Časť 2: Akteozid potláča osteoklastogenézu sprostredkovanú RANKL inhibíciou indukcie C-Fos a dráhy NF-KB a oslabením produkcie ROS

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Seung-Youp Lee1,2., Keun-Soo Lee3.¤, Sea Hyun Yi2., Sung-Ho Kook, Jeong-Chae Lee22,3*

Pls kliknite sem späť na časť 1

akteozidInhibuje kostnú resorpciu makrofágmi Akteozid tiež zabránil RANKL-sprostredkovanej kostnej resorpcii spôsobom závislým od dávky, ako bolo merané in vitro modelovým systémom (obr. 3A). Kostná resorpcia bola významne inhibovaná, keď boli BMM inkubované s 1 mM akteozidom (obr. 3B). Ošetrenie 10 mM akteozidom takmer úplne zoslabilo tvorbu jamiek indukovanú RANKL pomocou BMM. Podobne akteozid znížil kostnú resorpciu v bunkách RAW264.7 stimulovaných RANKL (obr. S2A a B). Schopnosť akteozidu inhibovať kostnú resorpciu závisela od načasovania liečby v porovnaní so stimuláciou RANKL. Akteozid (10 mM) pridaný 4 dni po stimulácii RANKL neznížil tvorbu jamiek v BMM, zatiaľ čo potlačil počet vytvorených osteoklastov (obr. 3C). Tento rozdielny výsledok bol čiastočne spôsobený oblasťou jamiek už vytvorenou po 4 dňoch tvorby stimulácie RANKL (obr. 3D).

EXTRAKT CISTANCHE

akteozidDown-reguluje včasné signálne dráhy RANKL

RANKL indukuje aktiváciu 3 dobre známych MAPK a NF-kB v prekurzoroch osteoklastov a táto aktivácia je potrebná na skorú diferenciáciu osteoklastov. Aby sme pochopili možné mechanizmy, ktorýmiakteozidinhibuje osteoklastogenézu, skúmali sme účinokakteozidna MAPK a aktiváciu NF-kB v makrofágoch. Bunky BMM a RAW264.7 boli vopred ošetrené 10 mM akteozidom počas 2 hodín a potom stimulované 100 ng / ml RANKL počas 30 minút. Fosforylácia MAPK sa skúmala Western blotom a imunometrickou analýzou. RANKL indukoval fosforyláciu p38, ERK a JNK v BMM (obr. 4A) a RAW264.7 bunkách (obr. 4B). Akteozid zabránil týmto RANKL-indukovaným zvýšeniam p-p38, p-ERK a p-JNK. Tento výsledok podporila imunometrická analýza, ktorá predošetrením 10 mM akteozidom významne inhibovala hladiny fosforylovaných MAPK v týchto makrofágoch (obr. 4C). Ošetrenie RANKL zvýšilo DNA-viazanie NF-kB, zatiaľ čo akteozid inhiboval RANKL-indukovanú aktiváciu NF-kB-DNA väzby (obr. 5A). Táto inhibícia bola výraznejšia v BMM ako v bunkách RAW264.7. Akteozid tiež znížil RANKL-stimulovanú fosforyláciu p65 a IkBa v bunkách BMM a RAW264.7 (obr. 5B a C). Pridanie 10 mM akteozidu takmer úplne inhibovalo degradáciu aj aktiváciu IkBa v BMM (obr. 5B). Aby sa ďalej potvrdilo, že aktivácia NF-kB sa podieľa na pôsobení akteozidu, konštrukty promótor-luciferáza kB boli prechodne transfekované do buniek RAW264.7. Bunky inkubované so 100 ng/ml RANKL mali 3-krát vyššiu aktivitu kB promótora, ktorá bola významne oslabená 10 mM akteozidom (obr. 5D).

akteozidPotláča produkciu zápalových cytokínov a expresiu TNF-a, c-Fos a NFATc1 v RANKL-stimulovaných makrofágoch TNF-a, IL-1b a IL-6 sú dôležité pri tvorbe osteoklastov a funkciu, ktorá je sprostredkovaná NF-kB signalizáciou v RANKL-stimulovaných makrofágoch. RANKL stimuloval produkciu týchto cytokínov a táto produkcia bola výrazne znížená predošetrením 10 mM akteozidom v BMM (obr. 6A). Podobne akteozid zoslabil RANKL-indukovanú produkciu cytokínov, okrem IL -6, v makrofágoch RAW264.7 (obr. S3). Aby sme pochopili molekulárne mechanizmy účinku akteozidu pri osteoklastogenéze, ďalej sme skúmali účinok akteozidu na expresiu TNF-a, c-Fos a NFATc1. RANKL up-reguloval expresiu mRNA týchto faktorov v bunkách BMM a RAW264.7 (obr. 6B a C). Predbežné ošetrenie 10 mM akteozidom významne inhibovalo RANKL-indukovanú expresiu týchto faktorov v oboch

