Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Pls kliknite sem pre časť 2

Cistanche má veľmi dobrý neuroprotektívny účinok

Gabriel Gonzalez 1,2 , Jiˇrí Grz 1, Cosimo Walter D'Acunto 1, Petr Ka ˇnovsk2 a Miroslav Strnad1,2,*

1. Laboratórium rastových regulátorov, Ústav experimentálnej botaniky AV ČR,

a Prírodovedecká fakulta Univerzity Palackého, Šlechtitel ˚u 27, CZ-78371 Olomouc, Česká republika;

Gonzalez.gabriel@seznam.cz (GG); jiri.gruz@upol.cz (JG); waldacun@gmail.com (CWD)

2. Neurologická klinika FN Olomouc a LFUK,

Univerzita Palackého Olomouc, CZ-775 20 Olomouc, Česká republika; Petr.Kanovsky@fnol.cz

* Korešpondencia: miroslav.strnad@upol.cz; Tel.: plus 420-585-634-850

Abstraktné: Cytokinínysú fytohormóny na báze adenínu, ktoré regulujú kľúčové procesy v rastlinách, ako je delenie a diferenciácia buniek, rast koreňov a výhonkov, apikálna dominancia, vetvenie a klíčenie semien. V predbežných štúdiách tiež preukázali ochranné aktivity proti ľudským neurodegeneratívnym ochoreniam. Pre rozšírenie vedomostí o ochrane (ochrannej činnosti), ktorú ponúkajú, sme skúmali aktivity prírodycytokinínyproti toxicite vyvolanej salsolinolom (SAL) (aParkinsonova chorobamodel) a smrť vyvolaná glutamátom (Glu).neurón-ako dopamínergné bunky SH-SY5Y. Zistili sme, že kinetín-3-glukozid, cis-zeatínribozid a N6-izopentenyladenozín boli aktívne v modeli PD indukovanej SAL. Okrem toho trans-, cis-zeatín a kinetín spolu s chelátorom železa deferoxamínom (DFO) a inhibítorom nekroptózy nekrostatínom 1 (NEC-1) významne znížili mieru bunkovej smrti v modeli indukovanom Glu. Laktátdehydrogenázové testy odhalili, žecytokinínyposkytovaná nižšianeuroprotektívneaktivitu ako DFO a NEC-1. Okrem toho redukovali aktivity apoptotickej kaspázy-3/7 menej silne ako DFO. Avšak,cytokinínymal veľmi podobné účinky ako DFO a NEC-1 na produkciu superoxidových radikálov. Celkovo vykazovali ochrannú aktivitu v modeli indukovanom SALparkinsonikneurónovébunková smrť a Glu-indukovaný model oxidačného poškodenia hlavne redukciou oxidačného stresu.

Kľúčové slová: cytokinín; fytohormón; neuroprotekcia; bunky SH-SY5Y podobné neurónom; cytotoxicita; salsolinol; glutamát; oxidačný stres; Parkinsonova choroba

rastlina cistancheo účinkoch naNeuroprotekcia

1. Úvod

Parkinsonova choroba(PD) je druhým najčastejším motorickým neurodegeneratívnym ochorením a očakáva sa, že počet celosvetovo diagnostikovaných prípadov vzrastie zo 6 miliónov v roku 2015 na viac ako 12 miliónov do roku 2040 [1]. Je charakterizovaná motorickými symptómami spojenými so špecifickou degeneráciou a stratou približne 30–70 percent dopamínergných (DA)neurónyv substantia nigra pars compacta a ich projekcie do striata [2,3]. Niektoré z mnohých známych molekulárnych znakov PD zahŕňajú zvýšený oxidačný a nitrozačný stres, mitochondriálnu dysfunkciu [4–7], excitotoxicitu [8], dysfunkciu ubikvitínového/proteazomálneho systému [9] a neurozápal [10]. Súčasné liečby majú rôzne nepriaznivé vedľajšie účinky a ponúkajú iba symptomatickú úľavu [11], takže existuje intenzívne úsilie vyvinúť lieky s účinnými liečebnými účinkami na degenerujúce DAneuróny. Zdroje, ktoré môžu pomôcť takémuto úsiliu, zahŕňajú prírodné zlúčeniny, ktoré majú tendenciu mať menej vedľajších účinkov. Okrem iného látky z Ginkgo biloba (ginkgetín, ginkgolid, bilobalid), ženšenu (ginsenosidy) a flavonoidov (baicaleín, kempferol, rutín a luteolín) preukázali širokú ochrannú aktivitu na niekoľkých modeloch in vitro (vrátane bunkovej línie ľudského neuroblastómu SH -SY5Y) a in vivo modely PD indukovanej 1,1'-dimetyl-4,4'-bipyridíniumdichloridom (paraquat), 1-metyl- 4-fenyl-1, 2,3,6-tetrahydropyridín (MPTP), 1-metyl-4-fenylpyridínium (MPP plus) a 6-hydroxydopamín (6-OHDA) [12].

