Extrakt z Cistanche Deserticola zvyšuje tvorbu kostí v osteoblastoch
Mar 05, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Te-Mao Lia, Hsin-Chih Huangb, Chen-Ming Suc, Tin-Yun Hoa, Chi-Ming Wua, Wen-Chi Chend, Yi-Chin Fonga,ea Chih-Hsin Tangf,c
Abstraktné
Ciele:Skúmali sme účinokCistanche deserticola Ma. (CD) na tvorbu kostí kultivovanými osteoblastmi.MetódyTest tvorby mineralizovaných uzlín sa použil na skúmanie účinkov CD in vitro na tvorbu kostí. Expresia mRNA alkalickej fosfatázy (ALP), kostných morfogenetických proteínov (BMP)-2 a osteopontínu (OPN) bola analyzovaná kvantitatívnou polymerázovou reťazovou reakciou v reálnom čase. Mechanizmus účinku CD extraktu bol skúmaný pomocou Western blottingu. In vivo antiosteoporotický účinok CD extraktu bol hodnotený u myší po ovariektómii.Kľúčové poznatkyCD extrakt nemal žiadny vplyv na proliferáciu, migráciu alebo hojenie rán kultivovaných osteoblastov, ale zvýšil ALP, BMP{0}} a OPN mRNA a mineralizáciu kostí. Inhibítory mitogénom aktivovanej proteínkinázy (MAPK) alebo nukleárneho faktora (NF)-kB znižovali tvorbu kostí indukovanú CD extraktom a expresiu ALP, BMP-2 a OPN. CD extrakt však neovplyvnil osteoklastogenézu. Okrem toho CD extrakt zabránil strate kostnej hmoty vyvolanej ovariektómiou in vivo.ZáveryCD môže byť novým činidlom na tvorbu kostí na liečenie osteoporózy.
Úvod
Kosť je komplexné tkanivo zložené z niekoľkých typov buniek, ktoré podstupujú nepretržitý proces obnovy a opravy nazývaný „remodelácia kostí“. Dva hlavné typy buniek zodpovedné za prestavbu kostí sú osteoklasty, ktoré resorbujú kosť, a osteoblasty, ktoré tvoria novú kosť. Remodeláciu kostí regulujú viaceré systémové hormóny (napr. parathormón, 1, 25-hydroxyvitamín D3, pohlavné hormóny a kalcitonín) a lokálne faktory (napr. oxid dusnatý, prostaglandíny, rastové faktory a cytokíny).[1]
Osteoporóza vzniká vtedy, keď resorpcia a tvorba kosti nie sú koordinované a nadmerný rozklad kostí prevyšuje stavbu kostí.[2] Súčasná liečba osteoporózy zahŕňa bisfosfonáty, kalcitonín a estrogén, čo sú inhibítory kostnej resorpcie, ktoré udržujú kostnú hmotu inhibíciou aktivity osteoklastov.[3] Účinok týchto liekov na zvýšenie alebo obnovenie kostnej hmoty je však relatívne malý, určite nie viac ako 2 percentá ročne.[3] Existuje preto potreba látok na stavbu kostí, ako je teriparatid, ktoré stimulujú tvorbu novej kosti a korigujú zmenu v trabekulárnej mikroarchitektúre, ktorá je charakteristická pre rozvinutú osteoporózu.[4,5] Pretože tvorba novej kosti je primárne funkciou osteoblasty, látky, ktoré pôsobia buď zvýšením proliferácie buniek osteoblastickej línie alebo indukciou diferenciácie osteoblastov, môžu zvýšiť tvorbu kostí.[5,6]
Hoci mechanizmy osteoporózy zostávajú nejasné, pravdepodobne súvisia so zníženou dostupnosťou alebo účinkami rastových faktorov kostí, ako sú kostné morfogenetické proteíny (BMP).[7] BMP, ktoré sú štrukturálne príbuzné superrodine trans-formujúceho rastového faktora-b, boli pôvodne identifikované podľa ich schopnosti vyvolať ektopickú tvorbu kostí u hlodavcov.[8] BMP hrajú dôležitú úlohu pri tvorbe kostí a diferenciácii kostných buniek tým, že stimulujú aktivitu alkalickej fosfatázy (ALP), ako aj syntézu proteoglykánu, kolagénu a osteopontínu (OPN).[9] Nedávna štúdia zistila súvislosť medzi osteoporózou a špecifickými polymorfizmami v génoch BMP-2, ALP a OPN, čo naznačuje, že sú spojené s rozvojom osteoporózy.[10]