BMM a bunky RAW264.7. Predbežné ošetrenie akteozidom tiež výrazne znížilo hladiny proteínov c-Fos a NFATc1 v BMM stimulovaných RANKL (obr. 6D). Tieto výsledky naznačujú, že akteozid down-reguluje RANKL indukujúce mediátory tvorby osteoklastov na úrovni génov a proteínov.

EXTRAKT CISTANCHE: AKTEOZID

Akteozid znižuje intracelulárnu tvorbu ROS v BMM spôsobom závislým od dávky

Pretože je známe, že intracelulárna produkcia ROS koreluje s osteoklastogenézou stimulovanou RANKL, skúmali sme, či akteozid inhibuje produkciu ROS počas diferenciácie osteoklastov sprostredkovanej RANKL pomocou bunkovo ​​priepustného farbiva citlivého na oxidáciu, DCFH-DA. Analýza prietokovou cytometriou ukázala, že priemerný fluorescenčný signál špecifický pre DCF v BMM bol zjavne posunutý doprava po stimulácii RANKL v porovnaní s neošetrenými kontrolnými bunkami (obr. 7A). Tento posun bol podobný ako v prípade, že makrofágy RAW264.7 boli pozorované po stimulácii RANKL (údaje nie sú uvedené). Liečba BMM akteozidom znížila intenzitu signálu DCF spôsobom závislým od dávky. Predbežné ošetrenie 10 mM akteozidom takmer úplne znížilo hladiny intracelulárnych ROS produkovaných počas diferenciácie osteoklastov na neošetrené kontrolné hladiny (obr. 7B).

Perorálne podávanie akteozidu inhibuje zmenu osteoporotických biochemických markerov a úbytku kostnej hmoty u myší po ovariektómii

Aby sme preskúmali účinok akteozidu na stratu kostnej hmoty, pripravili sme osteoporotický zvierací model pomocou ovariektómie. Počas experimentálneho obdobia nebol žiadny významný rozdiel v telesnej hmotnosti medzi myšami OVX a Sham (údaje nie sú uvedené). Skupina OVX mala významne vyššie sérové ​​hladiny IL-1b a IL-6 ako skupina Sham (obr. 8). Ovariektómiou indukované zvýšenia týchto zápalových cytokínov boli oslabené perorálnym podávaním akteozidu (AC skupina). Sérové ​​hladiny markerov kostného obratu, ako je ALP, vápnik, TRAP5b a OC, boli významne zvýšené v skupine OVX. Z týchto osteoporotických markerov boli zvýšené hladiny vápnika, TRAP5b a OC u OVX myší zjavne inhibované liečbou akteozidmi, zatiaľ čo sérová hladina ALP sa liečbou nezmenila. Priemerné maximálne zaťaženie zlomeniny do stredu pravého diafýzu stehennej kosti bolo signifikantne nižšie v skupine OVX ako v skupine Sham (obr. 9A). Liečba akteozidmi zvýšila maximálnu zlomeninu späť na zlomeninu skupiny Sham. Keď bola vypreparovaná kortikálna kosť stehennej kosti a pozorovaná optickou mikroskopiou, osteoporotické znaky ukázané v skupine OVX u AC myší takmer úplne zmizli (obr. 9B). Na overenie účinku akteozidu na model osteoporózy indukovanej OVX sa pomocou mikro-CT analyzovali BMD a kostné morfologické parametre v trabekulárnej časti ľahkého proximálneho femuru. Ako je znázornené na obr. 9C, u OVX myší bola zistená zmena femorálnej trabekulárnej architektúry, zatiaľ čo táto zmena bola znížená liečbou akteozidom. Výsledky z mikro-CT analýzy odhalili, že BMD, miera sily kostí, bola u OVX myší dramaticky znížená (obr. 9D). V porovnaní so skupinou Sham OVX myši tiež vykazovali významné zmeny v BV/TV, Tb. Sp a Tb. N, ale nie v Tb.Th. Orálna liečba akteozidmi u OVX myší významne zabránila zmene BMD, ako aj BV/TV a Tb.N.

