Časť 1: Stanovenie súbežného experimentálneho modelu osteoporózy v kombinácii s Alzheimerovou chorobou u potkana a dvojitým účinkom echinakozidu a akteozidu z Cistanche Tubulosa
Mar 24, 2022
Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Yi Chen, Ying-Qi Li, Jia-Yi Fang, Ping Li, Fei Li
ABSTRAKT
Etnofarmakologický význam: Cistanche tubulosaje vzácna tradičná čínska medicína, ktorá sa široko používa pri liečbe osteoporózy aAlzheimerova choroba. Echinakozida akteozid sú hlavnými aktívnymi zložkami v Cistanche tubulosa, ktoré majú farmakologické aktivity s výskumnou hodnotou. Bolo hlásené, že echinakozid aakteozidmôže zlepšiť schopnosť učenia a pamäte, podporovať proliferáciu a diferenciáciu osteoblastov. Cieľ štúdie: Echinakozid a akteozid zCistanche tubulosapreukázali významné aktivity proti osteoporóze a proti Alzheimerovej chorobe, pričom tieto účinky neboli súčasne študované na modeli potkanov. Cieľom tejto štúdie bolo vytvoriť a overiť model osteoporózy v kombinácii sAlzheimerova chorobau potkanov a skúmať dvojité účinkyechinakozida akteozid na tomto súbežnom modeli.
Materiály a metódy:Súčasne boli nastavené tri modelové skupiny ovariektómie (OVX), simulovanej chirurgie s D-galaktózou a AlCl3 (D), ovariektómie s D-galaktózou a AlCl3 (OVX plus D). Potkanom v skupinách liečených liekom sa odstránili vaječníky. Pri vykonávaní intraperitoneálnej injekcie D-galaktózy a intragastrického podávania AlCl3 potkanom v skupinách liečených liekom sa potkanom podávali perorálneechinakozid(90 mg/kg/deň),akteozid(90 mg/kg/d) a pozitívne kontrolné liečivá estradiolvalerát (0,6 mg/kg/d), donepezil HCl (0,8 mg/kg/d). Po 8-týždňovej medikamentóznej liečbe sa najprv vykonal test Morris Water Maze (MWM) počas 6 dní. Potkany sa potom usmrtili na odber krvi, maternice, stehennej kosti, holennej kosti a mozgového tkaniva. Sérum bolo použité na biochemické testy. Maternice sa použili na histomorfometriu. Pravá stehenná kosť bola použitá pre mikro-CTa histomorfometria, v tomto poradí. Na biomechanický test sa použili pravé holenné kosti. Hipokampus zozbieraný na ľadovom boxe sa použil na biochemické testy. Mozog 41 odobratý perfúziou sa použil na histomorfometriu.
Výsledky:V porovnaní so skupinou Sham mohla skupina OVX plus D výrazne znížiť schopnosť učenia a pamäte spôsobením oxidačného poškodenia, poškodením neurónov v hipokampe a ovplyvnením hydrolýzy a syntézy acetylcholínu. Medzitým sa aktivity BALP a TRAP v skupine OVX plus D výrazne zvýšili (P<0.001) as="" compared="" to="" the="" sham="" group.="" in="" addition,="" compared="" with="" the="" sham="" group,="" the="" mean="" bone="" mineral="" density="" obviously="" decreased=""><0.05), the="" trabecular="" bone="" mass="" and="" microarchitecture="" were="" also="" destroyed="" significantly="" in="" the="" ovx+d="" group.="" furthermore,="" the="" maximum="" load="" and="" maximum="" stress="" significantly="" reduced=""><0.01) and="" the="" energy="" 50="" absorption="" also="" decreased="" greatly="" as="" compared="" to="" the="" sham="" group.="" after="" being="" administrated="" with="">echinakozidaakteozid, typické patologické znaky osteoporózy aAlzheimerova chorobaboli zlepšené.
