď variácií výsledkov [20]. Dobrá presnosť je opísaná ako pomer signálu k šumu väčší ako 4, čo sa považuje za žiaduce [21]. Hodnoty primeranej presnosti sú 29,4772 a 28,729 pre obsah TP a TF, čo dokazuje primeraný signál. Súčasne menšie hodnoty variačného koeficientu (CV percentá) (1,52 a 0,4246 percent pre obsah TP a TF, v tomto poradí) naznačujú lepšiu presnosť a spoľahlivosť experimentálnych hodnôt. Pre každý faktor odozvy sa starostlivo skúmal vplyv extrakčných faktorov XI (koncentrácia etanolu), X2 (extrakčná teplota) a X3 (čas extrakcie) (tabuľka 2). Význam každého koeficientu bol testovaný pomocou F a p-hodnôt, berúc do úvahy, že väčšia F-hodnota a menšia p-hodnota vždy viedli k významnejšej zhode medzi rôznymi nezávislými premennými [22]. Súhrnne tieto výsledky ukázali, že modely boli reprodukovateľné a boli vhodné na optimalizáciu.

2.2. Účinky extrakčných premenných na obsah TP

Ako je uvedené v tabuľke 2, výsledky ANOVA ukázali významné lineárne (X a X2), kvadratické (Xj, X5 a X) a interaktívne (X1X a X2X3) účinky na obsah TP. Medzi nimi obsah TP závisí hlavne od X, X3 na s<0.001 followed="" by="" x1="" and="" x1x,="" at=""><0.01. the="" following="" second-order="" polynomial="" equation="" could="" be="" used="" to="" express="" the="" relationship="" between="" tp="" content="" and="">

Hodnota nezhody bola nevýznamná (F-hodnota =11,02, p-hodnota=0,0843), čo naznačuje, že model je dobre nastavený s dobrou predikciou (R{ {9}}.9935; Úprava R2=0.9818)(tabuľka 2).

Interakcie medzi koncentráciou etanolu a teplotou extrakcie (XjX2) spôsobujú veľmi významné (str<0.01)effect on="" tp="" content="" (table2).="" as="" ethanol="" concentration="" (x1)="" and="" extraction="" temperature="" (x)increase="" in="" the="" range="" of="" 40-61.80%="" and="" 25-44.30°c="" respectively,="" the="" tp="" content="" increases="" rapidly.="" however,="" beyond="" 61.80%and="" 44.30°c,="" tp="" content="" decreases="" slightly(figure="" 1a).="" however,="" the="" interaction="" of="" the="" extraction="" temperature="" and="" extraction="" time="" (x2x3)showed="" a="" highly=""><0.001) effect="" on="" tp="" content="" (table="" 2).="" as="" shown="" in="" figure="" 1b,="" tp="" content="" slightly="" improved="" with="" increasing="" extraction="" temperature="" (x2)and="" extraction="" time="" (x3)up="" to="" 44.37℃c="" and="" 15.77="" h,="" respectively,="" but="" diminished="" slowly="">

Tieto účinky by mohli byť spôsobené skutočnosťou, že fenolové zlúčeniny sú polárne molekuly, ktoré sa prirodzene vyskytujú s glukozidmi, vďaka čomu sú rozpustnejšie vo vode [23]. Keďže extrakcia fenolových zlúčenín je silne závislá od polarity rozpúšťadla, zmes vody a alkoholu je pri jej extrakcii účinnejšia ako samotný alkohol [20]. Vzhľadom na princíp „podobné-rozpúšťa-ako“ vedie zníženie koncentrácie etanolu k zvýšeniu polarity rozpúšťadla, čo napomáha rozpúšťaniu TP[15]. Vysoká koncentrácia etanolu však môže ovplyvniť rýchlosť extrakcie tým, že zabráni rozpúšťaniu fenolových zlúčenín. Podobne zvýšenie extrakčnej teploty zvýšilo regeneráciu cieľových fenolových zlúčenín zmäkčením tkanív, oslabilo integritu bunkovej steny, zvýšilo prenos hmoty a penetráciu rozpúšťadla do matrice rastliny a zvýšilo tak rozpustnosť, ako aj rýchlosť difúzie; avšak príliš vysoké teploty na dlhší čas extrakcie môžu zvýšiť pravdepodobnosť ich degradácie [23]. Okrem toho sa zistilo, že dlhá doba extrakcie potenciálne predlžuje vystavenie kyslíku a svetlu, čo v konečnom dôsledku zvyšuje riziko tvorby voľných radikálov, ktoré môžu byť zachytávané fenolovými zlúčeninami [23]. Preto predĺžený čas extrakcie nebol užitočný na maximalizáciu výťažku extrakcie [24].

