Časť 1 Chronické ochorenie obličiek a starnutie rozdielne znižujú kostný materiál a mikroarchitektúru u myší C57Bl/6

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Chronické ochorenie obličiek a starnutie rozdielne znižujú kostný materiál a mikroarchitektúru u myší C57Bl/6

Chelsea M. Heveran1, Charles Schurman2,*, Claire Acevedo3, Eric W. Livingston4, Danielle Howe5, Eric G. Schaible6, Heather Hunt7, Adam Rauff8, Eve Donnelly7,#, R. Dana Carpenter9, Moshe Levi10, Anthony Lau5, Ted Bateman4 , Tamara Alliston2,*, Karen B. King11, Virginia L. Ferguson1

1Katedra strojného inžinierstva, University of Colorado, Boulder, CO

2Katedra ortopedickej chirurgie, Kalifornská univerzita, San Francisco, CA

3Katedra strojného inžinierstva, University of Utah, Salt Lake City, UT

4Katedra biomedicínskeho inžinierstva, Univerzita v Severnej Karolíne, Chapel Hill, NC

5Katedra biomedicínskeho inžinierstva, The College of New Jersey, Ewing, NJ

6Pokročilý svetelný zdroj, Lawrence Berkeley National Laboratory, Berkeley, CA

7Katedra materiálovej vedy a inžinierstva, Cornell University, Ithaca, NY

8Katedra bioinžinierstva, University of Colorado, Denver, CO

9Katedra strojného inžinierstva, University of Colorado, Denver, CO

10Katedra biochémie a molekulárnej a bunkovej biológie, Georgetown University, Washington DC

11Katedra ortopédie, Lekárska fakulta University of Colorado, Aurora, CO *University of California Berkeley – University of California San Francisco Postgraduate Program in Bioengineering, San Francisco, CA

# Výskumná divízia, Nemocnica pre špeciálnu chirurgiu, New York, NY

Cistanche môže pomôcť pri ochorení obličiek

Abstraktné

Chronické ochorenie obličiek (CKD) je bežnou chorobou starnutia a zvyšuje riziko zlomenín už v pokročilom veku. Starnutie a CKD rôzne zhoršujú kostný obrat a mineralizáciu. Preto predpokladáme, že strata kvality kostí by bola najväčšia pri kombinácii pokročilého veku a CKD. Hodnotili sme kosť mladých dospelých (6 mesiacov), stredného veku (18 mesiacov) a starých (24 mesiacov) samcov myší C57Bl/6 tri mesiace po 5/6 nefrektómii na vyvolanie CKD alebo simulovaných procedúrach. CKD zhoršilo straty kortikálnej a trabekulárnej mikroarchitektúry spojené so starnutím. Starnutie a CKD mali za následok tenšie, poréznejšie kortexy a menej a tenšie trabekuly. Kvalita kostného materiálu bola tiež znížená pri CKD a tieto zmeny kostného materiálu boli odlišné od zmien v dôsledku veku. Starnutie znížilo pevnosť v ohybe a modul celej kosti, nanoindentačný modul v mikrometrovom meradle a napätie tkaniva a kolagénu v nanometrovom meradle (rozptyl röntgenového žiarenia v malom uhle (SAXS)). Na rozdiel od toho CKD znížila prácu na zlomenine a variácie v module a zložení kostného tkaniva (Ramanova spektroskopia) a zvýšila percento namáhania kolagénu. Zvýšená záťaž kolagénovým kmeňom bola spojená so stratou húževnatosti pri CKD. Okrem toho sa lakuny osteocytov zmenšovali, riedili a s vekom boli pre Sham myši viac neusporiadané, no tieto zmeny súvisiace s vekom neboli pri CKD jasne pozorované. V prípade CKD však väčšie medzery pozitívne korelovali so zvýšenými hladinami fosfátov v sére, čo naznačuje, že osteocyty hrajú úlohu v systémovej minerálnej homeostáze. Táto práca ukazuje, že CKD znižuje kvalitu kostí, vrátane mikroarchitektúry a vlastností kostného materiálu, a že strata kvality kostí s vekom je spojená s CKD. Tieto zistenia môžu pomôcť zosúladiť, prečo kostná hmota konzistentne nepredpovedá zlomeninu v populácii CKD, ako aj to, prečo sú starší jedinci s CKD vystavení vysokému riziku krehkosti.