Akteozid neovplyvňuje osteoblastogenézu v bunkách kostnej drene

Úloha akteozidu na osteoblastickú diferenciáciu bola ďalej skúmaná pomocou buniek kostnej drene. Ako je znázornené na obr. 10A, ošetrenie DAG zvýšilo počet buniek zafarbených alizarínovou červenou a toto sa nezmenilo predošetrením 10 mM akteozidom. Množstvo prítomného farbiva naznačuje, že kombinovaný akteozid aOšetrenie DAG nezmenilo mineralizáciu (obr. 10B). Podobne DAG-indukované zvýšenie obsahu intracelulárneho vápnika (obr. 10C) a hladín mRNA (obr. 10D) markerov špecifických pre kosti, ako sú Runx2, osterix, BSP a OC, nebolo ovplyvnené predbežnou liečbou akteozidom.

účinok cistanche akteozidu

Diskusia

Remodelácia kosti je prísne regulovaná rovnováhou medzi tvorbou kosti osteoblastmi a resorpciou kosti osteoklastmi. Predĺžená a nadmerná kostná resorpcia spôsobuje nerovnováhu kostného obratu, čo vedie k ochoreniam resorpcie kostí. Na preskúmanie účinkov akteozidu na osteoklastogenézu sme použili dva makrofágy, primárne kultivované BMM a bunky RAW264.7.

Tieto bunky boli stimulované RANKL, aby sa diferencovali na osteoklasty v prítomnosti a neprítomnosti akteozidu. Prvýkrát sme ukázali, že akteozid inhibuje diferenciáciu a tvorbu osteoklastov. Samotný akteozid v skúmaných koncentráciách nespôsobil zníženie životaschopnosti primárne kultivovaných makrofágov v podmienkach rastu ani diferenciácie.

Liečba akteozidmi tiež znížila resorpčnú aktivitu zrelých osteoklastov. Tieto výsledky naznačujú, že akteozid potláča tvorbu osteoklastov z makrofágov a aktivitu resorpcie osteoklastov. Výsledky z nášho kultivačného systému, ktorý nezahŕňal osteoblasty alebo stromálne bunky, tiež naznačujú, že akteozid zabraňuje tvorbe osteoklastov priamym pôsobením na prekurzory osteoklastov.

RANKL aktivuje MAPK vrátane p38, ERK a JNK. Tieto tri kinázy sa podieľajú na včasnej osteoklastickej diferenciácii, a preto ich inhibícia farmakologicky alebo s dominantne negatívnou transfekciou JNK potláča RANKL-indukovanú osteoklastogenézu [29]. Naše výsledky odhalili, že predbežné ošetrenie akteozidmi inhibovalo všetky tieto kinázy, čo naznačuje nešpecifickú down-reguláciu MAPK. Tento výsledok sa čiastočne líšil od predchádzajúcej správy, že EGCG, hlavná protizápalová zlúčenina v zelenom čaji, špecificky zoslabil aktiváciu JNK bez ovplyvnenia aktivácie ERK alebo p38 v BMM stimulovaných RANKL [7]. Paeonol, protizápalová zlúčenina odvodená z čínskej byliny, tiež inhibuje fosforyláciu ERK a p38, ale nie JNK, v bunkách RAW264.7 stimulovaných RANKL [30]. Na rozdiel od toho silibinín, nový inhibítor v kostiach, zoslabil RANKL-indukovanú aktiváciu p38, ERK a JNK [31]. Tieto zistenia naznačujú, že účinky antiresorpčných zlúčenín na aktiváciu MAPK prostredníctvom RANKL závisia od zlúčeniny, hoci všetky tri MAPK sa podieľajú na včasnej osteoklastogenéze.

Berúc do úvahy pozorovanie, že akteozid oslabil p-JNK

hladín v RANKL-stimulovaných BMM, dokonca aj pri 1 mM, sa blokáda JNK skôr ako p38 MAPK alebo ERK javila ako špecifickejšia udalosť v akteozidmi sprostredkovanej anti-osteoklastogenéze v bunkách. Hoci akteozid v rovnakej koncentrácii neznížil počet osteoklastov v BMM, došlo k významnému zníženiu tvorby jamiek liečbou akteozidmi. Zistili sme tiež, že predbežná liečba SP600125, farmakologickým inhibítorom špecifickým pre JNK, dramaticky zabránila tvorbe osteoklastov (údaje nie sú uvedené). Súhrnne tieto zistenia naznačujú, že signalizácia sprostredkovaná JNK úzko súvisí s akteozidmi sprostredkovanou supresiou osteoklastogenézy stimulovanej RANKL.

