Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Imane Bensaada, Blaise Robin3, Joeille Perez', Yann Salemkour, Anna Chipont, Marine Camus, Mathilde Lemoine', Lea Guyonnet', Helene Lazareth', Emmanuel Letavernier, Carole Henique', Pierre-Louis Tharaux' a Olivia Lenoir

„Université de Paris, PARCC, Inserm, Paríž, Francúzsko; a Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cite, Paríž, Francúzsko

Silná prediktívna hodnota proteinúrie pri chronických glomerulopatiách je pevne stanovená, rovnako ako patogénna úloha angiotenzínu II podporujúca progresiu glomerulárnej choroby so zmenenou bariérou glomerulárnej filtrácie, poranením podocytov a zjazvením glomerulov. Tu sme zistili, že chronická hypertenzia indukovaná angiotenzínom II inhibovala tok autofágie v myších glomeruloch. Delécia Atg5 (gén kódujúci proteín zapojený do autofágie) špecificky v podocyte viedla k zrýchlenej podocytopatii indukovanej angiotenzínom I, zvýraznenej albuminúrii a glomeruloskleróze. To naznačuje, že autofágia je kľúčovým ochranným mechanizmom v podocyte v tomto stave. Aktivita calpainu indukovaná angiotenzínom-II v podocytoch inhibuje tok autofágie. Podocyty z myší s transgénnou expresiou endogénneho inhibítora calpainu calpastatínu vykazovali na začiatku vyššiu autofágiu podocytov, ktorá bola odolná voči inhibícii závislej od angiotenzínu II. Tiež trvalá autofágia s kalpastatínom obmedzovala poškodenie podocytov a albuminúriu. Tieto zistenia naznačujú, že hypertenzia má patogénne účinky na glomerulárnu štruktúru a funkciu, čiastočne prostredníctvom aktivácie calpaínov, čo vedie k blokáde autofágie podocytov. Tieto zistenia odhaľujú originálny mechanizmus, ktorým hypertenzia sprostredkovaná angiotenzínom II inhibuje autofágiu prostredníctvom vápnikom indukovaného náboru kalpaínu s patogénnymi následkami v prípade nerovnováhy aktivity kalpastatínu. Zabránenie poklesu autofágie sprostredkovaného calpaínom teda môže byť sľubnou novou terapeutickou stratégiou pre nefropatie spojené s vysokou aktivitou renín-angiotenzínového systému.

Cistanchedeserticola zabraňujeobličkychoroba

Prekladové vyhlásenie

Vzhľadom na kľúčovú úlohu autofágie pri vývojiobličkychorobyFarmakologická modulácia autofágie môže byť sľubnou stratégiou na prevenciu a liečbu niekoľkých ochorení obličiek. Paralelne sa zistilo, že nadmerná aktivácia aktivity calpainu v podocytoch má škodlivé účinky na funkciu podocytov, zatiaľ čo jeho škodlivé mechanizmy účinku neboli identifikované. Tu uvádzame dôkaz, že calpain spája škodlivý účinok angiotenzínu II so škodlivou blokádou autofágie v podocytoch a navrhujeme, že inhibícia calpainu by mohla byť sľubným terapeutickým cieľom pre ochorenia podocytov čiastočne prostredníctvom udržiavania autofágie podocytov.

Hypertenzia je na druhom mieste po cukrovke ako hlavná príčina progresívneho ochoreniachronickýobličkychoroba- a dokonca aj mierne zvýšenie krvného tlaku je nezávislým rizikovým faktorom pre konečné štádium ochorenia obličiek. Rastúci počet experimentálnych štúdií zdôraznil význam podocytov pri vývojiobličkyzranenie. Progresívna strata podocytov a mikrovaskulárne zmeny sa objavujú skoro s funkčným poklesom obličiek pri experimentálnej hypertenznej nefropatii. U pacientov sa ukázalo, že vylučovanie životaschopných podocytov močom je citlivým a špecifickým markerom preeklampsie a pacienti s nefrosklerózou mali výrazne nižšiu hustotu glomerulárnych podocytov ako darcovia obličiek. Okrem toho je dobre známa patogénna úloha angiotenzínu II (Angel) pri podpore progresie glomerulárnej choroby, a to nielen pri hypertenzných stavoch, ale aj pri niekoľkých glomerulárnych ochoreniach.

