Časť 1|Hyperaktivita kinázy glykogénsyntázy 3b v močových exfoliovaných bunkách predpovedá progresiu diabetickej obličkovej choroby

Xianhui Liang a kol

1Centrum na čistenie krvi, Inštitút nefrológie, Prvá pridružená nemocnica univerzity Zhengzhou, Zhengzhou, Čína; 2Department of Medicine, Division of Kidney Disease and Hypertension, Rhode Island Hospital, Brown University School of Medicine, Providence, RhodeIsland, USA; a 3 Department of Medicine, Division of Nefrology, University of Toledo College of Medicine, Toledo, Ohio, USA

Pre viac informácií kontaktujte:emily.li@wecistanche.com

Cistanche tubulosa zabraňuje ochoreniu obličiek, kliknite sem a získajte vzorku

Rastúce dôkazy poukazujú na to, že glykogénsyntáza kináza (GSK)3b je kľúčovým hráčom v rôznychochorenia obličiek. Avšak, ako kľúčový prevodník inzulínovej signálnej dráhy, úloha GSK3b u diabetikaobličky chorobazostáva neistý. U DB/DB myší bola renálna expresia celkového a aktivovaného GSK3b stále zvýšená. To predchádzalo rozvoju diabetikaobličky chorobaa koreluje s progresiou príznakovdiabetikobličkyporanenia, vrátane albuminúrie a akumulácie extracelulárnej matrice v glomeruloch a tubulointersticiálnych. In vitro expozícia glomerulárnych podocytov, mezangiálnych buniek a renálnych tubulárnych buniek diabetickému prostrediu indukovala nadmernú expresiu a hyperaktivitu GSK3, čo sa zdá byť nevyhnutné a dostatočné na vyvolaniediabetikbunkové poškodenia v obličkových bunkách, pretože cytopatický účinok diabetického prostredia bol zmiernený knockdownom GSK3b, ale bol napodobňovaný ektopickou expresiou konštitutívne aktívneho GSK3b aj v normálnom prostredí. Nekonzistentnosť vzoriek biopsie obličiek získaných od pacientov s rôznymi štádiami diabetickej nefropatie odhalila zosilnenú expresiu celkového a aktivovaného GSK3b v glomerulách a obličkových tubuloch, ktorá súvisí so závažnosťou diabetickej nefropatie. Okrem toho v retrospektívnych kohortách pacientov s diabetom typu 2, ktorí boli sledovaní viac ako päť rokov, relatívna aktivita GSK3b v bankovaných močových exfoliovaných bunkách predstavovala nezávislý rizikový faktor pre rozvoj alebo progresiu poškodenia obličiek. Analýza krivky prevádzkovej charakteristiky prijímača ďalej preukázala, že aktivita GSK3b v močových exfoliovaných bunkách poskytuje oveľa lepšiu silu ako albuminúria pri rozlišovaní diabetických pacientov s progresívnym poškodením obličiek od pacientov so stabilnou funkciou obličiek. Renálna expresia a aktivita GSK3b sú teda zosilnené pri experimentálnej a klinickej diabetickej nefropatii. Preto GSK3b v močových exfoliovaných bunkách môže slúžiť ako nový biomarker na predpovedanie diabetickejobličkychorobaprogresie.