Závery:Model osteoporózy v kombinácii sAlzheimerova chorobau potkanov bola uskutočniteľná a úspešne zavedená.Echinakozida akteozid tiež preukázali niektoré významné účinky na tento súbežný model a mohli by byť potenciálnymi 56 kandidátmiCistanche tubulosas dvojitým účinkom na ďalšie štúdium.
Kľúčové slová:osteoporóza; Alzheimerova choroba; dvojité účinky; echinakozid; akteozid; Cistanche tubulosa
CIstanche Stratené impérium byliny zmierňujú Alzheimerovu chorobu
1. Úvod
Osteoporóza je degeneratívne ochorenie kostí charakterizované progresívnym úbytkom kostnej hmoty a deštrukciou mikroarchitektúry, čo môže zvýšiť riziko krehkých fraktúr (Rachner et al., 2011).Alzheimerova choroba(AD) je bežné neurodegeneratívne ochorenie u starších ľudí, ktoré sa v klinickej praxi vyznačuje neustálym mentálnym úpadkom, kognitívnym poškodením a stratou schopnosti samostatného života (Reitz 76 a kol., 2011). Typickými patologickými znakmi AD sú tvorba senilných plakov indukovaná ukladaním -amyloidu, neurofibrilárne spleti spôsobené hyperfosforyláciou tau a neuronálna degenerácia v mozgu (Serrano-Pozo et al., 2011). Povrchovo sú OP a AD úplne nezávislé ochorenia s odlišnou patológiou a klinickými znakmi. Často sa však pozoruje, že OP a AD sa v klinickej praxi vyskytujú súčasne (Zhang a kol., 2001; Lui a kol., 2003; Luckhaus a kol., 2009). Prevalencia oboch ochorení stúpala s vekom, najmä u žien po menopauze (Li et al., 2017; Stern, 2012). Čoraz viac dôkazov naznačuje, že ľudia s diagnózou AD majú zvýšené riziko OP (Zhou et al., 2014).
Je potrebné študovať a objasniť vzťahy medzi osteoporózou aAlzheimerova chorobain vitro a in vivo. Pred vykonaním štúdií in vivo je dôležité vybrať použiteľné zvieracie modely osteoporózy alebo Alzheimerovej choroby. Model osteoporózy by sa mohol vytvoriť niekoľkými druhmi metód, ako je intragastrické podávanie kyseliny retinovej, operácia ovariektómie a intramuskulárna injekcia glukokortikoidov (Wei et al., 2007; Komori, 2015). Najmä model postmenopauzálnej osteoporózy vyvolanej ovariektómiou u potkanov bol klasický abol široko používaný vo väčšine štúdií (Miao a kol., 2012; Liu a kol., 2017).Sporadická Alzheimerova choroba je hlavným typom Alzheimerovej choroby. Zvieramodely SporadicAlzheimerova chorobamohli byť vyvolané rôznymi metódami ako naprinjekciou D-galaktózy príp -amyloid, intragastrické podanie AlCl3,a tak ďalej(Bagheri a kol., 2011; Gao a kol., 2015; Justin Thenmozhi a kol., 2017). Okrem toho,konjunkčný model Alzheimerovej choroby vyvolanej dlhodobou intraperitoneálnou liečbouinjekcia D-galaktózy kombinovaná s ovariektómiou sa tiež veľa študovala (Liua kol., 2010; Zhao a kol., 2012). S cieľom odhaliť význam osteoporózy aAlzheimerovej choroby, je potrebné vytvoriť kombinovaný model osteoporózys Alzheimerovou chorobou, aby študovali spoločné mechanizmy liekovosteoporóza aAlzheimerova chorobaase.