Glomerulárna hypertenzia má za následok naťahovanie glomerulárnych kapilár, poškodenie endotelu a zvýšenú filtráciu glomerulárnych proteínov, čo spôsobuje glomerulárny kolaps a glomerulosklerózu. Pôsobí tiež priamo na glomerulárne štruktúry, čo spôsobuje signálne regulačné reakcie zamerané na kompenzáciu. Aktivovaný systémový a lokálny renín-angiotenzín-aldosterónový systém (RAAS) podporuje mezangiálnu hyperpláziu a syntézu faktorov vaskulárnej permeability. Súčasne podocyty vykazujú vápnikovú signalizáciu a modifikujú svoj tvar na receptore Angli typu 1 (AT1)-28Tieto adaptačné mechanizmy závisia od stimulácie.{5}} sa z dlhodobého hľadiska stávajú maladaptívnymi, čo nakoniec vedie k glomeruloskleróze. AT1 sprostredkuje výrazné zapojenie RAAS do krvného tlaku a homeostázy soli a vody. Inhibítory angiotenzín-konvertujúceho enzýmu a blokátory AT1 sa klinicky používajú na liečbu hypertenzie a srdcového zlyhania u pacientov. Zaujímavé je, že oba blokátory tiež vykazujú ochranný účinok naobličkyfunkciu.

Ukázalo sa, že autofágia je nevyhnutná pre udržanie bunkovej homeostázy, najmä v postmitotických a najmä v podocytoch.{0}} Autofágia je systém degradácie cytoplazmatických proteínov a dysfunkčných organel s dlhou životnosťou spojený s olyzozómami55 a zahŕňa sekvestráciu proteínov a organel v autofagozómoch. Tvorba autofagozómov závisí od indukcie niekoľkých génov vrátane Mapllc3a / b, Berlin 1 a Atgs. Existuje čoraz viac dôkazov, že dysregulácia autofagickej dráhy sa podieľa na patogenézeobličkystarnutie a niekoľkoobličkychoroby, ako je akútne poškodenie obličiek, polycystická choroba obličiek, starnutie a diabetická nefropatia.

Regulácia autofágie v podocytoch, fyziologická a predovšetkým v patologickom kontexte, nie je dobre známa. Nedávno sme demonštrovali, že autofágia podocytov je nezávislá od mechanického cieľa regulácie rapamycínu (mTOR) vo fyziologických podmienkach, vďaka čomu je tento typ bunky výnimkou. Aktivácia AT1 stimuluje syntézu bielkovín a premenu bielkovín v bunkách. Preto sme usúdili, že aktivácia RAAS môže tiež ovplyvniť stimuláciu obratu proteínov a proteostázu.

V tejto štúdii sme sa zamerali na úlohu signalizácie AngLI v regulácii autofágie podocytov. Identifikovali sme vápnikom aktivované proteázy kalpaíny sprostredkujúce chronický blokujúci účinok AngLI na autofágiu podocytov. Ďalej sme zistili, že endogénny inhibítor calpainu calpastatin bol schopný zabrániť autofágovej inhibícii závislej od AngI a poškodeniu podocytov počas hypertenzie.

Tieto zistenia odhaľujú originálny mechanizmus, ktorým hypertenzia sprostredkovaná AngLI inhibuje autofágiu prostredníctvom vápnikom indukovaného náboru calpainu s patogénnymi následkami v prípade nerovnováhy aktivitou kalpastatínu.