Diabetické ochorenie obličiek(DKD) je naďalej hlavnou príčinou zlyhania obličiek v konečnom štádiu v USA a iných rozvinutých krajinách.1,2 Nie u každého pacienta s diabetes mellitus sa však rozvinie diabetická nefropatia (DN), o čom svedčí množstvo dlho- termín epidemiologické následné štúdie.3 Dôvod tohto heterogénneho výsledku nie je úplne pochopený, ale zdanlivo multifaktoriálny, zahŕňajúci rôzne príčinné faktory, vrátane genetiky, prostredia, už existujúcichobličkychorobaa závažnosť diabetu.4,5 Zlá glykemická kontrola je dobre známym rizikovým faktorom albuminúrie a DN. Napriek tomu sa u významnej časti pacientov napriek prísnej glykemickej kontrole stále vyvinie DN.6 V klinickej praxi je potrebné prijať citlivý a presný biomarker na stratifikáciu diabetických pacientov s rizikom progresie do renálneho poškodenia. Albuminúria sa roky považovala za náhradný marker diabetických obličkových komplikácií.7,8 Napriek tomu narastajúce množstvo dôkazov naznačuje, že albuminúria nemusí byť presná.9,10 Bol zaznamenaný významný nesúlad medzi albuminúriou a poruchou funkcie obličiek pri DN. 11,12 Podľa údajov United Kingdom Prospective Diabetes Study13 z tých pacientov, u ktorých sa rozvinula porucha funkcie obličiek, 61 percent nemalo predtým albuminúriu a 39 percent nikdy počas štúdie albuminúria nevyvinula. Podobne z tých pacientov, u ktorých sa rozvinula albuminúria, sa len u 24 percent následne počas štúdie vyvinula porucha funkcie obličiek. Inými slovami, u pacientov s mikroalbuminúriou alebo makroalbuminúriou sa u prevažnej väčšiny nemusí vyvinúť porucha funkcie obličiek. Tieto údaje teda spochybňujú klasickú paradigmu albuminúrie, ktorá vždy predchádza poruche funkcie obličiek počas progresie DKD. Preto je nevyhnutné identifikovať nové biomarkery.

na predikciu DN alebo na včasnú diagnostiku DN. V poslednom desaťročí sa testovalo množstvo nových molekúl.14–16 Spomedzi nich sa ako atraktívny kandidát ukázala glykogénsyntáza kináza 3 (GSK3). GSK3 je vysoko konzervovaná, všadeprítomne exprimovaná serín/treonín-proteínkináza, ktorá bola pôvodne charakterizovaná ako kľúčový prevodník inzulínovej signalizačnej kaskády a riadi glykogenézu. Záujem o GSK3 sa výrazne zvýšil s vedomím, že funguje aj ako konvergenčný bod pre viaceré bunkové signálne dráhy zapojené dozápal, imunomodulácia, embryogenéza, poškodenie tkaniva, oprava a regenerácia.17–19 GSK3 existuje ako 2 izoformy: GSK3a a GSK3b. V rôznych tkanivách orgánov sú tieto 2 izoformy exprimované rozdielne. V obličkovej kôre je izoforma b prevažne exprimovaná a lokalizovaná v glomerulách a proximálnych tubulárnych bunkách.20,21 Renálna nadmerná aktivita GSK3b je spojená s rôznymi ochoreniami obličiek, vrátane proteinurických Glo-neuropatií a progresívneho chronického ochorenia obličiek.22 , ako kľúčový prevodník inzulínovej signálnej dráhy, úloha GSK3b v patogenéze DN zatiaľ nie je známa. Zostáva načrtnúť, či sa dysregulácia GSK3b v obličkách podieľa na DN. Na vyriešenie tohto problému táto štúdia skúmala profily expresie celkového a aktivovaného GSK3b vo vzorkách obličiek získaných z dB / dB myších modelov DN nezávislých od inzulínu a v tkanivách biopsie obličiek od pacientov s rôznymi štádiami DN typu 2. Okrem toho sa v retrospektívnych kohortách pacientov s diabetom 2. typu merali hladiny expresie celkového a aktivovaného GSK3b v močových exfoliovaných bunkách, z ktorých sa odobrali vzorky ako tekutá biopsia obličiek na báze moču. Skúmali sme vzťah medzi hladinami expresie GSK3b alebo jeho aktivovanej formy v základných močových exfoliovaných bunkách a vývojom alebo progresiou poškodenia obličiek u diabetických pacientov.

VÝSLEDKY

GSK3b je nadmerne exprimovaný a hyperaktívny v renálnych parenchymálnych bunkách u db/db myší, čo súvisí s progresiou albuminúrie a diabetického poškodenia obličiek