2.3. Účinky extrakčných premenných na obsah TF

Ako je zrejmé z tabuľky 2, lineárne účinky X a X3; kvadratické účinky X a X; a interakčný účinok X1X2 a XjXg preukázal významné účinky na obsah TF. Spomedzi všetkých významných faktorov TF závisí hlavne od X3, X, X, X a X1X2 pri p<0.001 followed="" by="" x="" andx1x3="" at=""><0.01. the="" fitted="" second-order="" polynomial="" of="" tf="" content="" is="" as="">

Nevýznamná hodnota nedostatku zhody (F-hodnota=1.13; p-hodnota=0.5024) naznačovala, že navrhovaný model vyhovuje priestorovému vplyvu premenných na odozvu s dobrou predpoveď (R2=0.9939; Adj R2= 0.9830) (tabuľka 2).

Pre obsah TF boli vytvorené rôzne 3D grafy povrchu odozvy a znázornené na obrázku 1D-F. Interakčný účinok koncentrácie etanolu a extrakčnej teploty (X1X2) ukázal významný (str<0.001) effect="" on="" tf="" content.="" from="" figure="" 1d,="" tf="" content="" increased="" at="" first="" and="" then="" decreased="" quickly="" with="" the="" rise="" of="" the="" two="" parameters,="" and="" a="" maximum="" tf="" content="" was="" achieved="" when="" ethanol="" concentration="" (xj)="" and="" extraction="" temperature="" (xo)were="" 61.89%="" and="" 44.23°c,="" respectively.="" this="" phenomenon="" is="" similar="" to="" tp,="" which="" might="" also="" be="" attributed="" to="" the="" fact="" that="" a="" rise="" in="" the="" extraction="" temperature,="" the="" solubility,="" extraction="" rate,="" and="" diffusion="" rate="" increase,="" which="" ultimately="" helps="" tf="" to="" dissolve="" insolvent="">

Podobne interakcia medzi koncentráciou etanolu a časom extrakcie (XIX3) ukázala podobnú koreláciu (obrázok 1F). Výťažok extrakcie TF sa postupne zvyšoval so zvyšujúcou sa koncentráciou etanolu (Xj) a časom extrakcie (X3). Blízko stredu grafu odozvy (61,89 percent a 15,81 h pre X a X3), výťažok TF dosiahol svoj najvyšší, ale potom pomaly klesal. Tento jav je s najväčšou pravdepodobnosťou spôsobený druhým Fickovým zákonom difúzie, ktorý odhaľuje, že konečná rovnováha medzi koncentráciou roztoku v pevnej matrici a rozpúšťadlom sa dosiahne po určitom čase, čo vedie k spomaleniu výťažku extrakcie cieľových zlúčenín [26]. .

2.4. Validácia optimalizovaných podmienok

Cieľom optimalizácie bolo určiť extrakčné podmienky, ktoré by súčasne poskytovali najvyššie obsahy TP a TF. Na vykonanie optimalizácie bol použitý softvérový expertný návrh. BBD navrhla optimálnu koncentráciu etanolu, teplotu extrakcie a čas na extrakciu bioaktívnych zlúčenín E. fragilis 61,93 percenta, 44,43 stupňa a 15,84 hodiny. V tomto optimálnom bode boli predpokladané obsahy TP a TF 15,335 mg GAE/g sušiny a 2,972 mg OE/g sušiny (tabuľka 3). Validácia predikčnej kapacity modelov bola vykonaná experimentálne za optimálnych podmienok získaných z RSM. Experimenty sa uskutočnili trojmo za získaných podmienok a priemerné obsahy TP a TF boli 14,98±0,29GAE/g DW a 2,92±0,09 QE/g DW, v danom poradí. Experimentálne hodnoty skúmaných odpovedí boli porovnateľné a v súlade s predpokladanými hodnotami, čo potvrdilo, že modely boli dostatočné na to, aby odrážali očakávanú optimalizáciu.