Cistanche tubulosa(Schenk) Wight je parazitická rastlina, ktorá sa vyskytuje hlavne v púštiach v severozápadnej Číne. Sušené sukulentné stonkyCistanche tubulosa(CT) sa používajú ako známy tonizujúci liek s názvom Cistanches Herba s čínskym názvom Roucongrong v Čínskom liekopise (2015). V tradičnej čínskej medicíne bol ocenený ako „ženšen púští“ a je široko používaný na liečbu bolestí pása a kolien, ženskej sterility a zápchy (Jiang a Tu, 2009). Hlavnými aktívnymi zložkami CT sú fenyletanoidové glykozidy (PhGs), echinakozid (ECH) aakteozid(ACT) sú reprezentatívne zlúčeniny v PhG (Morikawa et al., 2014). Najmä ECH a ACT sa typicky vyberajú ako markery na kontrolu kvality pri CT kvôli ich vysokému obsahu a rôznym farmakologickým aktivitám, ako sú účinky neuroprotekcie, ochrana kostí,
antioxidanty, proti starnutiu a zlepšujúce schopnosť učenia a pamäte (Wang et al.,2012; Li a kol., 2016). Avšak účinky ECH a ACT na osteoporózukombinovaný sAlzheimerova chorobaešte neboli študované spoločne na modeli potkanov.Účelom tejto štúdie teda bolo vytvoriť kombinovaný potkaní model osteoporózys Alzheimerovou chorobou a skúmať jej účinkyechinakozida akteozid na tosúbežný model, aby sa poskytli experimentálne dôkazy pre ďalšie štúdiummolekulárny mechanizmus echinakozidu alebo akteozidu v nasledujúcom výskume.
cistanche pharma špeciálpreAD
2. Materiály a metódy
2.1. Zvieratá
Osemdesiat 8-týždňových samíc potkanov Wistar (číslo certifikátu: SCXK 2018-0006) s hmotnosťou 180 až 200 g bolo získaných od čínsko-britského laboratória SIPPR/BK. Animal Ltd (Shanghai, Čína) a vyrastal v Experimentálnom centre farmaceutických zvierat na Čínskej farmaceutickej univerzite.
2.2. Chemikálie a činidlá
Chloralhydrát, penicilín G sodný, D-galaktóza, hexahydrát chloridu hlinitého, estradiolvalerát, donepezil HCl boli zakúpené od Aladdin Industrial Corporation (Shanghai, Čína).Echinakozid(HPLC 94 percent) bol získaný od Chengdu Wecistanche Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, Čína).akteozid(HPLC 98 percent) bol zakúpený od Baoji Herbest Bio-Tech Co., Ltd. (Baoji, Čína). Kosti špecifická alkalická fosfatáza (BALP), tartrát-rezistentná kyslá fosfatáza (TRAP), superoxiddismutáza (SOD), malónaldehyd (MDA), acetylcholínesteráza (AChE) a cholínacetyltransferáza (ChAT) enzýmovo viazaný imunosorbentový test (ELISA) zakúpené od Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, Čína). Univerzálny tkanivový fixátor bol získaný zChengdu Wecistanche Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, Čína).
echinakozid
2.3. Zvieracie modely a liečby
Všetky pokusy na zvieratách boli schválené a kontrolované Výborom pre etiku zvierat Čínskej farmaceutickej univerzity. Potkany sa udržiavali v 12-hodinovom cykle svetlo/tma v miestnosti s kontrolovanou teplotou (22 ± 2 stupne) a kŕmili sa štandardným peletovaným krmivom a vodou z vodovodu.
Po adaptácii jedného týždňa sa model osteoporózy dosiahol vykonaním chirurgického zákroku na ovariektómiu (French et al., 2008). Po ukončení operácie sa raz na sutúru rany postriekala sodná soľ penicilínu G, aby sa zabránilo infekcii. Potkany sa potom tri týždne normálne kŕmili. Podľa odkazu (Hua et al., 2007; Alawdi et al., 2017), modelAlzheimerova chorobaby mohla byť indukovaná dlhodobou intraperitoneálnou injekciou D-galaktózy v kombinácii s ovariektómiou alebo dlhodobým intragastrickým podávaním AlCl3. Na štúdium uskutočniteľnosti modelu osteoporózy kombinovanej s Alzheimerovou chorobou, tri modelové skupiny ovariektómie (OVX skupina), simulovanej chirurgie s intraperitoneálnou injekciou 150 mg/kg/d D-galaktózy a intragastrickým podaním 30 mg/kg/d AlCl3 (skupina D), ovariektómia s intraperitoneálnou injekciou 150 mg/kg/d D-galaktózy a intragastrické podávanie 30 mg/kg/d AlCl3 (OVX plus skupina D) boli v tejto štúdii nastavené.