METÓDY

Zvieratá

Kalpastatínové transgénne myši (CST18) láskavo poskytol Dr. E. Letavernier. Myši s prerušením Atg5 špecifickým pre podocyty sa generovali podľa vyššie opísaného génu (Nphs2.cre Atg5'o krížením myší Nphs2.cre s Ag5lxlomice5 na pozadí C57BL6/J. Myši Nphs2.cre Atg5'oxlox a kontrolné samce súrodencov , vo veku 10 až 12 týždňov. Hypertenzný model bol indukovaný sc infúziou AngLI (Sigma-Aldrich, A9525) v dávke 1 ug/kg/min počas 4 až 6 týždňov prostredníctvom osmotické minipumpy (Alzet Corp, model 2006). Pumpy boli implantované do chrbta medzi lopatky a boky. Myši dostávali suplementáciu soli (3 percentá NaCl) v potrave. Atgsloxilox (wild-type [WT]) myši boli použité ako kontroly v všetky štúdie. Pre deoxykortikosterónacetátovú (DOCA) soľ s modelom redukcie nefrónov dospelí samci myší podstúpili jednostrannú ľavú nefrektómiu. Dva týždne po nefrektómii dostali DOCA pelety s 21-dňovým uvoľňovaním (Innovative Research of America) implantovaným sc. Druhá peleta bola implantovaná 3 týždne po prvej implantácii.Všetky myši re dostávali 0,9 percenta NaCl v pitnej vode ad libitum a boli usmrtení po 6 týždňoch podávania DOC.6 Pokusy sa uskutočňovali podľa francúzskych veterinárnych smerníc a smerníc formulovaných Európskym spoločenstvom na použitie na pokusných zvieratách (L358-86/609EEC) a boli schválené francúzskym ministerstvom výskumu a etickou komisiou pre výskum miestnej univerzity (APAFIS-7646 a -22373).

Primárny experiment s kultiváciou podocytov

Diferencované primárne podocyty sa kultivovali tak, ako bolo opísané vyššie./V krátkosti, čerstvo izolovaná obličková kôra bola zmiešaná a štiepená kolagenázou I (Gibco, {{0}}) v Roswell Park Memorial Institute 1640 (Life Technologies,{{2 }}). Tkanivá potom prešli cez 70 μm a 40 μm bunkové sitá (BD Falcon, 352340 a 352350). Glomeruli, ktoré priľnuli k 40 um bunkovému sitku, sa odstránili pomocou fosfátom pufrovaného fyziologického roztoku (PBS; Life Technologies, 10010023) plus 0,5 percenta hovädzieho sérového albumínu (Eurobio, HALALB07-65) vstreknutého pod tlakom a potom sa dvakrát premyli v PBS. Čerstvo izolované glomeruly boli nanesené na 6-jamkové misky v Roswell Park Memorial Institute 1640 (Gibco, 61870036) doplnené 10 percentami fetálneho teľacieho séra a 1 percentom penicilínu/streptomycínu (Life Technologies, 15140122), aby sa umožnilo podocytom opustiť glomeruly a rastú. Obohatenie podocytov sa overilo analýzou Western blot ako predtým (doplnkový obrázok S1). Podocyty sa kultivovali v neprítomnosti alebo prítomnosti bafilomycínu Al (100 nmol/, Sigma-Aldrich, B1793) počas 4 hodín. Na imunofluorescenčné experimenty boli primárne podocyty nanesené na 4 misky so štítkami (Dutcher, 055071). Podocyty sa potom fixovali v paraformaldehyde 4 percentá počas 10 minút a spracovali sa na imunofluorescenciu.