Cistanche deserticola Ma.(Orobanchaceae; skrátene CD) je pôvodná bylina v Číne a je široko používaná v tradičnej medicíne ako terapeutické činidlo kvôli svojim sedatívam, analgetickým a imunostimulačným vlastnostiam.[11] Moderné farmakologické štúdie ukázali, že CD extrakty môžu stimulovať imunitu[12], zachytávať voľné radikály[13] a zvyšovať aktivitu superoxiddismutázy[14]. Protizápalové a antioxidačné činidlá majú potenciál liečiť osteoporózu zvýšením tvorby kosti a/alebo potlačením kostnej resorpcie.[15,16] Účinok CD na funkciu kostných buniek však ešte nebol stanovený. Tu uvádzame, že CD extrakt neovplyvnil proliferáciu, migráciu alebo aktivitu hojenia rán kultivovaných osteoblastov, ale zvýšil expresiu ALP, BMP-2 a OPN a mineralizáciu kostí. Okrem toho sme ukázali, že mitogénom aktivovaná proteínkináza (MAPK) a signálne dráhy jadrového faktora (NF)-kB sa môžu podieľať na zvýšení expresie génov a mineralizácii kostí sprostredkovanom CD. Na rozdiel od toho CD extrakt nepotláčal osteoklastogenézu in vitro. Predovšetkým liečba CD extraktom u myší zabránila strate kostnej hmoty vyvolanej ovariektómiou in vivo. Naše údaje preto naznačujú, že CD možno použiť na stimuláciu tvorby kostí na liečbu osteoporózy.
Cistanche deserticola
Materiály a metódy
Extrakt a materiály Cistanche deserticola
CD extrakt bol zakúpený od Chuang Song-Zong Pharmaceutical Company (Kaohsiung, Taiwan). Extrakcia a izolácia CD sa sledovali tak, ako už bolo opísané (na základe spektrálnych údajov identifikovali chemické zloženie vrátane beta-sitosterolu, daukosterolu, kyseliny jantárovej, triakontanolu, akteozidu, betaínu a polysacharidu).[17] Králičie polyklonálne protilátky špecifické pre p-extracelulárne signálne regulované kinázy (ERK), ERK, p-p38, p38, pc-Jun N-terminálne kinázy (JNK), JNK, p-p65 a p65 boli zakúpené od Santa Cruz Biotechnology ( Santa Cruz, USA). Súprava osteokalcínu ELISA bola zakúpená od Biosource Technology (Nivelles, Belgicko). C-koncové telopeptidy súpravy kolagénu typu I ELISA sa získali od Cross Laps (Herlev, Dánsko). Dominantne-negatívny mutant p38 poskytol Dr. J. Han (South-Western Medical Center, Dallas, USA). JNK dominantne-negatívny mutant poskytol Dr. M. Karin (University of California, San Diego, USA). Dominantne-negatívny mutant ERK2 poskytol Dr. M. Cobb (South-Western Medical Center). Všetky ostatné činidlá boli získané od Sigma-Aldrich (St Louis, USA).
Bunková kultúra
Myšia osteoblastová bunková línia MC3T3-E1 bola zakúpená od American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, USA). Bunky sa kultivovali v 95 percentách vzduchu, 5 percentách CO2 s a-MEM, ktorý bol doplnený 20 mm HEPES a 10 percentami tepelne inaktivovaného fetálneho teľacieho séra, 2 mm glutamínu, penicilínu (100 U/ml) a streptomycínu (100 mg /ml).