Preto boli potkany náhodne rozdelené do ôsmich skupín (n{0}} pre každú skupinu) po 3 týždňoch a perorálne liečené liekmi počas 8 týždňov: Sham skupina; skupina OVX; D skupina; OVX plus D skupina; skupina liečená estradiolvalerátom (EV skupina, OVX plus D plus 0,6 mg/kg/deň estradiolvalerát); skupina liečená donepezilom HCl (skupina DPZ, OVX plus D plus 0,8 mg/kg/d donepezilu HCl);echinakozidliečebná skupina (skupina ECH, OVX plus D plus 90 mg/kg/deň echinakozid);akteozidliečebná skupina (ACT skupina, OVX plus D plus 90 mg/kg/d akteozid). Podľa princípu konverzie ekvivalentnej dávky medzi človekom a potkanom a dávky zo súvisiacej referencie (Li a kol., 2013; Gao a kol., 2014) boli v tejto štúdii prijaté dávky skupín liečených drogami.
Telesná hmotnosť každého potkana sa merala každý týždeň. Po celej liečbe liekmi trvajúcej 8 týždňov bol najskôr vykonaný test Morris Water Maze (MWM) na 6 dní. Potom bolo 6 potkanov z každej skupiny usmrtených na zber materiálov. Potkany sa anestetizovali intraperitoneálnou injekciou 3,0 ml/kg 10 percentného chloralhydrátu a krv sa odobrala z brušnej aorty. Krv sa umiestnila pri teplote miestnosti, aby sa zrazila a centrifugovala pri 3500 ot./min. počas 10 minút. Sérum sa zozbieralo do 1,5 ml centrifugačnej skúmavky (NEST Biotechnology) a skladovalo sa pri -80 stupni, kým sa nepoužilo na biochemické testy. Potom sa odobrali tkanivá maternice, stehennej kosti, holennej kosti a mozgového tkaniva. Maternice sa použili na histomorfometriu. Pravá femora sa použila na Micro-CT a histomorfometriu. Na biomechanický test sa použili pravé holenné kosti. Hipokampus zozbieraný na ľadovom boxe sa použil na biochemické testy. Potom boli ďalšie tri potkany z každej skupiny perfundované zo srdca fyziologickým roztokom a univerzálnym tkanivovým fixátorom, aby sa odobral mozog na histomorfometriu.
2.4. Test Morris Water Maze (MWM).
Potkany boli podrobené priestorovému referenčnému učeniu a testovaniu pamäte v teste MWM po 8 týždňoch intervencie. Test MWM sa uskutočnil podľa metód uvedených vyššie (Morris, 1984; Gao a kol., 2016). Stručne povedané, 5 po sebe nasledujúcich dní so štyrmi pokusmi za deň boli potkany trénované tak, aby používali rôzne vizuálne podnety umiestnené na stene bazéna, aby našli skrytú ponorenú plošinu (priemer 11 cm, výška 29 cm) v kruhovom bazéne (priemer 130 cm, výška 50 cm) naplnená netoxickou vodou sfarbenou uhlíkovým atramentom. Bazén bol pomyselne rozdelený na štyri kvadranty a na priesečníkoch kvadrantov sa nachádzali štyri štartovacie pozície. Plošina bola umiestnená v strede jedného z kvadrantov a poloha bola počas pokusov konštantná. V každom pokuse boli potkany umiestnené náhodne na vybrané miesta, otočené smerom k stene bazéna. Každý pokus sa ukončil, keď potkan dosiahol plošinu alebo po 60 sekundách, a uplynutý čas sa zaznamenal ako úniková latencia. Potkany, ktoré nedosiahli plošinu, boli navedené na plošinu. Po každom pokuse so skrytou platformou potkan zostal na platforme 10 sekúnd. Priemerná doba latencie štyroch pokusov za deň bola vypočítaná ako výsledky tréningu. V deň 6 sa všetky potkany podrobili pokusu so sondou, v ktorom plávali 60 s v bazéne bez platformy. Časy prechodu na mieste nástupišťa a čas jazdy v cieľovom kvadrante boli zaznamenané ako konečné výsledky. Potkany boli monitorované kamerou namontovanou na strope priamo nad bazénom a všetky pokusy boli zaznamenané a analyzované pomocou programu MORRIS MAZE, ktorý dodala spoločnosť Beijing zhongshidichuang science and technology development Co., Ltd. (Peking, Čína).