Kľúčové slová: CKD; starnutie; kvalita kostí; krehkosť kostí; kolagén

1. Úvod

Chronické ochorenie obličiek (CKD) postihuje odhadom 23–36 percent staršej populácie a je spojené so zvýšeným rizikom zlomenín a úmrtnosťou spojenou so zlomeninami (1,2). Hoci strata kostnej hmoty (meraná pomocou röntgenovej absorpciometrie s dvojitou energiou) predpovedá budúcu zlomeninu vo všetkých štádiách CKD, starší jedinci s nízkou kostnou hmotou a CKD majú väčšiu pravdepodobnosť zlomeniny v porovnaní s tými, ktorí majú nízku kostnú hmotu a zdravé obličky. funkcia (3). Riziko zlomeniny kostí je pri CKD vo všeobecnosti zvýšené v porovnaní s účinkami samotného starnutia (4,5). Napríklad v trojročnej štúdii mali jedinci vo veku 40 – 65 rokov so stredne ťažkým až konečným štádiom CKD 1,7 – 5,1-násobné zvýšenie prevalencie zlomenín v porovnaní s kontrolami zodpovedajúceho veku, zatiaľ čo u osôb vo veku 65 a viac rokov CKD naďalej zvyšoval výskyt zlomeniny 1,8 – 4,3 násobok kontroly (4).

mikroarchitektúra trabekulárnej kosti (10, 13), zatiaľ čo iní neuvádzajú žiadne zmeny v porovnaní s kontrolou (9). Hoci sa tieto štúdie líšia v druhoch a kmeňoch hlodavcov, spôsobe indukcie CKD a meraných výsledkoch, tieto predchádzajúce práce poskytujú podstatný dôkaz, že CKD mení kvalitu kostí.

Zostáva niekoľko kľúčových otázok o tom, ako CKD znižuje kvalitu kostí, do akej miery je znížená kvalita kostí spôsobená defektmi v minerálnej verzus organickej fáze, ako aj ako zmeny kvality kostí ovplyvňujú stratu pevnosti kostného tkaniva. Je pozoruhodné, že hoci niekoľko štúdií identifikovalo zmeny kolagénových priečnych väzieb a zrelosti tkaniva (tj čas od vzniku kosti) pri CKD, nie je známe, či interakcie kolagénových vlákien nanometrov počas mechanického zaťaženia sú zmenené CKD a či tieto zmeny v nanomechaniky ovplyvňujú celok. -pevnosť kostí (11, 12). Všeobecnejšie, hodnotenie zmien kvality a mechaniky kostí v reakcii na CKD od nano- až po celú dĺžku kostí ešte nebolo hlásené.

Úloha osteocytu pri ovplyvňovaní kvality kostí pri CKD a starnutí je tiež neistá. Tieto bunky sa správajú abnormálne podstatným zvýšením expresie FGF23 na začiatku progresie CKD (7, 14). Osteocyt je nevyhnutný na udržanie kvality kostného materiálu a na reguláciu odolnosti voči zlomeninám kostí (15–17). Zdravie osteocytov je čiastočne indikované lakunárnou morfológiou. Lakunárne morfológie osteocytov sú zmenené, keď sa osteocyt zúčastňuje minerálnej homeostázy, ako je laktácia (18, 19) a hypofosfatémia viazaná na x x (20). Lacunárne geometrie sa tiež môžu stať menšími, redšími a neusporiadanejšími starnutím aj nepoužívaním (21–23). Zmeny lakunárnej morfológie osteocytov s CKD majú potenciál ovplyvniť kmene kostného tkaniva, štrukturálnu integritu a mechanosenzitivitu osteocytov (24). Zatiaľ nie je známe, či CKD ovplyvňuje lakunárne morfológie osteocytov a či sa takýto vzťah môže meniť so starnutím.

Hoci bežnejšie populácie CKD zahŕňajú starších dospelých, kombinované účinky starnutia a CKD na kvalitu kostí ešte treba preskúmať. Predchádzajúca práca zistila, že starnutie znižuje modul celej kosti, pevnosť a prácu na zlom v ohybe (25), lomovú húževnatosť (26), mikroarchitektúru kortikálnej a trabekulárnej kosti (27–29) a zvyšuje obsah minerálov a zrelosť (30, 31). Tieto zmeny na kosti so starnutím sú mätúce a vyskytujú sa vo viacerých dĺžkových mierkach, pričom mechanika celej kosti je ovplyvnená zmenami materiálu kostného tkaniva, ako aj štruktúry. Zmeny kostného materiálu a objemu kostí súvisiace s vekom sú čiastočne ovplyvnené zníženým obratom kostného tkaniva (tj vyššou zrelosťou tkaniva) a negatívnou rovnováhou v kostnej mnohobunkovej jednotke (30,32). Takéto zmeny súvisiace s vekom kontrastujú s abnormálnym kostným obratom a mineralizáciou, ktoré sa často vyskytujú pri CKD. Strata mikroarchitektúry súvisí s negatívnou rovnováhou, ktorá sa očakáva so starnutím a môže sa vyskytnúť pri CKD (9, 10, 13). Avšak zrelosť tkaniva sa zvyšuje so starnutím a znižuje sa v kontexte CKD s vysokým obratom. Existujú značné medzery v chápaní základov krehkosti kostí pri CKD, ako aj toho, ako starnutie a CKD v kombinácii znižujú kvalitu kostí a odolnosť voči zlomeninám. Objasnenie kombinovaných účinkov starnutia a CKD na kvalitu kostí by zaplnilo tieto medzery vo vedomostiach.