Tu prezentovaná štúdia sa zamerala na účinky triedy prírodných fytohormónov tzvcytokiníny(CK) a ich metabolity, ktoré sú dobre známymi regulátormi bunkového delenia, rastu, diferenciácie a starnutia listov v rastlinách [13]. Štrukturálne sú CK deriváty adenínu substituované v polohe N6- buď prenylovým (izopentenylovým) alebo aromatickým bočným reťazcom. Prírodné formy zahŕňajú 6-(E)-4-hydroxy-3-metyl, ale-2-enylaminopurín (trans-zeatín, tZ), jeho 6-(Z)-izomér ( cis-zeatín, cZ), N6-izopentenyladenín (iP), 6-benzylaminopurín (BAP), 6-furfurylaminopurín (kinetín, K) a orto-, meta-, a para-hydroxylované alebo metoxylované deriváty BAP, nazývané topolíny (oT, mT, pT, MeoT, MemT, MepT). Bežne sa vyskytujú aj rôzne 9-ribozidy, 9-nukleotidy, ako aj 7-, 9 a O-glukozidy týchto foriem, ako je uvedené v tabuľke 1. Okrem ich prirodzených úloh v rastliny, CK preukázali silnú antioxidačnú aktivitu voči reaktívnym formám kyslíka (ROS), ktoré poskytujú ochranu v niekoľkých in vitro stresových modeloch porúch spojených so starnutím [14].

Tabuľka 1. Štruktúrycytokinínya činidlá pozitívnej kontroly.

Najmä CK majú údajne cytoprotektívnu aktivitu v modeloch, ako je bunková smrť ľudských fibroblastov indukovaná H2O2- [15] a glykooxidačný stres vyvolaný D-galaktózou v potkaních astrocytoch [16]. Ešte dôležitejšie je, že v tomto kontexte ukázalineuroprotektívneúčinky v modeloch súvisiacich s neurodegeneratívnymi ochoreniami, ako je familiárna PD, proteazómový inhibítor MG 132-indukovaná alebo H2O{2}}indukovaná toxicita v SH-SY5Y bunkách [17], Glu-indukované oxidačné poškodenie HT22 myšacieho hipokampuneurónovébunky [18] a bunkový model PC12 Huntingtonovej choroby [19]. Iné štúdie naznačujú, že ochranné aktivity CK zahŕňajú priamu [20,21] aj nepriamu [15,16,22] moduláciu bunkových redoxných systémov. Okrem charakteristických antioxidačných aktivít CK majú údajne regulačné účinky v mitochondriách, ktoré posilňujúneurónovéživotaschopnosť [17]. Okrem toho K môže stabilizovať potenciál mitochondriálnej membrány a zvýšiť produkciu ATP, čím sa zmierni Glu-indukovaná smrť HT22 buniek [18]. Napriek zisteniam týkajúcim sa ich účinkov v niekoľkých modeloch sú však poznatky o ochrannej aktivite CK pri najbežnejšej (sporadickej) forme PD obmedzené.