db/db myši s deficitom leptínového receptora sú dobre zavedené modely pre diabetes mellitus 2. typu a DN. Už vo veku 10 týždňov sa u db/db myší spontánne vyvinú skoré príznakyporanenia obličiek, charakterizované progresívnou albuminúriou a akumuláciou matrix v glomerulách.23 Naproti tomu kontrolné myši zodpovedajúceho veku (db/m) majú normálnu glykémiu a žiadne viditeľné známkyochorenie obličiek. V experimente začínajúcom vo veku 10 týždňov bola renálna expresia celkového (obrázok 1) a aktivovaného (obrázok 2) GSK3b (fosforylovaný na Y216 [p-GSK3B]) u db/db myší oproti kontrolným db/m myšiam progresívne zvýšená ( Obrázok 1b a 2b). Toto bolo lokalizované hlavne v podocytoch a mezangiálnych bunkách v glomeruloch (obrázok 1a) a tubulárnych epitelových bunkách v tubulointersticiálnom (obrázok 2a), ako ukazuje imunohistochemické farbenie. Morfologické nálezy boli potvrdené imunoblotovou analýzou homogenátov celých obličiek (obrázok 1c a 2c). Regresná analýza ukázala, že intenzita farbenia celkového (obrázok 1d) a aktivovaného (obrázok 2d) GSK3b v glomeruloch pozitívne koreluje s močovou exkréciou albuminúrie u db/db myší v rôznom veku. Dokonca aj v počiatočnom štádiu diabetu u db/db myší, ako napríklad vo veku 10 alebo 14 týždňov, bola aktivita GSK3b výrazne zvýšená v obličkách, čo sa odráža vo významnej indukcii p-GSK3b (obrázok 2). Zdá sa, že hyperaktivita GSK3b v obličkách db / db myší v ranom štádiu bola do značnej miery pripísaná posttranslačným modifikáciám, ako je fosforylácia na Y216, ale v neskoršom štádiu to bolo spôsobené hlavne zvýšenou expresiou celkového GSK3b.

Progresia DN sa vyznačuje rastúcou akumuláciou extracelulárnej matrice v glomerulách aj intersticiálnych bunkách. V skutočnosti, ako ukazuje fluorescenčné imunohistochemické farbenie FL, obličky myší db / db demonštrovali progresívne zvýšenú expresiu fibronektínu v glomeruloch aj intersticiálnych tkanivách (obrázok 3a). Toto bolo ďalej potvrdené imunoblotovou analýzou obličkových homogenátov pre fibronektín a kolagén IV (obrázok 3b a c). Okrem toho expresia celkového a aktivovaného GSK3b pozitívne korelovala s expresiou fibronektínu vobličkové tkanivá(Obrázok 3d).

Aby sa ďalej určilo, či zvýšená aktivácia GSK3b predchádza vývoju DKD, myši db/db a db/m sa sledovali v samostatnom experimente začínajúcom vo veku 4 týždňov počas štádia prediabetu. V 7. týždni myši db / db preukázali zjavnú hyperglykémiu (doplnkový obrázok S1A), čo naznačuje diabetes, ale žiadne príznaky DKD, ako ukazuje normálna albuminúria (doplnkový obrázok S1B). Je potrebné poznamenať, že dokonca aj v tak skorom štádiu diabetu sa renálna expresia GSK3b a p-GSK3b, ako aj relatívna aktivita GSK3b vyjadrená ako pomer p-GSK3b/GSK3b, variabilne zvýšila, ako bolo merané imunoblotovou analýzou tkanív renálnej biopsie. nasledovaná denzitometriou (doplnkový obrázok S1C a D). Okrem toho lineárna regresná analýza preukázala, že renálna aktivita GSK3b v 7. týždni pozitívne korelovala s vývojom albuminúrie a DKD v 13. týždni (doplnkový obrázok S1E). Okrem toho analýza krivky prevádzkovej charakteristiky prijímača (ROC) preukázala, že renálna aktivita GSK3b u db/db myší vo veku 7 týždňov, keď neboli žiadne známky DKD, poskytla vynikajúcu presnosť a silu pri predpovedaní vývoja albuminúrie a DKD (doplnkový obrázok S1F).

Vystavenie obličkových buniek diabetickému prostrediu spôsobuje nadmernú expresiu a hyperaktivitu GSK3b, čo vedie k diabetickým cytopatickým zmenám

Na určenie, či diabetický stav priamo zvyšuje aktiváciu GSK3b vobličkové bunky, in vitro kultúry rôznych obličkových bunkových línií, vrátane myších podocytov, mezangiálnych buniek a tubulárnych epitelových buniek, boli použité a vystavené diabetickému prostrediu, ktoré pozostáva z vysokej okolitej glukózy a transformujúceho rastového faktora (TGF) b1. Expozícia podocytov diabetickému prostrediu viedla k výraznému poškodeniu podocytov, ktoré sa vyznačuje stratou podocytového markerového proteínu synaptopodínu. To sa zhodovalo s výraznou indukciou celkového a aktivovaného GSK3b, ako sa ukázalo FL fluorescenčným imunocytochemickým farbením (obrázok 4a a b) a potvrdené imunoblotovou analýzou