Účelom tejto štúdie bolo preskúmať kombinované vplyvy starnutia a CKD na kvalitu kostí, od nano-až po celú dĺžku kostí, v chirurgickom modeli CKD u starnúcich myší. Predpokladali sme, že CKD a starnutie znižujú kvalitu kostí, ale že tieto dva faktory by rozdielne a negatívne ovplyvňovali vlastnosti materiálu kostného tkaniva. Ďalej sme predpokladali, že kombinované účinky staroby a CKD najviac poškodzujú kvalitu kostí. Na vyhodnotenie týchto hypotéz sme hodnotili kvalitu kostí, vrátane kortikálnej a trabekulárnej mikroarchitektúry a vlastností kortikálneho kostného materiálu, u mladých dospelých u starých myší s CKD vyvolaným 5/6 nefrektómiou (5/6 Nx) alebo falošnými operáciami.

O cistanche

2. Metódy

2.1 Zvierací model a príprava vzorky

Samce myší C57Bl/6 boli získané z kolónie National Institute on Aging vo veku 3, 15 a 21 mesiacov. Myši boli chované v cykle 12-h svetlo/12-h tma, umiestnené jednotlivo v polykarbonátových klietkach so štandardnou podstielkou, kŕmené krmivom Harlan Teklad 2920X a bol im umožnený voľný prístup k vode. Pre každý z troch vekov boli myši náhodne zaradené do CKD alebo Sham skupín. Skupina CKD podstúpila dvojstupňovú nefrektómiu. Tieto postupy boli opísané skôr (33). Stručne povedané, ľavá oblička bola získaná cez stredovú incíziu, dekapsulovaná, aby sa zabránilo poškodeniu močovodu a nadobličiek, a potom odstránená. O týždeň neskôr bola pravá oblička dekapsulovaná a horný a dolný pól boli čiastočne resekované, aby sa dosiahlo 2/3 zmenšenia objemu obličiek. Kontrolná skupina podstúpila simulačné procedúry (tj strednú incíziu bez poškodenia obličiek) v rovnakom časovom rámci. Myši boli počas procedúr anestetizované s použitím 1,5 percentného izofluránu. Po týchto procedúrach a pred zotavením sa podávala pooperačná dávka buprenorfínu (0,5 mg/kg), ako aj každých 12 hodín počas nasledujúcich dvoch dní. Myši boli usmrtené po troch mesiacoch prostredníctvom CO2 a cervikálnej dislokácie. Na konci štúdie bolo myší 6 (mladý dospelý; simulácia: n=6, CKD: n=7), 18 (stredný vek; simulácia: n=8; CKD: n { {25}}) a 24 (starý; falošný: n=8; CKD: n=8) mesiacov veku. Všetky postupy na zvieratách boli schválené Inštitucionálnym výborom pre používanie a starostlivosť o zvieratá na University of Colorado Denver.

Ľavá stehenná kosť, holenná kosť, ramenná kosť, radius a lakťová kosť boli vyhradené na analýzy kvality kosti. Ľavá holenná kosť bola konzervovaná v 70 percentnom etanole pri 4 °C. Všetky ostatné kosti boli zabalené do fosfátom navlhčenej gázy a uskladnené pri -20 °C až do analýzy.

2.2 Chemické vlastnosti séra a moču

Biochemické analýzy séra sa uskutočňovali na krvi a moči odobratých na konci štúdie. Močovina v sére a moči, ako aj koncentrácie fosfátu, vápnika a PTH v sére sa merali podľa pokynov výrobcu (BioAssays Systems a Immunotropics, v tomto poradí).