Aby sme vyriešili medzeru vo vedomostiach opísanú vyššie, systematicky sme hodnotili účinky prirodzených CK a ich metabolitov v dvoch modeloch in vitro: model PD indukovaný salsolinolom (SAL) a model oxidačného poškodenia indukovaný glutamátom (Glu).neurón-ako bunky SH-SY5Y. Táto línia sa použila kvôli svojmu dopaminergnému fenotypu, citlivosti na dopaminergné toxíny, ako je SAL, a pohodlnému vytváraniu relatívne stabilných populácií diferencovanýchneurónovébunky so zníženou rýchlosťou proliferácie po 48-hodinovej expozícii 10 uM kyseline all-trans retinovej (ATRA) [23–25].

Neuron- podobné bunky boli vystavené endo/exotoxínu SAL, aby napodobnili patológiu PD prostredníctvom dysfunkcie bunkového redoxného systému: Deplécia glutatiónu (GSH) a inhibícia aktivít antioxidačných enzýmov (Cu/Zn superoxiddismutáza a kataláza) a mitochondriálnych komplexov (I a II), čo vedie k apoptóze a nekróze [26]. V druhom modeli Glu indukuje potenciálne smrteľné oxidačné poškodenie narušením redoxného systému. Oba modely v bunkovej línii SH-SY5Y boli predtým použité v štúdiách neuroprotekcie [26,27].

Cytoprotektívne a/alebo antioxidačné aktivity súvisiace s degeneratívnymi poruchami K, iP, BAP, iPR, tZR a ich voľných báz boli testované a (ako je uvedené vyššie), zistilo sa, že niektoré CK majú ochranné aktivityneurónovébunky. Žiadne predtým publikované štúdie však neskúmali štruktúruneuroprotektívnevzťah aktivity (SAR) prirodzených CK (tabuľka 1). Preto bola táto štúdia vykonaná na preskúmanieneuroprotektívne(proti-parkinsonik) aktivity takmer všetkých známych prirodzene sa vyskytujúcich CK vo vybraných modeloch neurodegenerácie indukovanej SAL a Glu. Najprv sme vyhodnotili kapacitu absorpcie kyslíkových radikálov (ORAC) každej CK a (v bezpečnostných testoch) cytotoxicitu vočineurón-ako bunky SH-SY5Y. Potom sme hodnotili neuroprotektívne účinky zlúčenín a ich vplyv na hladiny oxidačného stresu meraním produkcie superoxidu (O2.) (dihydroetídium, test DHE) a aktivít apoptickej kaspázy{5}},7. Výsledky poskytujú prvé hlásené systematické náznaky vzťahov medzi prirodzenými štruktúrami CK aneuroprotektívnečinnosti.

Cistanche herbamá veľmi dobrýneuroprotektívneúčinok

2. Výsledky a diskusia

2.1. Cytokinínová kapacita absorpcie kyslíka (ORAC)

Keďže neurodegeneratívne ochorenia sú spojené so zvýšeným oxidačným stresom, antioxidačná aktivita hrá kľúčovú úlohu v obraneneurónovébunky. Na posúdenie biologického potenciálu CK v tomto ohľade bola antioxidačná kapacita stanovená pomocou ORAC, ktorá sa bežne používa na stanovenie antioxidačnej kapacity látok [28]. Antioxidačná kapacita bola vyjadrená ako ekvivalenty Troloxu (TE), čo určuje účinnosť (nižšiu až vyššiu) zlúčenín ako Trolox na ekvimolárnom základe. Výsledky uvedené v tabuľke 1 ukazujú, že topolíny (oT, mT a pT) a ich ribozidy (oTR, mTR, pTR) majú vysoké antioxidačné aktivity, ktoré pravdepodobne úzko súvisia so systémom ich C{{ 3}}hydroxybenzylaminosubstituent. Napriek vysokým hodnotám ORAC topolíny nemali vysokéneuroprotektívnečinnosť. Avšak niekoľko heteroaromatických CK vrátane K (N6-furfurylaminopurínu) a nearomatického cis-zeatín-O-glukozidu (cZOG), ktorý má 4-hydroxy-3-metylbut{{7} }en-1-yl)aminosubstituent tiež vykazoval vysokú antioxidačnú kapacitu (tabuľka 2). Iné metabolity CK – vrátane kinetín{10}}glukozidu (K3G), kinetínribozidu 5<-monophosphate (kmp),="" kinetin-9-glucoside="" (k9g),="" and="" trans-zeatin=""><- monophosphate="" (tzmp)—had="" moderate="" antioxidant="" activity.="" all="" the="" others="" had="" detectable="" capacity="" except="" bap.="" these="" results="" confirm="" previous="" findings="" that="" ip,="" pt,="" k="" can="" act="" as="" direct="" radical="" scavengers,="" but="" conflict="" with="" the="" previously="" reported="" activity="" of="" bap="" in="" the="" orac="" test="" [20,21].="" to="" conclude,="" these="" compounds="" have="" potential="" in="" the="" treatment="" of="" neurodegenerative="" diseases="" associated="" with="" increased="" oxidative="" stress="">