Test aktivity kalpaínu

Intracelulárna aktivita calpainu bola stanovená v primárnych podocytoch, ako už bolo opísané. Celkovo 100000 buniek bolo kultivovaných v 24-jamkových kultivačných miskách na tkanivovú kultiváciu v Roswell Park Memorial Institute 1640 doplnených 10 percentami fetálneho teľacieho séra a 1 percentom penicilínu/streptomycínu. Po uplynutí uvedenej doby kultivácie sa médium nahradilo Krebs-Ringerovým roztokom bikarbonátu HEPES (KRH) (pH 7,4) obsahujúcim 4 mM CaCl2 s alebo bez 10 uM inhibítora calpainu-1 a inkubovalo sa 10 minút pred pridaním 50 mM calpainového substrátu N-sukcinyl-Leu-Leu-Val-Tyr-7-amino-4-metylkumarínu (Sigma-Aldrich, S6510). Po 90-minútovej inkubačnej dobe sa aktivita cal-pain stanovila ako rozdiel medzi fluorescenciou (meranou pri excitácii 360 nm a emisii 430 nm) s inhibítorom calpain a bez neho-1.

Western blot

Primárne podocyty boli poškriabané 8 0 ul rádioimunoprecipitačného testovacieho pufra obsahujúceho fosfatázu a inhibítor proteázy. Koncentrácia proteínu sa merala pomocou súpravy BCA Protein Assay Kit (Merck Biochemistry, 71285). Dvadsať mikrogramov proteínov bolo podrobených elektroforéze na prefabrikovanom géli Criterion XT (12 percent Bis-Tris, Bio-Rad, 3450124). Proteíny sa preniesli na polyvinylidéndifluoridovú membránu (Thermo Fischer Scientific, 88518). Po blokovaní v 5 percentnom mlieku v Tris Buffer Saline 0,1 percenta Tween (TBS-T) sa membrány inkubovali s králičou polyklonálnou anti-LC3 (1:1000, Cell Signaling Technology, 2575), králičou polyklonálnou anti-ATG5 (1:2000,Cell Signaling Technology,2630),morčacia polyklonálna anti-sekvestozóm 1 (SQSTM1)/P62(1:10 000, PROGEN,GP62), králičia polyklonálna anti-calpain 1 doména IV (1:1000, Abcam,ab39170 ), králičí polyklonálny anti-calpain 2 amino-terminálny koniec domény I (1:1000, Abcam, ab39165), myší monoklonálny IgG1 anti-calpain 4 (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, sc{46}}),králik anti-podocin (1:1000, Abcam, ab50339), morčacia anti-nefrín (1:500, PROGEN, GP-N2) a potkania monoklonálna anti-tubulínová (1:5000, Abcam, ab6160) protilátka. Po premytí boli membrány inkubované s protilátkou spojenou s chrenovou peroxidázou (1:2000, Cell Signaling Technology, 7074, 7076, 7077). Detekcia špecifických signálov bola uskutočnená pomocou ECL Chemiluminiscent Kit (Bio-Rad, 170-5070) na zariadení LAS 4000 (Fuji). Na kvantifikáciu bola použitá denzitometrická analýza pomocou softvéru ImageJ (National Institutes of Health).

Meranie krvného tlaku a fyziologické hodnotenie

Systolický krvný tlak myší sa zaznamenával pomocou metódy manžety na chvoste (Visitech Systems Inc., BP-2000). Od každej myši sa uskutočnilo desať meraní a potom sa určila stredná hodnota. Systolický krvný tlak sa meral na začiatku (12 týždňov veku) a potom každý týždeň až do konca liečebného obdobia. Všetky myši boli umiestnené do metabolických klietok s voľným prístupom k vode na 6-hodinový zber moču. Koncentrácie kreatinínu v moči a močoviny v plazme sa analyzovali spektrofotometricky použitím kolorimetrickej metódy (Olympus, AU400). Vylučovanie albumínu močom sa meralo s použitím špecifického enzýmového imunosorbentového testu na kvantitatívne stanovenie albumínu v moči myší (Crystal Chem, 80630).