2,3 mikroCT

Mikroarchitektúra bola hodnotená pre kortikálnu kosť stredného drieku femuru a trabekulárnu kosť proximálnej holennej kosti pomocou microCT pre všetky študijné myši (μCT, Scanco 80, Scanco AG, Basserdorf, Švajčiarsko). Stehenné kosti sa pred skenovaním rozmrazili cez noc pri 4 °C. Skenovanie sa uskutočňovalo s veľkosťou voxelu 10 um, podľa metód získavania a analýzy opísaných vyššie (10). Kortikálne parametre zahŕňali objem kosti/celkový objem (BV/TV), plochu kosti/celkovú plochu (BA/TA), kortikálnu pórovitosť (Ct. Po), hrúbku kôry (Ct. Th), celkovú minerálnu hustotu (TMD), moment zotrvačnosti okolo mediálno-laterálnej osi (IML), vzdialenosť medzi ťažiskom a povrchom kosti v predozadnom smere (C) a polárny moment zotrvačnosti (pMOI) (34). Trabekulárne parametre zahŕňali trabekulárne číslo (Tb.N), trabekulárny rozstup (Tb.Sp), hrúbku trabekuly (Tb.Th), objem kosti (BV), celkový objem (TV), objem kosti / celkový objem (BV/TV), objemová minerálna hustota kostí (vBMD) a hustota konektivity (Conn.D). Po mikroCT boli stehenné kosti opäť zabalené do fosfátom navlhčenej gázy a skladované pri teplote -20 ° C na následnú mechanickú charakterizáciu celej kosti.

2.4 Celokostné mechanické a materiálové vlastnosti

Po microCT sa ľavé stehenné kosti podrobili trojbodovému ohybu (Insight II Material Testing System, silomer 250 N, MTS Systems Corporation, Eden Prairie MN). Stehenné kosti boli odstránené z fosfátom tlmenej gázy navlhčenej soľným roztokom a testované na zlyhanie s použitím rýchlosti vychýlenia 5 mm/min na zákazkovej nákove s rozpätím 8 mm. Krivky zaťaženia a posunutia boli analyzované z hľadiska mechanických vlastností vrátane tuhosti, maximálneho zaťaženia, posunutia pri maximálnom zaťažení, energie pri maximálnom zaťažení, zaťaženia pri pretrhnutí, posunutia pri prieťažnosti, energie pri prieťažnosti, posunutia po priehybe, zaťaženia pri zlome, posunu pri zlome, a energie pri zlome. Medza klzu bola definovaná ako priesečník sečnej čiary nakreslenej s 10-percentným znížením sklonu od počiatočnej tangenciálnej tuhosti a krivky zaťaženia-posunu. Použitím IML a C z µCT sme odhadli vlastnosti materiálu vrátane modulu ohybu, napätia na medzi klzu, maximálneho napätia a húževnatosti z údajov o trojbodovom ohybe pomocou štandardných rovníc ohybu lúča aplikovaných na stehennú kosť myši (35).

2.5 Analýza tuhosti proximálnej tibie pomocou konečných prvkov

Na skúmanie mechanického správania kosti sa použilo výpočtové modelovanie konečných prvkov (FE) na simuláciu axiálnej kompresie proximálnej holennej kosti v každom modeli. Proximálna holenná kosť bola vybraná, pretože holenná kosť je nosnou štruktúrou u myší a je bežným miestom analýzy vlastností kostí pomocou microCT. MicroCT obrazové údaje proximálnej holennej kosti (kortikálna a trabekulárna kosť) boli exportované ako 16-bitové rezy obrazu DICOM na ďalšiu segmentáciu a konštrukciu modelov konečných prvkov špecifických pre daný subjekt. Obrazové údaje DICOM boli importované do Mimics Innovation Suite 18 (Materialise, Leuven Belgicko) na spracovanie obrazu a segmentáciu, aby sa vytvoril zodpovedajúci model FE pre rovnakú proximálnu oblasť holennej kosti analyzovanej pomocou microCT. Kostné tkanivo bolo oddelené od ostatných tkanív na obrázku pomocou segmentačného prahu 313 mg/cm3 (36,37). Akonáhle bola oblasť kosti segmentovaná, exportovala sa sieťka FE špecifická pre subjekt, ktorá obsahovala kortikálne aj trabekulárne kompartmenty. Model FE používal hexaedrickú sieť FE s veľkosťou izotropného prvku 10 um.