(Obrázok 4c a d). V kultivovaných mezangiálnych bunkách bola expresia celkového (obrázok 5a) a aktivovaného (obrázok 5b) GSK3b podobne zvýšená po vystavení diabetickému prostrediu, paralelne so zvýšenou expresiou molekúl extracelulárnej matrice, ako je fibronektín (obrázok 5). Podobne kultivované renálne tubulárne epitelové bunky nadmerne exprimovali celkový a aktivovaný GSK3b po liečbe diabetického prostredia, čo bolo sprevádzané dysfunkciou tubulárnych buniek a dediferenciáciou, ktorá sa vyznačuje zníženou a narušenou expresiou molekúl s tesným spojením epitelu, ako je zonula occludens{6}} (ZO -1) (obrázok 6a–d). Na rozdiel od toho, ako kontrola osmolality, pôsobenie manitolu na všetky obličkové bunky viedlo k účinku, ktorý sa nelíšil od toho, ktorý bol sprostredkovaný normálnym prostredím obsahujúcim normálnu okolitú glukózu. Ľudský diabetes zahŕňa nielen hyperglykémiu, ale aj inzulínovú rezistenciu. Hoci na zvieracích modeloch alebo u pacientov nie je možné úplne oddeliť hyperglykémiu od inzulínovej rezistencie, na skúmanie izolovaného účinku vysokej hladiny glukózy oproti inzulínovej rezistencii boli použité in vitro modely. Aby sa napodobnil stav inzulínovej rezistencie, izoforma b inzulínového receptora bola zrazená v kultivovaných podocytoch, mezangiálnych bunkách a renálnych tubulárnych bunkách (doplnkový obrázok S2A–C), čo zosilnilo expresiu a aktivitu GSK3b aj v normálnych podmienkach. prostredia, ako to ukázala imunoblotová analýza a denzitometria. Tento účinok bol posilnený po vystavení diabetickému prostrediu, čo znamená synergický účinok inzulínovej rezistencie a vysokej hladiny glukózy na aktiváciu GSK3b.

Hyperaktivita GSK3b je nevyhnutná a dostatočná pre poškodenie obličkových buniek a dysfunkciu vyvolanú diabetickým prostredím

Aby sa zistilo, či sa hyperaktivita GSK3b podieľa na cytopatických zmenách v obličkových bunkách, aktivita GSK3b vkultivovaná obličkabunky boli umelo manipulované interferenciou RNA

(RNAi) alebo nadmerná expresia génu. Ako je znázornené na obrázku 7a, RNAi využívajúca zmiešanú malú, interferujúcu RNA sotva ovplyvňuje cytopatický účinok diabetického prostredia vo všetkých obličkových bunkách. Na rozdiel od toho umlčanie GSK3b podstatne zrušilo supresiu synaptopodínu vyvolanú diabetickým prostredím v podocytoch, indukciu fibronektínu v mezangiálnych bunkách a narušenie ZO-1 v renálnych tubulárnych bunkách, čo naznačuje, že GSK3b je pravdepodobne nevyhnutný na spustenie cytopatických zmien súvisiacich s diabetom obličkové bunky. Aby sa zistilo, či nadmerná expresia a hyperaktivita GSK3b postačuje na cytopatické účinky vyvolané diabetickým prostredím, bunky sa prechodne transfekovali buď prázdnym vektorom alebo vektorom kódujúcim konštitutívne aktívny mutant GSK3b (S9A). Hoci transfekcia prázdnym vektorom sotva mala nejaké účinky, ektopická nadmerná expresia S9A viedla k strate expresie synaptopodínu v podocytoch, zvýšenej produkcii fibronektínu v mezangiálnych bunkách a zníženej expresii ZO-1 v renálnych tubulárnych bunkách dokonca aj v normálnom prostredí (obrázok 7b), čo pripomína cytopatický účinok diabetického prostredia.