Histológia

Obličky boli odobraté a fixované v 4 percentnom PBS-pufrovanom formalíne. Rezy zaliate do parafínu (hrubé 3-um) boli zafarbené Massonovým trichrómom na vyhodnotenie morfológie obličiek. Abnormality v obličkách boli odstupňované na základe prítomnosti a závažnosti abnormalít komponentov, vrátane glomerulosklerózy, mezangiálnej expanzie, tubulárnej atrofie alebo odliatku a fibrózy. Podiel sklerotických glomerulov bol hodnotený slepým vyšetrením najmenej 50 glomerulov na rez obličky.

Imunofluorescenčné farbenie rezov obličiek a primárnych podocytov

Fixované primárne podocyty boli blokované v TBS-T 3 percentnom hovädzom sérovom albumíne a inkubované cez noc pri 4 stupňoch s primárnymi protilátkami morčaťa anti-SQSTM1/P62 (1:1000, PROGEN, GP-62C) a králičieho anti-zeleného fluorescenčný proteín (GFP; 1:500, Abcam, ab290). Po prepláchnutí TBS-T sekundárne protilátky konjugované s fluorofórom oslia anti-morčacia IgG AF594-konjugovaná protilátka (Jackson ImmunoResearch,706-585-148) a oslia anti-králičia IgG AF488-konjugovaná protilátka( Invitrogen, A21206). Obrázky boli urobené pomocou fluorescenčného mikroskopu Zeiss 2, kamery AxioCam HRc a softvéru Axiovision 4.3.

V prípade obličiek fixovaných v parafíne (FFPE) fixovaných vo formalíne boli rezy (3 um) zbavené parafínu a hydratované a získanie antigénu bolo uskutočnené vo vyhrievanom citrátovom pufri (pH 6). Rezy sa potom permeabilizovali Tritonom 0,1 percenta (Euromedex) a blokovali v TBS-T3 percentnom hovädzom sérovom albumíne pred inkubáciou protilátky cez noc pri 4 stupňoch. Použili sme kozí anti-nefrín (1:100, PROGEN, GP-N2), morča anti-SQSTM1/P62 (1:1000,PROGEN, GP-62C), králičie anti-GFP (1:1000, Abcam, ab290), kozia anti-Podokalyxín (PODXL; 1:1000, Bio-Techne, AF-1556) a králičia anti-Wilm's Tumor 1 (WT1;1:100, Abcam, ab192) protilátka. Sekundárnymi protilátkami boli Alexa 488- a Alexa 568-konjugované protilátky od Invitrogen. Jadrá boli zafarbené modrou pomocou Hoechst. Sklíčka boli pripevnené pomocou fluorescenčného upevňovacieho média (Dako, S3023). Mikrofotografie boli urobené pomocou fotomikroskopu Zeiss Axiophot a softvéru Axiovision. Poloautomatické kvantifikácie na Fidži sa použili na kvantifikáciu nefrín-pozitívnych a PODXL plus plôch na glomerulárnu sekciu na najmenej 30 glomeruloch na myš. Počet podocytov sa spočítal ako počet WT1 plus jadier na glomerulárnu sekciu na najmenej 30 glomeruloch na myš.

Postup transmisnej elektrónovej mikroskopie

Malé kúsky obličkovej kôry (1 mm) sa fixovali v 3 percentnom glutaraldehyde EM triedy (Electron Microscopy Sciences) počas 1 až 3 0 dní a trikrát sa premyli v PBS. Vzorky boli dodatočne fixované v 1% oxide osmičelom 0,1 M (Electron Microscopy Science) v 0,1 M PBS (pH 7,4) a premyté vodou. Vzorky boli dehydratované v alkohole a 100 percentnom propylénoxide (Electron Microscopy Science). Živicová infiltrácia sa uskutočňovala nasledovne: miešajte Epikote 812 a propylénoxid v pomere 1:1 počas 30 minút a následne zmiešajte Epikote 812 a propylénoxid v pomere 1:2 pri teplote miestnosti cez noc. Vzorky boli vložené do 4 mm želatínových kapsúl v 100 percentnom Epikote 812 a polymerizované v peci vyhriatej na 60 °C. Ultratenké rezy boli narezané ultramikrotómom UFC7 (Leica Microsystems GmbH) a uložené na Gilder Grids 200 mesh (Electron Microscopy Science). Boli kontrastne zafarbené 7-percentným uranylacetátom (distribúcia LFG) a Reynoldovým citrátom olovnatým (LFG). Vzorky sa skúmali v transmisnom elektrónovom mikroskope JEM1011 (JEOL) s CCD kamerou Orius SC1000 (Gatan), prevádzkovanou na získanie softvéru Digi-talMicrograph (Gatan).