MKP siete exportované z Mimics boli importované do ABAQUS CAE 6.9 na priradenie vlastností materiálu, aplikáciu okrajových podmienok a simuláciu axiálneho mechanického zaťaženia. Materiálové vlastnosti kosti boli špecifikované ako homogénne, izotropné a lineárne elastické (Youngov modul, E= 10 GPa a Poissonov pomer, v= 0.3). Na simuláciu axiálnej kompresie sa na uzly na spodnom povrchu kosti aplikovala pevná hraničná podmienka a na uzly sa aplikoval posun o 5 μm smerom nadol (0,5 percenta výšky segmentu kosti). horný povrch kosti. Štrukturálna tuhosť kosti sa vypočítala ako reakčná sila (N) počas aplikovaného posunu.

2.6 Rozptyl röntgenového žiarenia v malom uhle

Deformácia kolagénových fibríl počas testovania jednoosového napätia kombinovanej lakťovej kosti a polomeru bola meraná pomocou synchrotrónového malouhlého röntgenového rozptylu (SAXS) na lúči 7.3.3 na Advanced Light Source (LBNL, Berkeley, CA) (38). Kosti boli zaistené lepidlom a brúsnym papierom medzi svorkami na ich distálnom a proximálnom konci. In situačné testy sa uskutočnili s TST350 ťahom na testovanie (Linkam Scientific Inc.) na hydratovaných vzorkách pri rýchlosti posunu 2,5 µm/s. Počas testovania bola kostná diafýza vystavená röntgenovému žiareniu 10 keV na 0,1 s každých 5 s. Celkové žiarenie bolo obmedzené na 30 kGy, aby sa zmiernili akékoľvek účinky expozície na mechanické vlastnosti (39). Kolagénový d-rozstup, ktorý predstavuje opakujúce sa oblasti medzery v kolagénovej superštruktúre, sa javí ako výrazný Braggov difrakčný pík v SAXS vzore. Deformácia špecifická pre kolagén počas testovania v ťahu sa merala sledovaním posunu v polohách Braggovho vrcholu pri zvyšujúcom sa množstve zaťaženia. Použitím vlastného programu LabVIEW bola táto progresívna zmena v rozptylovom vzore prevedená na kmeň kolagénových vlákien normalizáciou na d-rozstup pri nulovom zaťažení, ako bolo uvedené vyššie (40). Napätie tkaniva sa vypočítalo zo síl zaznamenaných v testovacom štádiu vydelených meraniami plochy prierezu testovaných kostí. Sčítané prierezové plochy lakťovej kosti a polomeru boli merané od stredu dĺžky lakťovej kosti pomocou reflexného zobrazovania v jasnom poli (Leica DM, 20x objektív) a kvantifikované pomocou ImageJ (41). Kmene celokostného tkaniva sa získali pomocou vlastného balíka Digital Image Correlation (DIC) MATLAB, ktorý sledoval a meral vzdialenosti medzi mriežkou bodov prekrytých na vzorke kosti počas testovania. Kmene získané DIC sa skombinovali s napätím na úrovni tkaniva, aby sa vytvorili štandardné krivky napätie-deformácia. Z týchto kriviek bol extrahovaný lineárny modul pružnosti, ako aj medza klzu a medza klzu definovaná medzou klzu 0,2 percenta. Napätie tkaniva bolo časovo prispôsobené kmeňom kolagénu zo SAXS pri ťažnosti a maximálnom namáhaní, aby bolo možné porovnať komponenty prenášajúce napätie s kosťou počas deformácie.

Kontrolovaná analýza kompozitu ulna/polomer počas ťahového testu bola uskutočnená porovnávaním kmeňa na úrovni tkaniva zo snímok digitálnej kamery s kmeňmi vypočítanými z röntgenových rozptylových vzorov. Digitálne videá boli nezávisle posúdené dvoma vyškolenými pozorovateľmi na zlomeninu a skĺznutie tkaniva (napr. skĺznutie medzi ulnou a rádiusom). Tieto udalosti boli potom časovo prispôsobené krivkám deformácie a všetky údaje napätia a deformácie boli skrátené na prvú zlomeninu. Pri analýze boli brané do úvahy iba údaje do prvej zlomeniny. Vzorky boli vylúčené, ak došlo k skĺznutiu medzi ťahovými úchytkami a kosťami, alebo ak došlo k skĺznutiu medzi polomerom, ku ktorému došlo pred prvou zlomeninou. Vzorky boli tiež vylúčené, ak existovala slabá korešpondencia medzi krivkami tkaniva a kmeňa SAXS, čo naznačuje, že bod lúča bol zameraný na ulnu, ale väčšina kmeňa bola prenesená do polomeru.