NF-kB signalizácia reguluje bunkové udalosti, vrátane apoptózy, progresie bunkového cyklu, bunkovej adhézie, produkcie cytokínov a prežitia v makrofágoch [32]. Signalizácia NF-kB je tiež potrebná na vývoj osteoklastov, čo bolo preukázané objavením sa osteopetrózy u myší s knockoutom NF-kB [33,34]. Preto sa navrhuje, aby inhibícia NF-kB bola účinným cieľom pre antiresorpčné činidlá na zníženie aktivity osteoklastov a liečbu osteoporózy. Posttranslačná modifikácia proteínov podrodiny NF-kB je rozhodujúca pri modulácii aktivity NF-kB. Najmä fosforylácia p65 podjednotky a IkB kinázy je rozhodujúca pre NF-kB na vyvolanie osteoklastogenézy [7]. Naše súčasné zistenia ukázali, že stimulácia RANKL zvýšila DNA väzbovú aktivitu NF-kB a fosforyláciu podjednotky p65 a IkBa v bunkách BMM aj RAW264.7. Predbežné ošetrenie akteozidom inhibovalo tieto zvýšenia indukované RANKL, čo viedlo k zníženiu aktivity NF-kB. V dôsledku toho tieto výsledky naznačujú, že okrem MAPK je hlavným cieľom akteozidu pri inhibícii diferenciácie a tvorby osteoklastov z makrofágov stimulovaných RANKL aj signalizácia NF-kB.

Okrem signalizácie NF-kB hrá kľúčovú úlohu vo vývoji osteoklastov dráha c-Fos/c-Jun/NFATc1, takže nedostatok ktoréhokoľvek z týchto proteínov môže zastaviť osteoklastogenézu [35,36]. V tejto štúdii sme zistili, že akteozid zabraňuje expresii c-Fos a NFATc1 indukovanej RANKL na úrovni mRNA a proteínu. JNK je upstream kináza c-Jun, ktorá je potrebná na expresiu NFATc1 a osteoklastogenézu ako odpoveď na RANKL [29].

Blokovanie JNK/c-Jun dráhy pomocou junk inhibítora znížilo RANKL-indukovanú tvorbu osteoklastov a expresiu c-Fos a NFATc1 [7]. Naše výsledky a predchádzajúce zistenia naznačujú, že inhibícia signalizácie sprostredkovanej JNK akteozidom je úzko spojená s prevenciou c-Fos a NFATc1 sprostredkovaných RANKLexpresiu, ktorá potláča diferenciáciu osteoklastov v makrofágoch. Rozdiely v účinkoch akteozidu na BMM a bunky RAW264.7 sú aspoň čiastočne spôsobené rozdielmi v citlivosti na inhibíciu JNK.

TNF-a môže indukovať osteoklastogenézu nezávisle od signalizácie RANKL-RANK [37]. IL-1 je účinným mediátorom patologickej deštrukcie kostí vyvolanej nedostatkom estrogénu alebo zápalom [7]. Narušenie signalizácie IL-1 receptora typu I alebo IL{6}} môže zvrátiť úbytok kostnej hmoty vyvolaný ovariektómiou [38] alebo reumatoidnou artritídou [39]. Táto štúdia preukázala schopnosť akteozidu znižovať produkciu zápalových cytokínov, ako sú TNF-a, IL- 1b a IL-6 v makrofágoch. Predpokladá sa, že akteozid inhibuje produkciu zápalových cytokínov potlačením p38 kinázy a signalizácie ERK, pretože na lipopolysacharidmi indukovanú produkciu týchto cytokínov v makrofágoch je potrebná aktivácia ERK1/2, p38 MAPK alebo oboch [40,41]. Luteolín, zápalová zlúčenina, tiež potláča produkciu zápalových mediátorov inhibíciou aktivácie p38 MAPK [42]. V tejto štúdii sme tiež zistili, že akteozid zmiernil stratu kostnej hmoty u myší po ovariektómii, o čom svedčí obnovená maximálna sila zlomeniny v strednej časti pravej stehennej kosti a vymiznutie osteoporotických kortikálnych kostí. Perorálne podávanie akteozidu znížilo ovariektómiou indukované zvýšenie hladín IL-1b a IL-6 v sére, ale nie ALP. Zvýšené hladiny vápnika, TRAP a OC v sére v OVX boli tiež inhibované perorálnou liečbou akteozidom, čo naznačuje, že akteozid zmierňuje zmenu biomarkerov špecifických pre tvorbu kostí, ako aj resorpciu. Keďže osteoporóza je charakterizovaná zníženou hustotou hmoty a zhoršenou mikroarchitektúrou trabekulárnej kosti, OVX-indukovaný úbytok trabekulárnej kosti a zmena morfometrických parametrov boli významne inhibované perorálnym podávaním akteozidu. Tieto zistenia naznačujú, že akteozid sa môže použiť ako antiresorpčné činidlo na liečbu osteoporózy zvrátením nevyváženej aktivácie osteoklastov. Osteoblasty sú však primárnym faktorom zodpovedným za tvorbu novej kosti. Na zvýšenie tvorby kosti je teda potrebné činidlo schopné zvýšiť proliferáciu alebo diferenciáciu osteoblastov [30]. Na rozdiel od toho sme zistili, že akteozid neovplyvnil diferenciáciu alebo mineralizáciu osteoblastov v bunkách kostnej drene ošetrených DAG. Celkovo naše výsledky naznačujú, že akteozid má antiresorpčný účinok, ale priamo neovplyvňuje tvorbu kostí. Na objasnenie toho, či akteozid prospieva osteoblastogenéze alebo nie, sú potrebné podrobnejšie experimenty analyzujúce parametre špecifické pre kosti in vivo a in vitro.