Progresia ľudskej DN sa zhoduje s nadmernou expresiou GSK3b a hyperaktivitou v obličkových glomeruloch a tubuloch

Na ďalšie overenie, či sú vyššie uvedené zistenia na modeloch zvieracích a bunkových kultúr použiteľné aj na klinickú DN, boli archivované tkanivá biopsie obličiek od normálnych jedincov a pacientov s rôznymi štádiami DN spracované na peroxidázové imunohistochemické farbenie na GSK3b a p-GSK3b. Charakteristiky kontrolných subjektov a pacientov sú zhrnuté v doplnkovej tabuľke S1. Ako je znázornené na obrázku 8a, obličky

expresia celkového a aktivovaného GSK3b sa čoraz viac zvyšovala spolu s progresiou DN, ako je odstupňované podľa patologickej klasifikácie založenej na farbení kyselinou periodickou – Schiff. To je v súlade s údajmi Nephroseq, ktoré tiež preukazujú významne zvýšenú expresiu GSK3b v tkanivách biopsie obličiek od pacientov s DN (doplnkový obrázok S3). Zvýšená expresia celkového a aktivovaného GSK3b bola prevažne lokalizovaná v podocytoch a mezangiálnych bunkách v glomeruloch a v renálnych tubulárnych epiteliálnych bunkách v tubulointersticiálnom (obrázok 8a), v súlade so zisteniami u db/db myší. Morfologické výsledky boli ďalej potvrdené počítačovou morfometrickou analýzou, ktorá odhalila pozitívnu súvislosť medzi hladinami expresie celkového (obrázok 8b) alebo aktivovaného (obrázok 8c) GSK3b a závažnosťou DN.

GSK3b je hyperaktívny v močových exfoliovaných bunkách odobratých od diabetických pacientov a predpovedá progresiu renálneho poškodenia Za fyziologických aj chorobných podmienok neustále dochádza k obratu a vylučovaniu renálnych epiteliálnych buniek, ako sú glomerulárne podocyty a tubulárne epitelové bunky, čo vedie k nepretržitému vylučovaniu renálnych parenchýmových buniek do moču. Močové exfoliované bunky boli úspešne využité ako močová neinvazívna tekutá biopsia obličiek na výskumné a diagnostické účely.24,25 Za predpokladu vyššie uvedených zistení, že expresia celkového a aktivovaného GSK3b je zvýšená v renálnych parenchymálnych bunkách u pacientov s DN a DB/DB u myší, dokonca aj v ranom štádiu pred prejavom albuminúrie, nás zaujímalo, či by sa meranie GSK3b v močových exfoliovaných bunkách dalo využiť na predpovedanie

vývoj alebo progresiu ľudskej DKD. Na tento účel sme využili biobanku diabetu a vykonali sme retrospektívnu kohortovú štúdiu. Celkovo bolo do tejto štúdie zaradených 127 pacientov s diabetes mellitus 2. typu, ktorí boli od roku 2010 sledovaní v First Affiliated Hospital of Zhengzhou University bankovými vzorkami frakcionovaného moču. Z týchto pacientov bolo 67 vylúčených, pričom 10 bolo stratených pri sledovaní, 52 malo dysfunkciu obličiek alebo zjavnú proteinúriu na začiatku ochorenia a 5 neskôr diagnostikované ako iné ochorenie obličiek biopsiou obličiek alebo zobrazovaním. Nakoniec bolo do tejto retrospektívnej kohortovej štúdie zaradených 60 pacientov (obrázok 9). Demografické a klinické charakteristiky týchto pacientov na začiatku liečby sú zhrnuté v tabuľke 1. Žiadny z pacientov nemal na začiatku dysfunkciu obličiek alebo zjavnú proteinúriu a ani jeden nezačal dialyzačnú liečbu počas obdobia sledovania. Podľa veľkosti albuminúrie boli pacienti kategorizovaní do 2 podskupín: skupiny normoalbuminúrie a mikroalbuminúrie. Okrem hladín vylučovania albumínu močom (UAE) sa tieto 2 podskupiny pacientov na začiatku štatisticky nelíšili vo všetkých ostatných klinických, biochemických a fyziologických parametroch vrátane trvania diabetu, hladiny glykovaného hemoglobínu, funkcie obličiek, krvného tlaku a predpísanej liečby . Po 5 rokoch sledovania sa u 29 zo 60 pacientov prejavila progresia poruchy funkcie obličiek, ktorá bola definovaná buď ako 25-percentné zníženie odhadovanej glomerulárnej filtrácie (eGFR) alebo ako progresia stavu albuminúrie, ako naznačuje eskalácia závažnosti albuminúrie pozdĺž rôznych klinických štádií DN, to znamená normoalbuminúria, mikroalbuminúria, mikroalbuminúria alebo zjavná proteinúria. Na rozdiel od toho zvyšných 31 pacientov nevykazovalo žiadne známky progresie ochorenia obličiek (obrázok 9). Východiskové údaje pacientov boli stratifikované podľa stavu progresie poruchy funkcie obličiek po 5 rokoch sledovania (tabuľka 2). Pacienti s progresiou poruchy funkcie obličiek v porovnaní s pacientmi bez progresie vykazovali významné zníženie eGFR a výrazné zvýšenie SAE. Na určenie, či bol GSK3b nadmerne exprimovaný alebo nadmerne aktivovaný v obličkových bunkách a