2.7 Stanovenie zloženia a modulu kostného tkaniva na mikroúrovni

Po trojbodovom ohnutí boli stehenné kosti histologicky dehydratované v odstupňovanej sérii etanolu, vyčistené v acetóne a uložené v PMMA. Zapustené kosti sa narezali na strednom hriadeli stehennej kosti pomocou nízkorýchlostnej diamantovej píly (Isomet, Buehler, Lake Bluff, IL). Vzorky boli rozomleté ​​pomocou vlhkého papiera z karbidu kremíka (60{{10}} a zrnitosti 1200) a potom vyleštené pastami z oxidu hlinitého (9, 5, 3, 1, 0,1, 0,05 µm) a jemné oblečenie Rayon (South Bay Technologies, San Clemente, CA) s konečnou povrchovou úpravou 0,05 µm. Medzi každým krokom leštenia boli vzorky sonikované.

Ramanova spektroskopia sa uskutočnila na mapách pokrývajúcich hrúbku kôry pomocou vlastného systému: konfokálny mikroskopický systém Renishaw inVia (Renishaw, Wotton-under-Edge, Gloucestershire, Spojené kráľovstvo) s použitím laserového svetla s vlnovou dĺžkou 785 nm, ktoré bolo vedené cez optické káble do 5{ {4}}x objektív (NA 0,75) namontovaný na nanoindentorovom Z-stupníku (TI 950, Hysitron, Minneapolis, MN). Pre každé miesto sa zhromaždilo 10 nahromadených 10-sekundových expozícií. Riadky troch zárezov vzdialených od seba 15 µm sa rozprestierali každých 10 µm cez hrúbku kôry.

Fluorescenčná základná línia bola odčítaná pomocou polynómu 11. rádu a kozmické lúče boli odstránené pomocou softvéru Renishaw WIRE. Referenčné PMMA spektrum bolo odčítané od každého bodu pomocou vlastného MATLAB kódu. Tieto korigované spektrá sa potom analyzovali na prolín (855 cm-1), v1 fosfát (961 cm-1) a v1 uhličitan (1071 cm-1). Potom sa vypočítali pomery plôch pre minerál: matrica (fosfát: prolín),

uhličitan: fosfát a kryštalinita (obrátená k polovičnej šírke pri plnej maximálnej výške píku fosforečnanu v1).

Nanoindentácia sa potom uskutočnila na miestach zodpovedajúcich miestam vyhodnoteným Ramanovou spektroskopiou. 5 um sférický hrot vtláčal kosť rýchlosťou 30 nm/s, kým sa nedosiahla maximálna hĺbka 500 nm. Táto hĺbka sa udržiavala 120 s, aby sa umožnila disipácia viskoelastickej energie. Znížený modul (Er) bol vypočítaný pomocou Oliver-Pharrovej analýzy, pričom sa berie do úvahy prvých 45 percent krivky odľahčenia (42,43).

2.8 Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia

Z humeru sa vyrezalo všetko mäkké tkanivo a kostná dreň sa odstránila vodou. Humeri boli C a potom centrifugované, aby sa odparil nadbytok HCl. Filtrované vzorky boli zriedené v pomere 1:5 v 10 percentách acetonitrilu a 0.05 percentách kyseliny heptafluórmaslovej (HFBA), nanesených na reverznú fázu Gemini-NX C{{7} } kolóne (Phenomenex, Torrance, CA) a analyzovala sa na zosieťovanie hydroxylyzylpyridinolínu (HP), lyzylpyridinolínu (LP) a pentozidínu v súlade s metódami opísanými v Bank a kol. (44). Podrobnosti o systéme HPLC (model 126, Beckman-Coulter, Fullerton, CA) sú podrobne opísané v Oren a kol. (45). Separácia kolagénových priečnych väzieb zahŕňala nasledujúci protokol: 15 min. rozpúšťadla obsahujúceho 24 percent metanolu a 0,15 percent HFBA, 10 min. rozpúšťadla obsahujúceho 40 percent metanolu a 0,05 percent HFBA a 10 min. rozpúšťadla obsahujúceho 75 percent acetonitrilu a 0,1 percenta HFBA. Kolóna sa ekvilibrovala v 24 percentách metanolu a 0,15 percentách HFBA počas aspoň 10 minút. medzi behmi vzoriek. Píky zosieťovania kolagénu sa merali fluorescenčným detektorom (FP1520, JASCO; Easton, ML). Excitačné a emisné vlnové dĺžky boli 295 nm a 400 nm pre HP a LP. Pentosidín sa detegoval excitáciou 328 nm a emisiou 378 nm. Kalibračné krivky sa vytvorili z nameraných intenzít piatich riedení kalibrátora obsahujúceho purifikovaný HP a LP (Quidel Corporation) a pentozidín (L. Sayre, Case Western Reserve University, Cleveland, OH).