2.5. Výťažok extrakcie a fytochemická analýza

Tabuľka 4 ukazuje výťažok extrakcie E. fragilis CEE a jej frakcií. Naše výsledky ukázali, že výťažok extrakcie v rôznych frakciách sa výrazne líši od 0,78 do 10,6 percenta (w/wo). Ako je uvedené v tabuľke 4, CEE(1{{14} },6 percenta ) mali najvyšší percentuálny výnos, za ním nasledovali WF (2,73 percenta), WBF (2.04 percentá), DMF (0,64 percenta) a EAF (0,93 percenta), zatiaľ čo HF (0,78 percenta ) mal najnižší percentuálny výnos.

Obsah TP E. fragilis CEE a jeho frakcií bol stanovený pomocou regresnej rovnice kalibračnej krivky (y {{0}}.009x-0.{{{101} 25}}154; R2=0.9973) a vyjadrené v miligramoch ekvivalentov kyseliny galovej (GAE) na gram suchej hmotnosti (tabuľka 4). Vo všeobecnosti mala EAF najvyšší obsah TP (32,78±0,49 mg GAE/g DW), po ktorej nasledovali WBF, DMF a CEE (25,02±1,01, 19,21±0,22 a 14,98±0,29 mg GAE/g DW), zatiaľ čo WF a HF vykazovali najnižšie obsahy (10,47 ± 0,71 a 8,14 ± 0,17 mg GAE/g DW, v tomto poradí). Obsah TF v E. fragilis CEE a jeho frakciách bol hodnotený kolorimetrickým testom s použitím chloridu hlinitéhokvercetínas a standard (y=0.0295x+0.0361; R2=0.9986)(Table 4). Similar to the TP content, the same results were observed in the TF content with the highest and lowest content being detected in the EAF(10.50 ± 0.11 mg OE/g of DW)and HF(1.65± 0.13 mg OE/g of DW), respectively. The TF content is arranged as the following sequence: EAF>WBF>DMF> CEE>WF>HF. Je zaujímavé, že obsah TP a TF v EAF bol 2,18 a 3.{3}}krát vyšší ako v CEE, čo naznačuje, že etylacetát môže byť vhodným rozpúšťadlom na koncentrovanie dostupnejších fenolických a flavonoidových zlúčenín počas frakcionácie CEE. Naše údaje týkajúce sa obsahu TP a TF sú v súlade s údajmi Yao et al. [27], ktorí uvádzajú, že EAF získané z liečivej rastliny Pyrola asarifolia mali najvyššie hladiny fenolov a flavonoidov v porovnaní s ostatnými frakciami (petroléter, n-butanol a voda). Vo svojej štúdii Bhardwaj et al. [28] tiež uvádza podobné výsledky pri použití niekoľkých rozpúšťadiel so zvyšujúcou sa polaritou (n-hexán, chloroform, etylacetát a n-butanol) pri štiepení liečivej rastliny Codonopsis clematidea. Podľa týchto autorov má EAF najvyšší obsah TP a TF, po ktorom nasledujú n-butanol, chloroform a hexán. Táto významná odchýlka vo výťažkoch extrakcie, zložení a čistote fenolových zlúčenín medzi jednotlivými frakciami je pravdepodobne spôsobená rozdielmi v polarite zložiek nachádzajúcich sa v rastlinných materiáloch, ich chemickej štruktúre, stupni polymerizácie a ich vzájomných interakciách [29 ].

2.6. Antioxidačná aktivita in vitro

2.6.1.DPPH „Činnosť čistenia“.

DPPH" je jedným z mála stabilných voľných radikálov, ktoré sa široko používajú na skúmanie antioxidačného potenciálu rastlinných extraktov [30]. Potenciál lapača extraktu sa často spája s jeho schopnosťou zachytávať stabilné voľné radikály, čo je spôsobené jeho schopnosťou darovať vodík .