Pole kvantitatívnej polymerázovej reťazovej reakcie

Čerstvo izolované glomeruly boli zmrazené v reagencii QIAzol Lysis (Qiagen) na -80 stupeň. Celková extrakcia RNA s použitím metódy na báze fenolu bola spracovaná podľa odporúčaní výrobcu. cDNA boli syntetizované pomocou súpravy RT²First Strand Kit (Qiagen, 330401) a polymerázová reťazová reakcia (PCR) v reálnom čase bola vykonaná pomocou Custom RT²Profiler PCR Array（ Qiagen, CLAM36771C) s RT'SYBR Green qPCR Mastermix (Qiagen, 330502). Kvantitatívne PCR platne bežali na cykléri Applied Bio-systems StepOnePlus. Každé pole obsahuje kontrolu kvality pre účinnosť reverznej transkripcie a kontamináciu genómovej DNA. Kvantitatívna PCR analýza bola vykonaná pomocou 2-△△CT metódy s pomocou GeneGlobe Data Analysis Center (www. Qiagen. com/shop/genes-and-pathways/data-analysis-center-overview-page) a vyjadrené ako log2-násobná zmena v génovej expresii.

In silico proteomická analýza

In silico predikcia miesta štiepenia calpainu bola vykonaná pomocou DeepCalpain (http://deepcalpain.cancerbio.info/help.php), GPS-CCD (http://ccd.biocuckoo.org) a CaMPDB (http:// calpain.org/)online nástroje. Aminokyselinová sekvencia myšacieho proteínu bola získaná od Uniprot (https://www.uniprot.org). Výsledky sú zhrnuté v doplnkových tabuľkách S1 a S2.

Štatistické analýzy

Všetky grafy predstavujú jednotlivé hodnoty a priemer ± SEM. Štatistické analýzy sa uskutočňovali pomocou softvéru GraphPad Prism, verzia 9. Porovnanie medzi 2 skupinami sa uskutočňovalo pomocou parametrického Studentovho t-testu, keď vzorky prešli Anderson-Darlingovým a D'Agostino testom normality a F testom na rovnosť rozptylu. Inak bol použitý neparametrický Mann-Whitney test. Porovnanie medzi viacerými skupinami sa uskutočnilo pomocou 1-smernej alebo 2-smernej analýzy rozptylu, po ktorej nasledoval viacnásobný porovnávací test so Sidakovou korekciou. Hodnoty P<0.05 were="" considered="" significant.=""><><><>

Obrázok 1| Hypertenzia indukovaná angiotenzínom I (Angel) plus diétou s vysokým obsahom soli (HSD) inhibuje glomerulárnu autofágiu. (ac)

Imunofluorescencia Podokalyxínu (PODXL; červená) a P62 (zelená) v glomeruloch (a, a') z myší divokého typu (WT), (b, B) z myší WT po 6 týždňoch liečby Angel plus HSD a (c) z myší Nphs2.cre Atgsl/ox, ktoré ukazujú akumuláciu P62 v podocytoch počas hypertenzie a u podocytovo špecifických myší s deficitom ATG5-. Šípky označujú P62 plus bodky vo WT v (a'). Jadrá sa kontrastne zafarbili s Hoechst (modrá). Časti obrázku s prvočíslom označujú väčšie zväčšenie. Pruhy =50 μm. （d）Súvisiaca kvantifikácia P62 plus je vyjadrená ako percento glomerulárnej oblasti.n =4 myší WT a n{11}} WT s myšami Angel plus HSD a Nphs2.cre Atgsoxlo. Hodnoty sú prezentované ako jednotlivé grafy a priemer ± SEM. Mann-Whitney test:*P= 0.0159.