Meranie tvorby mineralizovaných uzlín
Tvorba mineralizovaných uzlín bola hodnotená podľa popisu.[18] Stručne povedané, osteoblasty sa kultivovali v médiu obsahujúcom vitamín C (50 mg/ml) a b-glycerofosfát (10 mm) počas dvoch týždňov a médium sa menilo každé tri dni. Po inkubácii s CD extraktom počas 12 dní sa bunky dvakrát premyli 20 mm Tris-pufrovaným fyziologickým roztokom obsahujúcim
0,15 m NaCl (pH 7,4), fixovaný v ľadovo studenom 75 % (v/v) etanole počas 30 minút a sušený na vzduchu. Depozícia vápnika bola stanovená pomocou farbenia alizarínovou červenou-S. V stručnosti, etanolom fixované bunky a matrica sa farbili počas 1 hodiny s 40 mm alizarínovou červeňou-S (pH 4,2) a dôkladne sa opláchli vodou. Naviazané farbivo sa eluovalo 10 % (hmotn./obj.) cetylpyridíniumchloridom a alizarínová červeň-S vo vzorkách sa kvantifikovala meraním absorbancie pri 550 nm a porovnávala sa so štandardnou krivkou. Jeden mól alizarínovej červene-S selektívne viaže približne dva móly vápnika.
Kvantitatívna polymerázová reťazová reakcia v reálnom čase
Celková RNA bola extrahovaná z osteoblastov pomocou súpravy TRIzol (MDBio Inc., Taipei, Taiwan). Reverzná transkripcia sa uskutočnila s použitím 2 mg celkovej RNA a oligo(dT) priméru.[19,20] Kvantitatívna polymerázová reťazová reakcia v reálnom čase (qPCR) sa uskutočnila s použitím TaqMan® one-step PCR Master Mix (Applied Biosystems, Carlsbad, USA). Pridala sa celková cDNA (100 ng na 25-ml reakcie) so sekvenčne špecifickými primérmi a sondami Taqman®. Všetky priméry a sondy cieľového génu boli zakúpené komerčne, vrátane b-aktínu ako vnútornej kontroly (Applied Biosystems). qPCR testy sa uskutočňovali trojmo na sekvenčnom detekčnom systéme StepOnePlus (Applied Biosystems). Podmienky cyklovania boli 10-minútová aktivácia polymerázy pri 95 stupňoch, po ktorých nasledovalo 40 cyklov 95 stupňov počas 15 s a 60 stupňov počas 60 s. Prah bol nastavený nad netemplátovým kontrolným pozadím a v rámci lineárnej fázy amplifikácie cieľového génu, aby sa vypočítal počet cyklov, pri ktorých bol detegovaný transkript (označené CT).
Western blot analýza
Bunkové lyzáty sa pripravili tak, ako bolo opísané vyššie.[21,22] Proteíny sa rozdelili pomocou SDS-PAGE a preniesli na polyvinyldifluoridové membrány Immobilon (Millipore, Billerica, USA). Bloty sa blokovali 4 percentným hovädzím sérovým albumínom počas 1 hodiny pri teplote miestnosti a potom sa sondovali králičími anti-ľudskými protilátkami proti p-65 alebo p-p65 (1:1000) počas 1 hodiny pri teplote miestnosti. Po troch premytiach sa bloty inkubovali s peroxidázou konjugovanou osliou anti-králičou sekundárnou protilátkou (1:1000) počas 1 hodiny pri teplote miestnosti. Bloty sa vizualizovali zvýšenou chemiluminiscenciou s použitím filmu X-OMAT LS (Eastman Kodak, Rochester, USA).
Osteoporóza vyvolaná ovariektómiou
Na túto štúdiu sa použili samice myší ICR, štyri týždne staré, 22 až 28 g. Myšiam sa ovariektomizovali bilaterálne v anestézii trichlóracetaldehydom (100 mg/kg) a kontrolným myšiam sa na porovnanie vykonala falošná operácia (Sham). Minerálna hustota kostí a obsah kostných minerálov sa merali po perorálnom podávaní rôznych koncentrácií CD extraktov každé dva dni počas štyroch týždňov. Celková hustota minerálov v tele a obsah minerálov v kostiach sa stanovili pomocou röntgenového absorbiometra s dvojitou energiou (DEXA; XR-26; Norland, Fort Atkinson, USA) s použitím režimu pre malé subjekty, ako bolo opísané vyššie.[18, 23] Všetky protokoly boli v súlade s inštitucionálnymi smernicami a boli schválené Výborom pre starostlivosť o zvieratá Čínskej lekárskej univerzity.