Koncentrácie zosieťovania sa potom normalizovali na koncentráciu kolagénu. Kolagén sa odhadol z koncentrácie hydroxyprolínu vo vzorke analyzovanej na zosieťovanie. Alikvotná časť vzorky analyzovanej na zosieťovanie sa zriedila 1:50 a derivatizovala sa s 9-fluoronylmetylchlórformiátom (46). Nasledujúce roztoky sa použili pre protokol aminokyselín (1) 20 mM kyselina citrónová, 5 mM tetrametylamóniumchlorid a 0,01 % azid sodný, pH 2,85; (2) 20 mM octanu sodného, ​​5 mM tetrametylamóniumchloridu a 0,01 % azidu sodného, ​​pH 4,5, a (3) 100 % acetonitrilu. Profil gradientovej elúcie je nasledujúci: od 0 do 11,5 min. gradient 75 percent (1) / 25 percent (3) až 60 percent (1) / 40 percent (3), po 13 minútach. prepnúť na 64 percent (2) / 36 percent (1), od 13,1 −18 min. gradient 64 percent (2) / 36 percent (3) až 62 percent (2) / 38 percent (3), potom po 18 min. prepnutie na 25 percent (2) / 75 percent (3) až do konca cyklu po 23 minútach. Kolóna bola ekvilibrovaná v 75 percentách (1) / 25 percentách (3) aspoň 10 minút. medzi behmi vzoriek. Aminokyselinové píky sa monitorovali pri excitácii 254 nm a emisii 630 nm. Kalibračná krivka sa vytvorila z piatich riedení štandardu aminokyselín pripraveného z hydrolyzátu kolagénu (Sigma-Aldrich #A9531, St. Louis, Missouri). Kolagén má konštantnú koncentráciu hydroxyprolínu, takže koncentrácia hydroxyprolínu bola prevedená na koncentráciu kolagénu (285 mol hydroxyprolínu na mol kolagénu).

2.9 Meranie fluorescenčných AGE

Fluorescenčné AGE v každej vzorke boli stanovené fluorometrickým testom, ktorý porovnáva objemovú endogénnu fluorescenciu kostného tkaniva s chinínovým štandardom. Alikvotná časť hydrolyzovanej kosti resuspendovaná s vnútorným štandardom pre HPLC sa zriedila DI vodou na koncentráciu 1,6 ug kosti/ml roztoku. Fluorescencia zriedeného hydrolyzátu a sériovo zriedeného zásobného roztoku chinínu (zásobný roztok: 10 ug chinínu/ml 0,1 N H2SO4) sa merala na 96-jamkovej platni (produkt č. 3370, Corning) pomocou multimódová čítačka mikrodoštičiek (Synergy H1, BioTek) pri excitácii 360 nm a emisii 460 nm.

Objemové fluorescenčné AGE sa normalizovali na obsah kolagénu v kostnom tkanive pomocou kolorimetrického testu hydroxyprolínu. V stručnosti, hydrolyzát sa ďalej zriedil na pridaný μ/ed zásobný roztok hydroxyprolínu (20}0 ug L-hydroxyprolínu/ml 0,001 N HCl). K zriedenému hydrolyzátu sa pridal chlóramín-T, aby sa iniciovala reakcia, a roztoky sa inkubovali 20 minút. pri izbovej teplote. Reakcia sa zastavila pridaním 3,15 M kyseliny chloristej a po 5- min. inkubačnej dobe pri teplote miestnosti sa pridal p-dimetylaminobenzaldehyd. Potom sa roztok inkuboval vo vodnom kúpeli s teplotou 60 stupňov počas 20 minút, potom sa ochladil v studenej vode v tme na teplotu miestnosti. Absorbancia vzoriek a štandardov sa merala pri vlnovej dĺžke 570 nm pomocou čítačky mikrodoštičiek. Fluorescenčné AGE sa uvádzajú v jednotkách ng chinínovej fluorescencie/mg kolagénu.

2.10 3D Lacunárne geometrie osteocytov

Ľavá holenná kosť bola histologicky dehydrovaná v odstupňovanej sérii etanolu a zafarbená 1% bázickým fuchsínom (47). Holenné kosti sa potom vyčistili acetónom a vložili do poly(metyl)metakrylátu (PMMA). Zapustené vzorky boli priečne narezané 1 mm proximálne od spojenia tibia-fibula pomocou nízkorýchlostnej píly (Buehler Isomet, Buehler, Lake Bluff, IL). Z distálnej časti bola pripravená brúsená rez s cieľovou hrúbkou 200 um (Exakt 400 CS, Exakt Technologies Inc, Oklahoma City, OK).