výhody stonky cistanchenaanti-Alzheimerova choroba

2.2. Diferenciácia buniek SH-SY5Y

Študovať CKneuroprotektívneÚčinky, bunky neuroblastómu SH-SY5Y (vybrané z dôvodov už opísaných [23]) boli diferencované expozíciou 10 uM ATRA počas 48 hodín, ako už bolo opísané [23,24]. Potom sa zafarbili pomocou súpravy na farbenie membrán, aby sa preskúmali morfologické rozdiely medzi nediferencovanými a diferencovanými bunkami. Ako je znázornené na obrázku 1A,neurón-podobne diferencované bunky rástli menej husto, boli dlhšie a produkovali viac neuritov (označené žltými šípkami na obrázku) ako nediferencované bunky. Tieto morfologické zmeny spojené s diferenciáciou boli predtým pozorované, dokonca aj po kratšej expozícii (24 h) ATRA [24,30]. Ešte dôležitejšie je, že počet neuritov dramaticky stúpa na úroveň, kedy môžu vytvoriť neuritovú sieť. Z tohto dôvodu sa merala životaschopnosť buniek, aby sa porovnala rýchlosť proliferácie nediferencovaných a diferencovaných buniek SH-SY5Y. Životaschopnosť nediferencovaného SH-SY5Y bola braná ako maximálna rýchlosť proliferácie. Výsledky prezentované v

Obrázok 1B ukazuje, že rýchlosť proliferácie (hodnotená testom životaschopnosti Calcein AM) SH-SY5Y bola znížená o 23 percent po 48 hodinách liečby ATRA.

Obrázok 1. (A) Fluorescenčné mikrofotografie buniek SH-SY5Y s membránami zafarbenými pomocou súpravy Neurite outgrowth kit (Invitrogen™): Kontrolné, nediferencované bunky (vystavené falošnému liečebnému roztoku:<0.1% dmso);="" cells="" differentiated="" by="" exposure="" to="" 10="" um="" all-trans="" retinoic="" acid="" (atra)="" for="" 48="" h.="" bars="50" um.="" (b)="" proliferation="" rates="" of="" undifferentiated="" and="" differentiated="" sh-sy5y="" cells:="" numbers="" of="" viable="" cells="" after="" 48="" h="" exposure="" to=""><0.1% dmso="" and="" 10="" um="" atra,="" respectively.="" data="" were="" obtained="" from="" five="" independent="" experiments="" with="" triplicate="" cultures:="" asterisks="" show="" the="" significance="" of="" differences="" in="" numbers="" of="" viable="" cells="" (as="" percentages="" of="" numbers="" of="" undifferentiated="" cells)="" between="" the="" cultures:="" *="" p="" <="">

Tabuľka 2. Absorpčná kapacita kyslíkových radikálov (ORAC) testovanéhocytokiníny(CK) vyjadrené ako ekvivalenty Troloxu (TE) na ekvimolárnom základe. Názvy, skratky a štruktúry CK sú uvedené na obrázku 1.