Štatistická analýza
Štatistická analýza bola vykonaná pomocou softvéru Prism 4.{6}}1. (GraphPad Software Inc., San Diego, USA). Uvedené hodnoty sú priemer ± SEM. Štatistická analýza medzi dvoma vzorkami sa uskutočnila pomocou Studentovho t-testu. Štatistické porovnania viac ako dvoch skupín sa uskutočnili pomocou jednosmernej analýzy rozptylu s Bonfer-Roniho posthoc testom. Vo všetkých prípadoch sa P < 0,05="" považovalo="" za="">
Extrakt z Cistanche deserticola
Výsledky
Extrakt z Cistanche deserticola zvyšuje mineralizáciu kostí osteoblastmi
Pridanie CD extraktu na 24 alebo 48 hodín neovplyvnilo proliferáciu myších osteoblastových buniek MC3T3-E1 v teste MTT (údaje nie sú uvedené). Pretože diferenciácia osteoblastov je komplexný proces zahŕňajúci bunkovú proliferáciu a migráciu, testovali sme aj migračnú schopnosť buniek MC3T3-E1 po ošetrení CD extraktom. Pomocou Transwell a testov hojenia rán sme zistili, že CD extrakt neovplyvnil migráciu osteoblastov (údaje nie sú uvedené). Tvorba mineralizovaných uzlín je jedným z markerov dozrievania osteoblastov. Farbenie alizarínovou červenou S ukázalo, že mineralizované uzliny sa vytvorili, keď sa osteoblasty kultivovali počas dvoch týždňov v médiu obsahujúcom vitamín C (50 mg/ml) a b-glycerofosfát (10 mm), a to sa zvýšilo v závislosti od koncentrácie pridaním CD (obrázok 1a). Preto CD extrakt indukoval tvorbu kostných uzlín kultivovanými osteoblastmi, ale nie ich proliferáciu alebo migráciu. Tiež sme skúmali úlohu CD extraktu v RANKL-indukovanej osteoklastogenéze, ale nezistili sme žiadny účinok (údaje nie sú uvedené).
Extrakt z Cistanche deserticola zvyšuje expresiu alkalickej fosfatázy, kostného morfogenetického proteínu-2 a osteopontínu v kultivovaných osteoblastoch
Diferencované osteoblasty vykazujú zvýšenú aktivitu ALP, ktorá koreluje s vysokými hladinami expresie enzýmov.[18] Zistili sme, že liečba CD extraktom počas 72 hodín významne zvýšila aktivitu ALP osteoblastov (obrázok 1b). Vzhľadom na kľúčovú úlohu BMP-2, ALP a OPN pri diferenciácii osteoblastov sme testovali, či extrakt CD uplatňuje svoj účinok na diferenciáciu osteoblastov reguláciou expresie BMP-2, ALP a OPN. Ošetrenie buniek extraktom CD zvýšilo expresiu mRNA ALP, BMP-2 a OPN spôsobom závislým od koncentrácie (obrázok 1c), čo dokazuje, že extrakt CD indukoval diferenciáciu osteoblastov zvýšením regulácie ALP, BMP-2 a výraz OPN.
Extrakt z Cistanche deserticola zvyšuje tvorbu kostných uzlín prostredníctvom mitogénom aktivovanej proteínkinázovej dráhy
Uvádza sa, že MAPK hrá dôležitú úlohu pri tvorbe kostí [24, 25], takže sme ďalej skúmali, či sa táto signálna dráha podieľa na mineralizácii kostí indukovanej CD extraktom. Predbežné ošetrenie buniek inhibítorom ERK U0126, inhibítorom p38 SB203580 alebo inhibítorom JNK SP600125 znížilo mineralizáciu kostí zvýšenú CD extraktom (obrázky 2a, 3a a 4a). Okrem toho inhibítory tiež blokovali expresiu ALP, BMP-2 a OPN indukovanú CD extraktom (obrázky 2b–4c). Transfekcia buniek s ERK2, p38 alebo mutantom JNK znížila zvýšenie CD extraktu v expresii ALP, BMP-2 a OPN mRNA (obrázky 2c, 3c a 4c). Ďalej sme priamo skúmali aktiváciu ERK, p38 a JNK po ošetrení extraktom CD. Inkubácia buniek s CD extraktom indukovala fosforyláciu ERK, p38 a JNK (obrázky 2d, 3d a 4d). Preto ERK, p38 a JNK sprostredkovávajú zvýšenú tvorbu kostí indukovanú liečbou osteoblastov CD.