Zobrazovanie pozemných rezov sa uskutočnilo v transmisii s konfokálnym laserovým skenovacím mikroskopom Zeiss LSM 71{6}} s excitáciou 555 nm, pásmovým filtrom 568–1{8}}00 nm a objektívom s olejovou imerziou 40x. Rozlíšenie v smeroch x, y a z bolo 0,447 a 0,493 um. Vertikálne z-zásobníky boli získané prostredníctvom viditeľného rozsahu lakún osteocytov (hĺbka zobrazenia 50–100 µm). 3D obrazy lakún osteocytov boli skonštruované a analyzované na lakunárne geometrie pomocou open source programu 3D Osteocyte Lacunae Analysis a MATLAB v17 (21 ). V stručnosti, každý 2D obraz v z-sklade bol automaticky segmentovaný, aby sa definovali medzery, ktoré sa potom rekonštruovali v 3D. Na základe najlepšie vyhovujúcich elipsoidov boli medzery analyzované na objem, povrch, najbližšie ťažisko, sférickosť (pomer najmenšieho k najväčšiemu lakunárnemu polomeru, kde 1=guľa), rozpätie theta (absolútna hodnota rozdielu 3D vektor popisujúci smer hlavnej osi od priemerného smeru všetkých lakún, sploštenosť (−1=dokonale predĺžená, 1=dokonale sploštená) a hustotu lakunárneho počtu (počet osteocytov/objem obrazu).

2.11 Analýza údajov

Údaje sú prezentované ako priemer ± štandardná chyba priemeru. Pre každé pole z Ramanovej spektroskopie a nanoindentácie boli spriemerované tak, že každá kosť mala jednu hodnotu pre každé meranie v mikromeradle. Podobne sa vypočítala štandardná odchýlka pre každé pole na odhadnutie priestorovej variability kostného tkaniva v mikromeradle. Účinky starnutia a CKD, ako aj ich interakcia, boli testované pomocou dvojcestnej ANOVA pre všetky parametre. Závislé premenné sa v prípade potreby transformovali, aby sa splnili predpoklady zvyškovej normality a homoskedasticity. Význam pre hlavné efekty bol nastavený apriori na p < 0.05.="" v="" prípade="" významnej="" interakcie="" medzi="" vekom="" a="" ckd="" sa="" vykonalo="" post-hoc="" testovanie="" na="" testovanie="" účinku="" ckd="" v="" každom="" veku.="" pri="" týchto="" post-hoc="" analýzach="" bola="" pomocou="" bonferroniho="" upravenej="" verzie="" alfa="" kontrolovaná="" rodinná="" chyba,="" ktorá="" viedla="" ku="" kritickej="" hodnote="" alfa="" 0.05="" 3="0.017." výsledky,="" kde="" porovnania="" jednoduchých="" účinkov="" mali="" p-hodnoty="" medzi="" 0,017="" a="" 0,05,="" boli="" interpretované="" ako="">

Uskutočnila sa lineárna regresia, aby sa otestovalo, či merania kvality kostí v nano-mikroskopoch predpovedajú mechanickú húževnatosť celej kosti. Pretože mechanické vlastnosti celej kosti vykazujú silnú závislosť od veku, táto lineárna regresia zahŕňala vek ako kovariát. Spearmanove korelácie boli tiež hodnotené pre lakunárne geometrie osteocytov a merania z chémie séra a moču a pre PTH a merania kvality kostí na mikroúrovni. Významnosť pre lineárne regresie a korelácie bola stanovená na p < 0,05.="" pre="" všetky="" analýzy="" sa="" použil="" minitab="">

Odľahlé hodnoty boli identifikované pomocou Grubbsovho testu (úroveň významnosti=0,05). Niekoľko odľahlých hodnôt bolo vylúčených z analýz sérového vápnika a močoviny. Zo všetkých analýz kortikálnej a trabekulárnej mikroarchitektúry, ako aj analýzy FEA, bola vylúčená každá odľahlá hodnota za 24-mesiac Sham a CKD. Jedna odľahlá hodnota bola vylúčená z 24-mesačnej skupiny CKD pre analýzu LP a jedna odľahlá hodnota bola vylúčená pre 24-mesačnú skupinu Sham pre tuhosť, prácu až po zlom a posunutie po výťažku. Pre štandardnú odchýlku nanoindentačného modulu a štandardnú odchýlku kryštalinity bola zistená jedna samostatná 24-mesiaca Sham odľahlá hodnota.