Táto štúdia zdôrazňuje inhibičný účinok akteozidu na diferenciáciu osteoklastov a kostnú resorpciu potlačením MAPK a niekoľkých transkripčných faktorov, ako sú NF-kB, c-Fos a NFATc1. Údaje naznačujú dva možné mechanizmy, ktorými má akteozid tieto výhody.

CISTANCHE ECHINAKOZID A AKTEOZID MÔŽU liečiť osteoporózu

Referencie

1. RhoJ, Takami M, Choi Y (2004) Osteoimunológia: interakcie imunitného a kostného systému. Molekuly a bunky 17: 1–9.

2. Del Fattore A, Capannolo M, Rucci N (2010) Kosť a kostná dreň: ten istý orgán. Archives of Biochemistry Biophysics 503: 28–34.

3. Rachner TD, Khosla S, Hofbauer LC (2011) Osteoporóza: teraz a budúcnosť. Lancet 377: 1276–1287.

4. Sturge J, Caley MP, Waxman J (2011) Kostné metastázy pri rakovine prostaty: vznikajúce terapeutické stratégie. Nature Reviews Clinical Oncology 8: 357–368.

5. Goltzman D (2002) Objavy, drogy a poruchy kostry. Nature Reviews Drug Discovery 1: 784–796.

6. Rodan GA, Martin TJ (2002) Terapeutické prístupy k ochoreniam kostí. Science 289: 1508–1514.

7. Lee JH, Jin H, Shim HE, Kim HN, Ha H a kol. (2010) Epigalokatechín-3- galát inhibuje osteoklastogenézu znížením expresie c-Fos a potlačením signálu jadrového faktora-kappaB. Molecular Pharmacology 77: 17–25.

8. Kim HN, Lee JH, Jin WJ, Ko S, Jung K, a kol. (2012) MS-275, inhibítor benzamidovej históndeacetylázy, zabraňuje osteoklastogenéze znížením expresie c-Fos a potláča stratu kostnej hmoty u myší. European Journal of Pharmacology 691: 69–76.

9. Kim T, Ha H, Shim KS, Cho WK, MaJY (2013) Antiosteoporotický účinok Yijung-tang v modeli potkanov s ovariektómiou sprostredkovaný inhibíciou diferenciácie osteoklastov. Journal of Ethnopharmacology 146: 83–89.

10. Nakanishi A, Litsuka N, Tsukamoto J (2013) Rybí olej potláča kostnú resorpciu inhibíciou osteoklastogenézy prostredníctvom zníženej expresie M-CSF, PU.1, MITF a RANK u potkanov po ovariektómii. Molecular Medicine Reports 7: 1896–1903.

11. Bar-Shavit Z (2007) Osteoklast: viacjadrová osteoimunitná bunka, ktorá má hematopoetický pôvod a resorbuje kosť. Journal of Cellular Biochemistry 102: 1130–1139.

12. Takahashi N, Maeda K, Ishihara A, Uehara S, Kobayashi Y (2011) Regulačný mechanizmus osteoklastogenézy signálmi RANKL a Wnt. Frontiers in Bioscience 16: 21–30.