Hypertenzia vyvolaná Angel plus diétou s vysokým obsahom soli inhibovala autofágiu podocytov

Podocyty predstavujú vysokú úroveň autofágie in vivo, ako ukazuje silná expresia GFP u transgénnych myší s fúziou GFP s LC3 (myši GFP-LC3), kľúčovým markerom autofágie (doplnkový obrázok S2A). Autofágia je dynamický proces s neustálou tvorbou autofagozómov a degradáciou autofagolyzozómov. Blokovanie autofagozomálnej degradácie chlorochínom viedlo k akumulácii GFP plus bodiek, čo naznačuje vysoký autofagický tok v podocytoch (doplnkové obrázky S2A a B). Potvrdenie, že GFP plus bodky boli autofagozómy, sa ukázalo dvojitou imunofluorescenciou pre GFP a SQSTM1 / P62, chaperónový proteín degradovaný autofágiou (doplnkový obrázok S2C a D). Opäť liečba chlorochínom indukovala akumuláciu GFP plus P62 plus bodky, čo demonštrovalo dôležitý autofagický tok v podocytoch. Nakoniec sa in vitro zachoval vysoký autofagický tok, ako ukazuje expresia GFP a P62 v primárnych podocytoch izolovaných z myší GFP-LC3 a silná akumulácia bodov GFP plus a P62 plus pri liečbe bafilomycínom Al, ďalším blokátorom autofagozomálnej degradácie (doplnkový obrázok S2E- H).

Schopnosť hypertenzie modulovať autofagické reakcie podocytov sa potom hodnotila u myší s infúziou AngII s diétou s vysokým obsahom soli (HSD) počas 6 týždňov a u nehypertenzných kontrol. Ako je znázornené na obrázku 1, AngLI plus HSD indukovali akumuláciu P62 v glomeruloch so silnou akumuláciou v podocytoch, čo naznačuje, že Angl plus HSD bol zodpovedný za blokádu autofágie podocytov (obrázok land). Je zaujímavé, že akumulácia P62 v podocytoch bola podobná tej, ktorá sa pozorovala u myší s nedostatkom autofágie podocytov (myši Nphs2.cre Atg5'olox). V inom modeli hypertenzie, modeli DOCA-soľ, sme tiež pozorovali progresívnu akumuláciu P62 v podocytoch pozdĺž časový priebeh ochorenia (doplnkový obrázok S3).

Delécia Atg5 špecificky v podocytoch vedie k zvýšenej albuminúrii, strate podocytov a glomerulárnemu poškodeniu v modeli Angel plus HSD

Potom sme skúmali, či autofágová blokáda iba u podocytov (myši Nphs2.cre Atg5laxlox) ovplyvňuje glomerulárne poškodenie v modeli AngLI plus HSD. Najprv sme potvrdili, že Nphs2. Myši cre Atg5 mali normálny krvný tlak, normálnu funkciu obličiek a žiadne glomerulárne histologické lézie až do veku 10 mesiacov, ako už bolo hlásené (doplnkový lox (WT) a Nphs2.cre Atgslox obrázok S4).2 Potom sa myšiam Atg5'cl podala infúzia AngII s HSD počas 6 týždňov. Dôležité je, že systolický krvný tlak bol podobný v 2 skupinách po infúzii AngLI v priebehu štúdie (obrázok 2a), hoci metóda manžety na chvoste použitá na meranie krvného tlaku nemusí mať schopnosť vyriešiť malé rozdiely v krvnom tlaku. Infúzia Angl s HSD výrazne zvýšila pomer albumínu ku kreatinínu v moči u myší WT a tento účinok sa ďalej významne zvýšil u myší (obrázok 2b). Hypertenzívne myši Nphs2.cre Atg5lox/lox Nphs2.cre Atgsoxlox myši tiež vykazovali významne zvýšenú glomerulárnu sklerózu v porovnaní s WT súrodencami (obrázok 2c-e). V súlade s nameranou proteinúriou boli proteínové odliatky a tubulárna dilatácia významne častejšie u myší s nedostatkom podocytov v ATG5 (obrázok 2f-h).