Extrakt z Cistanche deserticola zvyšuje tvorbu kostných uzlín prostredníctvom dráhy jadrového faktora-kB
Ako už bolo spomenuté, aktivácia NF-kB je nevyhnutná pre tvorbu kostí.[26,27] Ďalej sme ošetrili osteoblasty inhibítormi NF-kB pyrolidínditiokarbamátom (PDTC) a N-tozyl-L-fenylalanín chlórmetylketónom (TPCK) Calbiochem (Darmstadt, Nemecko), aby sa zistilo, či sa aktivácia NF-kB podieľa na mineralizácii kostí indukovanej CD extraktom. Obrázok 5a ukazuje, že predbežné ošetrenie osteoblastov PDTC alebo TPCK inhibovalo tvorbu kostných uzlín indukovanú CD extraktom a tiež znížilo zvýšenie expresie ALP, BMP{11}} a OPN (obrázok 5b a 5c). Fosforylácia podjednotky NF-kB p65 je indikátorom aktivácie NF-kB; [28] v súlade s tým sme zistili, že extrakt CD zvýšil fosforyláciu p65 v osteoblastoch (obrázok 5d). Tieto výsledky ukázali, že aktivácia NF-kB je dôležitá pre expresiu ALP, BMP-2 a OPN a tvorbu kostných uzlín indukovanú CD extraktom.
Inhibícia úbytku kostnej hmoty extraktom Cistanche deserticola u ovariektomizovaných myší
Aby sa preskúmal účinok CD extraktu na stratu kostnej hmoty, osteoporóza bola indukovaná u samíc myší ovariektómiou. Ako sa očakávalo, ovariektomizované myši vykazovali zníženú celkovú telesnú hustotu kostných minerálov a obsah kostných minerálov (obrázok 6a a 6b). Liečba CD extraktom počas štyroch týždňov inhibovala stratu kostnej minerálnej hustoty a obsahu kostných minerálov spôsobom závislým od dávky (obrázok 6a a 6b). Krvné koncentrácie ALP môžu odrážať osteoblastickú aktivitu.[29] Ako je znázornené na obrázku 6c, CD extrakt inhiboval zníženie aktivity ALP v sére vyvolané ovariektómiou. Okrem toho CD extrakt tiež zvýšil hladinu osteokalcínu, markera tvorby kostí, a znížil hladinu C-terminálnych telopeptidov kolagénu typu I, markera kostnej resorpcie (obrázok 6d a 6e). Tieto zistenia teda podporujú potenciu a účinnosť CD extraktu pri prevencii straty kostnej hmoty in vivo.
Diskusia
Cistanche deserticolaMa, pôvodná bylina v Číne, je široko používaná v tradičnej medicíne na rôzne terapeutické liečby kvôli jej sedatívnym, analgetickým a imunostimulačným aktivitám.[11–15] Tu sme ukázali, že CD extrakt indukoval mineralizáciu kostí v kultivovaných osteoblastoch, ale áno. neovplyvňujú ich bunkovú migráciu alebo proliferáciu. Okrem toho sme zistili, že ALP, BMP-2 a OPN sú cieľové proteíny signalizácie indukovanej CD extraktom, ktorá vyžaduje aktiváciu ERK, p38, JNK a NF-kB.
Kosť je komplexné tkanivo zložené z niekoľkých typov buniek, ktoré neustále prechádzajú procesom obnovy a opravy.[30] Keď sú resorpcia a tvorba kosti nevyvážené, rozpad kostí prevažuje nad tvorbou kostí a výsledkom je osteoporóza.[30] Použili sme ovariektomizované myši na skúmanie antiosteoporotického účinku CD extraktu. Myši po ovariektómii mali zníženú celkovú telesnú kostnú minerálnu hustotu a obsah kostných minerálov, čo bolo zmiernené liečbou CD extraktom. CD extrakt tiež zvýšil sérové hladiny osteogénneho markera ALP a osteokalcínu. Preto je CD činidlo na tvorbu kostí, ktoré zabraňuje strate kostnej hmoty spôsobenej ovariektómiou in vivo.