Študovala sa schopnosť zachytávania CEE/frakcií, ako aj VC pri rôznych dávkach na DPPH* voľný radikál. Obrázok 2A ukazuje, že všetky frakcie vykazovali zjavnú aktivitu vychytávania DPPH spôsobom závislým od dávky v rozsahu 0,1 až 1 mg/ml. Pri dávke 1 mg/ml 64,32, 44,1{{22} },67,24,86,63,80,95,51,37 a 99,62 percent radikálov DPPH boli uhasené pomocou CEE, HE, DMF, EAF, WBF, WF a VC. Najnižšie IC50 pre zachytávanie DPPH“ spomedzi všetkých frakcií vykázal EAF (0.116±{{30}}.015 mg/ml )nasleduje WBF (0,175 ± 0.03 mg/ml), CEE (0,23 ± 0,065 mg/ml) a DMF (0,297 ± 0,044 mg/ml). WF a HF vykazovali porovnateľne vyššie hodnoty IC50 (0,964 ± 0,178 a 1,245 ± 0,105 mg/ml).

Observed differentials in the scavenging activities of the fractions against the DPPH*radical may be assigned to the structural characteristics and the number of phenolic compounds present in each fraction. Similar results were observed in the medicinal plant Liquidambar formosana Hance leaf since the EAF was more effective than the other fractions (dichloromethane, n-butanol, and water fractions)[31]. As a standard molecule, ascorbic acid (VC) displayed the lowest IC50 value (0.039 ±0.009 mg/mL) in comparison to all fractions. The scavenging potential is in decreasing order of VC>EAF> WBF>DMF >CEE>WF>HF.

Hodnota IC50 pre vychytávanie radikálov DPPH významne pozitívne korelovala s oboma obsahom TP (r=0,963;p<0.01) and="" tf="" content(r=""><0.01)as presented="" in="" table="" 5.="" therefore,="" the="" discovered="" antioxidant="" activity="" suggested="" that="" eaf="" can="" be="" a="" source="" of="" numerous="" natural="" compounds="" with="" antioxidant="" properties="" that="" can="" act="" as="" hydrogen="" donors="" to="" terminate="" the="" process="" of="" oxidation="" by="" converting="" the="" free="" radicals="" to="" their="" stable="">

2.6.2.ABTS· plus Činnosť čistenia

Test vychytávania ABTS sa vo veľkej miere používa ako index na informovanie a skúmanie antioxidačnej kapacity čistých zlúčenín, ako aj prírodných extraktov [32,33]. Vyblednutie modrej/zelenej farby chromofóru ABTS* na 734 v prítomnosti rastlinného extraktu môže naznačovať antioxidačnú aktivitu.

Ako je znázornené na obrázku 2B, krivka zachytávania CEE/frakcií na ABTS* plus vykazovala stúpajúci trend so zvyšujúcou sa koncentráciou. Pri 1 mg/ml boli rýchlosti zachytávania CEE, HF, DMF, WBF, EAF, WF a VC 80,31,40,54,88,76, 9{{2{ {22}}}} 0,11, 82,97, 67,36 a 94,90 percent, v uvedenom poradí. Spomedzi všetkých frakcií minimálnu hodnotu IC0 vykázal EAF(0.11{{30}}±0.014 mg/ ml) ďalej DMF (0,196±0.023 mg/ml),WBF (00,277±0,031 mg/ml), CEE(0,429 ± 0,039 mg/ml) a WF (0,654 ± 0,043 mg/ml), zatiaľ čo HF vykazoval najvyššiu hodnotu ICso (1,314 ± 0,104 mg/ml). Súhrnne sa toto zistenie zhodovalo s nálezom Kaewseejana a Siriamornpuna [29]. Porovnanie s inhibičnou kapacitou VC (0,025±0,005 mg/ml) ukázalo, že zachytávacia aktivita CEE a jej frakcií bola mierne slabá.

Ako je uvedené v tabuľke 5, vysoko významná korelácia vychytávania radikálov ABTS s obsahom TP (r=0.921;p<0.01), and="" a="" significant="" correlation="" with="" tf="" content="" (r=""><0.05), were="" shown.="" this="" finding="" confirms="" the="" results="" obtained="" for="" the="" dpph*scavenging="" assay,="" proving="" the="" capacity="" of="" eaf="" to="" scavenge="" free="">

2.6.3. Činnosť zachytávania H2O2

Ako hlavný prispievateľ k oxidačnému stresu H2O2 ľahko difunduje bunkami cez membránu ako mediátorová molekula [34]. Celkovo H2O2 sám o sebe nie je nebezpečný [35], ale môže reagovať s Fe2 prostredníctvom Fentonovej reakcie a vedie k vzniku vysoko reaktívneho hydroxylového radikálu (OH*)[36]. Z ROS teda najviac poškodzuje biomolekuly. Je preto potrebné vyhodnotiť schopnosť CCE a jej rôznych frakcií zachytávať H2O2.