2.5. Biochemický test ELISA
Podľa pokynov výrobcu súprav ELISA testovala aktivita alkalickej fosfatázy špecifickej pre kosti (BALP), aktivita kyslej fosfatázy rezistentnej na vínan (TRAP), aktivita superoxiddismutázy (SOD) a obsah malondialdehydu (MDA) v sére BioTek Synergy 2 multimódová čítačka mikrodoštičiek (BioTek, USA). Tkanivá hipokampu z každej skupiny sa premyli PBS (0,01 M, pH 7,4), aby sa odstránila krv alebo nečistoty zostávajúce na povrchu tkaniva. Tkanivá hipokampu na jednej strane sa odvážili a potom sa rozrezali na čo najmenšie kúsky. Tkanivá hipokampu sa homogenizovali v pomere 1:9 (hmotnosť tkaniva: objem PBS). Homogenát sa centrifugoval pri 4 stupňoch, 3000 ot./min. počas 15 minút. Supernatant sa zozbieral a zriedil na meranie koncentrácie proteínu metódou BCA. Aktivita acetylcholínesterázy (AChE), aktivita cholínacetyltransferázy (ChAT), aktivita superoxiddismutázy (SOD) a obsah malondialdehydu (MDA) v tkanive hipokampu sa potom testovali metódami ELISA.
2.6. Histomorfometria hipokampu
Mozgové tkanivá (n =3/skupina) boli fixované v univerzálnom tkanivovom fixatíve. Vzorky mozgového tkaniva sa potom premyli, dehydratovali gradientovým etanolom, zaliali sa parafínovým voskom a nakrájali sa na koronálne rezy s hrúbkou 5 μm. Rezy boli zafarbené hematoxylínom a eozínom (HE). Potom boli koronálne rezy mozgových tkanív odfotografované inverzným fluorescenčným mikroskopom (Nikon, Japonsko). Pozorovali sa najmä morfologické zmeny CA1, CA2, CA3 a DG v hipokampe.
2.7. Histomorfometria a morfometria maternice
Vybrané maternice (n{0}}/skupina) boli fixované v univerzálnom tkanivovom fixatíve. Vzorky tkaniva maternice sa potom premyli, dehydratovali gradientovým etanolom, zaliali sa parafínovým voskom a nakrájali sa na priečne rezy s hrúbkou 5 μm. Rezy boli zafarbené hematoxylínom a eozínom (HE). Pozorovali sa a fotografovali priečne rezy maternice. Náhodne sa vybralo päť zorných polí, potom sa pomocou softvéru Image-Pro Plus 6.0 zmeral priemer priečneho rezu maternice a hrúbka epitelu sliznice maternice. Spočítali sa aj počty maternicových žliaz v lamina propria.