Hoci mechanizmy osteoporózy nie sú úplne jasné, pravdepodobne súvisia so zníženou dostupnosťou alebo zníženými účinkami faktorov rastu kostí, ako sú ALP, BMP{0}} a OPN. Tieto tri faktory hrajú dôležitú úlohu v procese tvorby a prestavby kostí[31] a je dobre zdokumentované, že stimulácia diferenciácie buniek osteoblastov je charakterizovaná najmä zvýšenou expresiou ALP, BMP-2 a OPN.[32] ] V tejto štúdii sme zistili, že extrakt CD zvýšil expresiu ALP, BMP-2 a OPN a zvýšil mineralizáciu kostí. Preto CD extrakt čiastočne sprostredkováva tvorbu kostí upreguláciou expresie ALP, BMP-2 a OPN.
Uvádza sa, že p38 sa podieľa na regulácii expresie ALP počas diferenciácie osteoblastických buniek;[33] podobne ERK1/2 je dôležitý pre proliferáciu a diferenciáciu osteoblastov.[34,35] JNK sa podieľa na tvorbe osteoklastov. .[36] Ukázali sme tu, že CD extraktom indukovaná fosforylácia ERK, p38 a JNK a inhibítory týchto enzýmov antagonizujú potenciáciu kostnej mineralizácie sprostredkovanú CD extraktom, čo naznačuje, že aktivácia ERK, p38 a JNK hrá povinnú úlohu pri tvorbe kostí indukovanej CD extraktom. osteoblasty. Okrem toho enzýmové inhibítory a dominantne negatívne mutanty ERK, p38 a JNK znížili expresiu ALP, BMP-2 a OPN zosilnenú CD extraktom. Tieto údaje naznačujú, že aktivácia dráh ERK, p38 a JNK je potrebná na zvýšenie expresie a dozrievania ALP, BMP-2 a OPN spôsobeného CD extraktom v osteoblastoch. Uvádza sa, že ERK zvyšuje proliferáciu a diferenciáciu osteoblastov.[34,35] Nezistili sme však vplyv CD extraktu na proliferáciu osteoblastov. Preto iné dráhy mohli pôsobiť proti účinku ERK po stimulácii CD extraktom alebo byť nevyhnutné na proliferáciu. V tomto ohľade sme zistili, že inhibítory PI3K a Akt tiež znižujú mineralizáciu kostí indukovanú CD extraktom a expresiu mRNA ALP, BMP-2 alebo OPN (údaje nie sú uvedené). Preto môžu byť tieto dráhy potrebné na tvorbu kostí indukovanú CD extraktom.
Ukázalo sa, že NF-kB riadi funkciu osteoblastov v kostiach.[37] Výsledky tejto štúdie ukazujú, že aktivácia NF-kB prispieva k mineralizácii kostí indukovanej CD extraktom a expresii ALP, BMP-2 a OPN v kultivovaných osteoblastoch a že inhibítory signálnej dráhy závislej od NF-kB (PDTC a TPCK ) inhibovala mineralizáciu kostí indukovanú CD extraktom a expresiu ALP, BMP-2 a OPN. p65 je fosforylovaný na Ser536 rôznymi kinázami v niekoľkých signálnych dráhach, čo zvyšuje potenciál transaktivácie p65.[38] Výsledky tejto štúdie ukázali, že CD extrakt zvýšil fosforyláciu p65. Celkovo tieto výsledky naznačujú, že aktivácia NF-kB je potrebná na tvorbu kostí indukovanú CD extraktom v kultivovaných osteoblastoch. Tiež sme zistili, že inhibítory ERK, p38 a JNK zvrátili aktivitu NF-kB luciferázy indukovanú CD extraktom (údaje nie sú uvedené), čo je v súlade s tým, že tieto enzýmy sú upstream mediátormi aktivácie NF-kB indukovanej CD extraktom. Preto CD extrakt indukuje tvorbu kostí prostredníctvom dráh ERK/p38/JNK/ a NF-kB.
Závery
Táto štúdia preukázala, že CD extrakt indukuje diferenciáciu a dozrievanie osteoblastov, ale nie proliferáciu alebo migráciu. CD extrakt tiež zvýšil expresiu ALP, BMP{0}} a OPN a mineralizáciu kostí. Ukázali sme, že dráhy ERK, p38, JNK a NF-kB sa podieľajú na tvorbe kostí sprostredkovanej CD extraktom a expresii ALP, BMP-2 a OPN. Okrem toho extrakt CD zabránil strate kostnej hmoty in vivo vyvolanej ovariektómiou. Preto môže byť CD prospešné pri stimulácii tvorby kostí pri liečbe osteoporotických ochorení.