Scavenging activities of CEE/fractions, as well as standard antioxidants, were presented in Figure 2C. Notably, all extracts showed a strong scavenging activity on HO, which increased with the increase of sample doses ranging from 0.1 to 1 mg/mL. Moreover, the H2O2 scavenging potential decreased in the order of EAF> WBF>DMF>CEE>WF>HF a zodpovedajúce vychytávacie schopnosti pri 1.0 mg/ml boli 84,56; 75,24; 67,17; 56,18;

Spomedzi všetkých frakcií vykazoval EAF najnižšiu hodnotu IC50 (ICs0= 0.098±{7}},013 mg/ml) a bola výrazne vyššia ako hodnota VC (0,024 ± 0,006 mg/ml). Môže to byť spôsobené prítomnosťou vysoko fenolických a flavonoidných zlúčenín v EAF, o ktorých je všeobecne známe, že hrajú kľúčovú úlohu ako antioxidanty v biologických systémoch. V našej nedávnej štúdii sme preukázali schopnosť EAF z E. fragilis chrániť Tetrahymena pyriformis proti oxidačnému poškodeniu vyvolanému H2O2- [37].

Naša analýza údajov ukázala, že pokiaľ ide o výsledky DPPH" a ABTS* plus, bola zaznamenaná silná pozitívna korelácia hodnôt IC0 pre zachytávanie H2O2 s obsahom TP (r=0,926; p<0.01) and="" tf="" content="" (r=""><0.01)(table 5).="" in="" their="" study,="" sroka="" and="" cisowski="" [38]="" reported="" also="" a="" positive="" correlation="" between="" phenolic="" compounds="" with="" ho2-scavenging="" ability.="" according="" to="" these="" authors,="" the="" ho2-scavenging="" depended="" strongly="" on="" the="" number,="" positions,="" and="" the="" model="" of="" substitution="" of="" oh="" bonded="" to="" the="" aromatic="" ring="" of="" phenolic="">

2.6.4. Zníženie výkonu

Redukujúca sila extraktu pôsobí ako indikátor jeho potenciálnej antioxidačnej aktivity [39, A40]. Antioxidačný potenciál sa odhaduje na základe schopnosti antioxidantov redukovať železo (Fe3) v chloride železitom na železnaté (Fe2 plus). Vo všeobecnosti sa redukčné vlastnosti pripisujú prítomnosti reduktónov v rastlinných extraktoch, o ktorých sa vie, že pôsobia tak, že rozbijú reťazec voľných radikálov darovaním atómu vodíka [41].

Obrázok 2D ukazuje krivku dávka-odozva pre redukčnú silu extraktov E. fragilis. Je známe, že čím vyššia je absorbancia pri 700 nm, tým väčšia je schopnosť redukcie. V súčasnej štúdii CEE a jej päť frakcií vykazovali značnú redukčnú silu v závislosti od koncentrácie.

EAF vykázala maximálnu antioxidačnú aktivitu (EC{{0}},136± 0.{{10}}13 mg/ml) v porovnaní s VC(EC{{4 }}.083± 0.005 mg/ml). Za ním nasledovali WBF (EC50=0 0,180 ± 0,028 mg/ml), DMF (EC50=0,319 ± 0,031 mg/ml), CEE (EC50=0,334±0,029 mg/ml) a WF (EC50=0,398±0,064 mg/ml) .HF zaostávala a vykazovala minimálnu redukčnú energetickú aktivitu (EC5s0 =0.626±0,068 mg/ml) v porovnaní s inými frakciami. Tieto zistenia naznačujú, že EAF môže obsahovať rôzne jednotlivé zlúčeniny, ktoré majú účinnú a silnú redukciu energetickej aktivity. Vedci zistili, že etylacetátové extrakty môžu slúžiť ako silné antioxidanty [42].