2.3. Cytotoxicita cytokinínov voči bunkám SH-SY5Y podobným neurónom

V testoch potenciálnej cytotoxicity CK pomocou testu životaschopnosti Calcein AM [31] väčšina vykazovala nízku toxicitu vočineurón-ako bunky SH-SY5Y. Zníženie životaschopnosti pod 90 percent sa považovalo za prah pre neurotoxický účinok. Jedinými dvoma výnimkami boli KR (11,9 percenta) a pTR (10,5 percenta), v súlade s predchádzajúcimi zisteniami, že niektorícytokinínumetabolity, najmä ribozidy, môžu mať cytotoxické účinky [32]. Iné ribozidy, ako sú cZR, iPR, oTR, mTR, nespôsobili žiadne zjavné zníženieneurón-ako životaschopnosť buniek SH-SY5Y (tabuľka 3). DFO [33,34] a NEC-1 [35,36] použité ako pozitívne kontroly v našom in vitro modeli preukázali aj iné štúdie na bunkách SH-SY5Y ako netoxické. Záverom možno povedať, že hlavne deriváty KR a pTR vykazovali nižšiu životaschopnosť ako 90 percent, a preto sa považovali za menej zaujímavé pre ďalšie hodnotenie v oboch in vitro modeloch neurodegenerácie.

Tabuľka 3. Životaschopnosť buniekneurón-ako bunky SH-SY5Y po ​​vystavenícytokinínypočas 24 hodín. Životaschopnosť je vyjadrená ako percento kontroly DMSO.

2.4. Identifikácia neuroprotektívnych cytokinínov v modeli PD indukovanej SAL

Pre tieto testy,neurónovéBunky SH-SY5Y sa diferencovali počas 48 hodín, potom sa spoločne ošetrili s 5 00 uM SAL a každou CK v troch koncentráciách (0,1, 1, 10 uM). Ako ukazuje bodkovaná čiara na obrázku 2A, aplikácia neurotoxínu SAL v 500 uM znížila životaschopnosť diferencovaných buniek SH-SY5Y podľa testu Calcein AM o 30 percent. N-acetylcysteín (NAC) bol použitý ako pozitívna kontrola v týchto testoch kvôli jeho predtým uvádzanému neuroprotektívnemu účinku v rovnakom in vitro modeli založenom na bunkách SH-SY5Y [37]. Na vyvolanie čiastočného alebo takmer úplného zotavenia v modeli SAL sa použili koncentrácie 10, 100 a 1000 uM NAC. NAC bol schopný zvýšiť životaschopnosť buniek pri koncentrácii 100 uM a 1 mM, čo zodpovedá 83,39 ± 1,74 percenta a 89,21 ± 2,89 percenta, v danom poradí. Ochranná aktivita NAC pri 100 uM (označená prerušovanou čiarou na obrázku 2A) sa použila ako prah účinnosti na výber CK pre ďalšie testy. Podľa tohto nastavenia boli biologicky významné neuroprotektívne aktivity pozorované pri K3G pri 10 uM (81,84 ± 2,36 percenta), cZR pri 0,1 uM (81,14 ± 2,30 percenta) a 1 uM (81,53 ± 2,24 percenta pri 1 percenta) a iPR uM (82,43 ± 2,51 percenta). IPR a cZR boli teda účinné neuroprotektory pri nižších mikro alebo submikromolárnych koncentráciách ako NAC. Thecytokinínuskríning tiež odhalil, že mnoho ďalších metabolitov môže mierne zvýšiť životaschopnosť diferencovaných buniek SH-SY5Y vystavených SAL. Niektoré testované CK (vrátane tZR, tZMP, mT, mTR, pT a pTR) však mali veľmi malý ochranný účinok.

Obrázok 2. (A)Neuroprotektívnečinnosťcytokinínya N-acetylcysteín (NAC) v SAL-indukovanom modeli PD naneurón-ako bunky SH-SY5Y. Prerušovaná čiara ukazuje prah účinku NAC, pri ktoromcytokinínyboli vybrané na ďalšie testovanie; bodkovaná čiara potom počíta počet živých buniek v teste Calcein AM po ošetrení buniek 500 uM SAL; zdravé kontrolné bunky (CTR, DMSO < 0,1="" percenta).="" triplikáty="" počas="" najmenej="" troch="" oddelených="" dní.="" (b)="" normalizovaná="" smrť="" buniek="" sh-sy5y="" po="" ​​farbení="" propidium="" jodidom.="" triplikáty="" za="" najmenej="" päť="" nezávislých="" dní.="" *="" p="" v="" porovnaní="" s="" vozidlom="" s="" 500="" um="" sal,="" #="" p="" v="" porovnaní="" s="" vozidlom="" bez="" 500="" um="">