Počet podocytov na glomerulus sa významne znížil u Nphs2.cre Atg5loxlox (obrázok 2i-k). Poškodenie podocytov u myší Nphs2.cre Atgsoxlo s infúziou AngII plus HSD dokonca progredovalo do fokálnej a segmentálnej glomerulosklerózy, ako ukazuje expresia parietálnych epitelových buniek (PEC ) aktivačný marker CD44 v glomeruloch (obrázok 21 a m). Analýza elektrónovou mikroskopiou identifikovala významné zmeny spojené s deficitom ATG5 po chronickej infúzii AngII s HSD, vrátane vymazania chodidla u...myší. Naopak, málo ultrahypertenzných Nphs2. Štrukturálne defekty cre Atg5'oxlx sa našli v podocytoch z myší WT aj po 10 týždňoch infúzie AngII s HSD (obrázok 2n a o), čo naznačuje, že autofagická aktivita podocytov je potrebná na ich odolnosť voči poškodeniu vyvolanému Angel plus HSD. Celkovo naše výsledky ukázali, že v modeli AnglIl plus HSD autofágová inhibícia zhoršuje poškodenie a stratu podocytov a indukuje následnú fokálnu a segmentálnu glomerulosklerózu.

Obrázok 2| Delécia Atg5 špecificky v podocytoch vedie k významnému zvýšeniu albuminúrie, poškodenia obličiek a straty podocytov po 6 týždňoch infúzie angiotenzínu II (Angel) plus diéty s vysokým obsahom soli (HSD). (a) Systolický krvný tlak u myší Atgslo/ba Nphs2.cre Ataslo počas 36 dní u myší Angel plus HSD.n =9 na genotyp. Hodnoty sú uvedené ako priemer ± SEM. Dvojcestná analýza rozptylu (ANOVA): ns. V (bm) n =10 myší na genotyp. V(b,g,h,k) sú hodnoty prezentované ako jednotlivé grafy a priemer ± SEM.(b) Angel plus HSD (pokračovanie

Obrázok 3| Expresia a aktivita calpainu v podocytoch.(a) Western blot analýza expresie calpainu-1.calpain-2 a calpainu-4 v primárnych podocytoch. Expresia tubulínu slúži ako normalizácia. (b) Aktivita kalpaínu sa merala na primárnych podocytoch ošetrených alebo neošetrených angiotenzínom II (Angel; 100 nM) počas 24 hodín s alebo bez kalpeptínu (10 uM), n =5 nezávislých experimentov. Hodnoty sú prezentované ako jednotlivé grafy a priemer ± SEM. Jednosmerná analýza rozptylu (ANOVA): liečba, P=0.0035.Sidakov viacnásobný porovnávací test:*P=0.0128 pre Angll verzus základná hodnota,“ P=0.0056 pre Angll plus kalpeptín verzus Angll.(c) Aktivita calpainu bola meraná na primárnych podocytoch od myší divokého typu (WT) alebo calpastatínových transgénnych (CST') myší liečených alebo neliečených Angelom (100 nM) počas 24 hodín. n {{18} } nezávislé experimenty. Hodnoty sú prezentované ako jednotlivé grafy a priemer ± SEM. Dvojcestná ANOVA spárovaná pre genotyp liečby. P= 0.0483. Sidakov viacnásobný porovnávací test:**P=0.0009 pre WT Angll verzus východisková hodnota,*P=0,0420 pre CST'9 Angll verzus východisková hodnota, *P=0,0424 pre WT verzus CST9 Angll.

Pls kliknite sem pre časť 2