merané na vyhodnotenie citlivosti a špecifickosti aktivity GSK3b v močových exfoliovaných bunkách v porovnaní s východiskovou albuminúriou na predpovedanie progresie poškodenia obličiek. Ako je znázornené na obrázku 11, relatívna aktivita GSK3b v močových exfoliovaných bunkách, vyjadrená ako pomer p-GSK3b/GSK3b, preukázala vynikajúcu presnosť a silu pri rozlišovaní pacientov s progresívnym poškodením obličiek od pacientov so stabilnou funkciou obličiek s plochou pod ROC krivka je 0,844 (95-percentný interval spoľahlivosti, 0,747–0,941; P ¼ 0.001 ), ktorá bola oveľa lepšia ako oblasť pod krivkou ROC pre základnú líniu Ln(SAE) ({{20}},750; 95-percentný interval spoľahlivosti, 0,626–0,874). Hranica, ktorá maximalizovala Youdenov index, bola 1,24 pre pomer p-GSK3b/GSK3b a 76 mg/24 h pre SAE. Pri týchto hraničných hodnotách bola senzitivita a špecificita 69 percent a 87,1 percent pre pomer p-GSK3b/GSK3b a 69 percent a 77,4 percent pre Ln (UAE). Okrem toho kombinácia pomeru p-GSK3b/GSK3b s celkovou hladinou GSK3b v močových exfoliovaných bunkách výrazne zlepšila rozlišovaciu schopnosť, pričom plocha pod krivkou ROC bola 0,971 (95-percentný interval spoľahlivosti, 0,931–1.{48} }). Tieto výsledky naznačujú, že merania aktivity GSK3b v močových exfoliovaných bunkách môžu poskytnúť oveľa lepšiu presnosť ako SAE pri predpovedaní progresie poškodenia obličiek u diabetických pacientov.

To further explore whether enhanced GSK3b activation also predicts the development of DKD, a separate cohort of patients with type 2 diabetes but no signs of kidney disease, who started follow-up between 2010 and 2013, were retrospectively screened and examined (Supplementary Table S2). The baseline characteristics of patients were stratified according to the presence or absence of renal impairment or DKD after 5 years' follow-up (Supplementary Table S3), which was defined as either a $25% reduction in eGFR or the persistent presence of albuminuria (>30 mg/24 h). Močové exfoliované bunky uložené na začiatku boli získané a skúmané imunoblotovou analýzou na GSK3b a p-GSK3b (doplnkový obrázok S4A a B). Aktivita GSK3b sa odhadla pomocou denzitometrických pomerov p-GSK3b k celkovému GSK3b pre každú vzorku vzhľadom na hodnotu kontrolných vzoriek (doplnkový obrázok S4C).

Medzi rôznymi klinickými/biochemickými premennými sa zistilo, že aktivita GSK3b (pomer p-GSK3b/GSK3b) vo východiskových močových exfoliovaných bunkách bola významne vyššia u pacientov, u ktorých sa vyvinula DKD, ako u tých, u ktorých sa nevyskytla (doplnková tabuľka S3). Analýza ROC krivky navyše naznačuje, že relatívna aktivita GSK3b (pomer p-GSK3b / GSK3b) v močových exfoliovaných bunkách poskytla vynikajúcu presnosť a silu pri predpovedaní vývoja DKD u diabetických pacientov v počiatočnom štádiu (doplnkový obrázok S4D).