Aby sa potvrdilo, že najaktívnejšie prirodzené anti-PD aktivity CK, celková miera bunkovej smrti bola kvantifikovaná farbením propidium jodidom (PI), ktoré (na rozdiel od testov životaschopnosti založených na bunkovom metabolizme) označuje iba bunky s narušenou integritou membrány, umierajúce bunky. a už odumreté bunky [38]. Výsledky boli normalizované s ohľadom na mieru bunkovej smrti po liečbe samotnou SAL (nastavená ako 100 percent). Ako je znázornené na obrázku 2B, NAC pozitívna kontrolná látka signifikantne znížila mieru bunkovej smrti pri 100 a 1000 uM (na 77,3 ± 2,21 percenta a 77,5 ± 4,44 percent, v tomto poradí). Celkovo sa NAC ukázalo ako aneuroprotektívnečinidlo s porovnateľnými aktivitami ako tie, ktoré boli zaznamenané v iných štúdiách spôsobom závislým od dávky (v rozsahu 50–500 uM) pre bunky SH-SY5Y [37]. PI test tiež ukázal, že CK cZR, K3G a iPR majú ochranné aktivity, najmä cZR, ktoré znížili mieru bunkovej smrti na 71,6 ± 5,08 percent pri 0,1 uM. Na rozdiel od cZR mal K3G reverzné účinky závislé od dávky s maximálnou aktivitou pri 10 uM (zníženie miery bunkovej smrti na 75,0 ± 3,69 percenta) a aktivita NPR vrcholila pri 1 uM (zníženie rýchlosti na 73,9 ± 4,99 percenta). Celkovo, ako je znázornené na obrázku 2, CK poskytli porovnateľnéneuroprotektívneaktivita na 100 uM NAC podľa testov životaschopnosti aj cytotoxicity. Okrem toho účinné koncentrácie CK, ako je cZR a iPR, boli oveľa nižšie ako koncentrácie NAC v submikromolárnych a mikromolárnych rozsahoch. Predchádzajúce pozorovania získané po dvojitom farbení pomocou PI a anexínu V/PI naznačujú, že K môže znižovať apoptózu [39], a preto sme tiež skúmali účinky CK a NAC na oxidačný stres a aktiváciu kaspázy-3,7 (dobre známy marker apoptózy).