2.8. Micro-CT
Vybraná pravá stehenná kosť (n=3/skupina) bola naskenovaná v polohe so vzdialenosťou objektu od zdroja 121 mm a so vzdialenosťou kamery od zdroja 171 mm pomocou SkyScan 1176 micro X- lúčová počítačová tomografia (mikro-CT) skener (Bruker, Nemecko). Ako referenčný povrch sa vybrala distálna rastová platnička. So vzdialenosťou 1 mm pod referenčným povrchom sa ako sledovaný objem vybrala oblasť s hrúbkou 1,8 mm (VOI, 100 vrstiev). Výsledné obrázky v odtieňoch šedej mali veľkosť pixelov 17,76 μm z rekonštrukcie kosti (65 kV, 385 μA). Na selekciu trámcov z kortikálnej kosti sa použila poloautomatická metóda tvarovania. Metódy priameho 3D merania boli použité na hodnotenie percent objemu kosti (BV/TV), hustoty povrchu kosti (BS/TV), trabekulárnej separácie (Tb. Sp), trabekulárneho počtu (Tb. N), trabekulárnej hrúbky (Tb. Th) , index štruktúrneho modelu (SMI), faktor trabekulárneho vzoru (Tb. Pd) a priemerná kostná minerálna hustota (priemerná BMD) pre rovnakú objemovú veľkosť pomocouCTProgram analyzátora (Bruker, Nemecko). 3D vizualizácia VOI pomocou adaptívneho vykresľovacieho algoritmu sa uskutočnila pomocou softvéru CTvol (Bruker, Nemecko).
rastlinný extrakt cistanche
2.9. Histomorfometria kostí
Vybraná pravá stehenná kosť (n=3/skupina) bola fixovaná v univerzálnom tkanivovom fixatíve a potom dekalcifikovaná v roztoku 10 percent EDTA-2Na počas 3 týždňov. Dekalcifikované vzorky boli premyté, dehydratované gradientovým etanolom, zaliate parafínovým voskom a nakrájané na pozdĺžne rezy 5 μm. Rezy boli zafarbené hematoxylínom a eozínom (HE). Boli odfotografované pozdĺžne rezy stehennej kosti. Pozorovali sa štruktúry kostného tkaniva každej skupiny, najmä štruktúry trabekulárnej kosti.
2.10. Biomechanický test
Náhodne vybrané pravé holenné kosti (n{0}}/skupina) boli hodnotené pre trojbodový ohybový test pomocou univerzálneho testovacieho stroja (SHIMADZU, Japonsko). Priemery týchto vzoriek boli merané nóniovým posuvným meradlom v rozsahu 2.16-2,38 mm (d). Vzorka sa potom umiestnila na dve nosné priečky so vzdialenosťou 25 mm (L) medzi dvoma koľajnicami a fyziologické zakrivenie vzorky bolo nahor. Zaťažovacia tyč záťaže bola umiestnená v strede vzorky a klesala konštantnou rýchlosťou 1,5 mm/min, kým sa vzorka nezlomila. Údaje o sile (F) a posunutí sa automaticky zaznamenávali do počítača, ktorý bol prepojený s testovacím strojom a súčasne sa vykresľovala krivka záťaž-deformácia. Hodnoty maximálneho zaťaženia (N) a absorpcie energie (mJ) boli súčasne zaznamenávané materiálovým testovacím softvérom TRAPEZIUM X. Hodnoty maximálneho napätia (MPa) boli vypočítané podľa nasledujúceho vzorca: Napätie (σ)=ohybový moment (M) / súčiniteľ prierezu (Z)=(8×L×F) / ( π×d3)
2.11. Štatistická analýza
Výsledky modelových skupín sa porovnávali so skupinou Sham a výsledky skupín liečených liekom sa porovnávali so skupinou OVX plus D. Údaje sa analyzovali pomocou jednosmernej ANOVA, po ktorej nasledoval Bonferroniho viacnásobný porovnávací test pomocou softvéru Graph Pad Prism 5.0. Údaje boli vyjadrené ako priemer ± SD a hodnoty P menšie ako 0,05 sa považovali za štatisticky významné.
myricetínacistanche