Pozitívna korelácia bola pozorovaná medzi redukujúcim výkonom a obsahom TP aj TF (r=0,975; p<0.01 and="" r="0.987;"><0.01; respectively).these="" correlations="" confirmed="" the="" contribution="" of="" phenolic="" compounds="" in="" the="" reducing="" power="">

2.6.5. Fosfomolybdénový test

TAC CEE a jej frakcií, ako aj VC boli hodnotené pomocou fosfomolybdénového testu a vyjadrené ako EC0, čo je koncentrácia poskytujúca 0,5 absorbancie. Metóda bola založená na redukcii Mo(VI) na Mo(V) pomocou extraktov za vzniku komplexu zelený fosforečnan/Mo (V) pri kyslom pH s maximálnou absorpciou pri 695 nm [43].

As shown in Figure 2E, the total antioxidant capacity of CCE/fractions and VC correlated well with increasing concentrations in the range of 0.1 to 1 mg/mL.Of the CEE fractions, the ECs0 values ranged from 0.159±0.019 to 0.604±0.073 mg/mL, with a descending order of EAF>WBF> DMF> CEE >WF>HF(str<0.05), which="" indicates="" that="" eaf="" and="" hf="" had="" the="" highest="" and="" lowest="" antioxidant="" activity,="" respectively.="" this="" activity="" could="" be="" due="" to="" the="" presence="" in="" eaf="" of="" various="" phenolic="" compounds="" that="" might="" possess="" antioxidant="" activity.="" vc,="" which="" is="" the="" positive="" control,="" displayed="" the="" lowest="" ec5o="" value="" (0.095±="" 0.008="" mg/ml)="" in="" comparison="" to="" all="">

Bola pozorovaná vysoko významná korelácia medzi celkovou antioxidačnou aktivitou a obsahom TP a obsahom TF (r=0,978 pre obe;p<0.01) and="" is="" shown="" as="" presented="" in="">

2.6.6. - Modelový systém karotén-linoleát

V modeli -karotén-kyselina linolová podliehajú molekuly vysoko nenasýteného karoténu rýchlemu odfarbeniu v dôsledku voľných radikálov linoleátu generovaných oxidáciou kyseliny linolovej [44]. Suplementácia antioxidantmi by mohla minimalizovať oxidáciu -karoténu neutralizáciou voľných radikálov linoleátu, a tým inhibovať bielenie -karoténu [45].

Antioxidant activity of CCE/fractions and BHT, as measured by the β-carotene-linoleate model, are shown in Figure 2F. All tested extracts showed concentration-dependent scavenging activity. The EAF, which contained the highest amount of phenolics and flavonoids contents, showed a significant effect in inhibiting β-carotene bleaching, reaching 74.75%at a concentration of 1mg/mL. WBF, CCE, DMF, HF, and WF inhibited the oxidation of β-carotene by 51.61,58.12,50.09,41.39, and 31.66% respectively, at the same concentration. Overall, decreasing antioxidant activity was depicted as EAF> WBF> CEE>DMF>HF>WF.

EAF zobrazila minimálnu hodnotu IC50 (IC50=0,127 ± 0.{{10}}42 mg/ml) v porovnaní s BHT (ICs { {5}}.049 ± 0.001 mg/ml). WBF. CCE. DME. MY. a HF vykazovali porovnateľne vyššie hodnoty IC0 0,5 ± 0,111 mg/ml, 0,998 ± 0,101 mg/ml, 1,073 ± 0,084 mg/ml, 1,402 ± 0,058 mg/ml a 2,209 ± 0,081 mg/ml, v tomto poradí.

Významná pozitívna korelácia bola pozorovaná medzi zachytávaním oxidácie karoténu a obsahom TP (r= 0.850;p<0.05) and="" tf="" content="" (r=""><0.05)(table 5).="" this="" result="" suggests="" that="" eaf="" may="" contain="" some="" antioxidants="" that="" can="" inhibit="" the="" formation="" of="" hydroperoxide="" and="" stop="" the="" radical-chain="" reaction="">

The involvement of reactive oxygen species (ROS) in several pathological situations has been growing recently. Bioactive compounds are gaining interest thanks to their potent antioxidant activity, but their complexity imposes the development of many methods to evaluate the antioxidant activity and the effectiveness of these chemical compounds. Thus, in this study, CEE and its fractions have been investigated for their antioxidant potential using six assays: DPPH, ABTS, H>O, RP, TAC a -karotén. Preto sme ukázali, že silné antioxidačné aktivity CEE a jej frakcií vykazovali vyššie zachytávacie aktivity, a to môže byť silne spôsobené ich zložením z kyseliny fenolovej a flavonoidov, ako je kyselina galová, rutín a kvercetín.