2.5. Cytokiníny znižujú tvorbu superoxidových radikálov indukovanú SAL

Oxidačný stres (OS) je kľúčovým patologickým prispievateľom k niekoľkým neurodegeneratívnym ochoreniam a SAL (pri > 100uM) aj tetrahydroizochinolíny sú silnými induktormi OS [26,40]. Merali sme teda aj tvorbu superoxidu (ROS a dôležitý marker OS) v prítomnosti SAL s a bez vybraných CK alebo NAC. Aby sa zabezpečilo, že SAL spôsobila dostatočné poškodenie OS v bunkách SH-SY5Y na detekciu reakcií, bunky boli vystavené 500 uM SAL počas 24 hodín, ako v predchádzajúcej práci [37] a v súlade so zisteniami uvedenými vyššie. Bunky sa potom zafarbili dihydroetídiom (DHE), aby sa zistila tvorba superoxidových radikálov [41,42]. Ako je možné vidieť na obrázku 3A, bunky boli vizuálne pozorované po označení DHE (ktorý poskytuje červené fluorescenčné signály po reakcii so superoxidom). SAL vyvolal jasný nárast fluorescencie DHE v porovnaní s hladinami v kontrolných bunkách a bunkách ošetrených NAC. Okrem toho tri CK (cZR, K3G a iPR) mali podobné vizuálne účinky ako NAC (100 uM) na fluorescenciu DHE. Okrem toho spektrofotometrická kvantifikácia s ohľadom na hladiny detegované v bunkách ošetrených samotnou SAL (nastavená ako 100 percent) bola v súlade s pozorovaním mikroskopom. Ako je znázornené na obrázku 3B, normalizovaná hladina superoxidu v zdravých kontrolných bunkách (CTR) bola nižšia ako 39 percent a pozitívna kontrolná látka NAC poskytla mierne až úplné zníženie produkcie ROS indukovanej SAL pri 100 a 1000 uM (na 76,3 ± 4,33 a 44,3 ± 5,12 percenta, čo naznačuje, že deplécia glutatiónu (GSH) hrá v modeli kľúčovú úlohu [26]. Je zaujímavé, že SAL vyvolal dramatické zníženie obsahu GSH v bunkách SH-SY5Y sprevádzané zvýšením OS na úrovne podobné tým, ktoré sa predtým pozorovali v štúdii, ktorá tiež zaznamenala účinky sprostredkované NAC na životaschopnosť buniek, bunkovú smrť a obsah glutatiónu [43]. . Výsledky uvedené v tomto dokumente ukazujú, že NAC tiež znížil tvorbu superoxidových radikálov na bazálne hladiny (tj hladiny v kontrolách ošetrených DMSO). CK ribozidy boli testované v aktívnych koncentráciách (0,1–1 uM) spolu s K3G a významne znížili obsah superoxidových radikálov v bunkách na nasledujúce hladiny (v porovnaní s hladinami buniek ošetrených samotnou SAL): cZR 80,34 ± 5,99 percent pri 0,1 uM ; K3G 77,1 ± 4,89 percent pri 10 uM; iPR 79,2 ± 5,91 percent pri 1 uM, porovnateľné s účinkami 100 uM NAC. Súhrnne ortogonálne demonštrácie silne naznačujú, že silná anti-OS aktivita hrá kľúčovú úlohu v ochranných účinkoch NAC a CK v modeli PD indukovanej SAL. Koreláciu medzi zlepšením OS a neuroprotekciou zaznamenali aj iní autori [29] a niekoľko štúdií zistilo, že K a BAP môžu priamo zlepšiť aktivity OS [44] prostredníctvom tvorby komplexov s iónmi Cu2 plus, čo vedie k vzniku superoxiddismutázy- podobná aktivita [45,46]. CK však boli opísané aj ako nepriame antioxidanty s účinkami sprostredkovanými indukciou dráhy antioxidačnej odozvy (iPR) jadrového faktora erytroidného 2-faktora 2 (NRF2) [22] alebo čiastočným obnovením aktivity glutatiónperoxidázy a SOD ( K) [16]. Okrem toho K údajne máneuroprotektívneaktivity proti poškodeniu OS vyvolanému H2O2 v bunkách SH-SY5Y [17]. Oba typy hlásenej anti-ROS aktivity CK by mohli potenciálne vysvetliť účinky cZR, K3G a iPR na redukciu superoxidových radikálov v modeli PD buniek SH-SY5Y indukovaných SAL [47–50].

Obrázok 3. (A) Mikrofotografie zobrazujúce oxidačný stres vyvolaný SAL a aktivity znižujúce oxidačný strescytokinínyu človeka diferencovaneneurón-ako bunky SH-SY5Y vizualizované fluorescenčnou mikroskopiou po označení dihydroetídiom (DHE). Pruhy=50 um. Obrázky ukazujú bunky ošetrené roztokom DMSO (kontroly), 500 uM salsolinolom (SAL) samotným a kombináciami 500 uM SAL a 1000 uM NAC (plus NAC), 0,1 uM cZR (plus cZR); 10 uM K3G (plus K3G), 1 uM iPR (plus iPR) počas 24 hodín pred farbením s DHE. (B) SAL-indukovaná tvorba superoxidových radikálov acytokinínualebo N-acetylcysteín (NAC) ochranná aktivita. Graf ukazuje kvantifikáciu buniek zafarbených DHE s použitím čítačky mikrodoštičiek Infinite M200 Pro (Tecan, Rakúsko). Triplikáty za najmenej päť nezávislých dní. * P v porovnaní s vozidlom s 500 uM SAL, # P v porovnaní s vozidlom bez 500 uM SAL.