Časť 2: Kalpastatín zabraňuje poraneniu podocytov sprostredkovanému angiotenzínom II prostredníctvom udržiavania autofágie

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Pls kliknite sem pre časť 1

Pls kliknite sem pre časť 3

Angel plus HSD aktivuje aktivitu calpainu v podocytoch, čo prispieva k blokáde autofágie

Keďže sa zistilo, že aktivita calpainu (i) je aktivovaná Angelom v niekoľkých typoch buniek a (ii) štiepi niekoľko proteínov súvisiacich s autofágiou, zaujímalo nás, či možno blokádu autofágie sprostredkovanú AngII plus HSD pripísať zvýšenej aktivite calpainu indukovanej Angl. Najprv sme zistili, že primárne podocyty exprimovali 3 všadeprítomné formy calpaínov (obrázok 3a). Potom sme ukázali, že AngII stimuloval aktivitu calpainu v primárnych podocytoch. Toto zvýšenie aktivity calpainu bolo blokované selektívnym inhibítorom calpainu (obrázok 3b). Použili sme knock-in myš s ďalšou expresiou transgénu calpastatínu (čo vedie k zníženiu aktivity calpaínu) na posúdenie úlohy calpaínov v sprostredkovaných AngII plus HSDobličkyzraneniea autofágová blokáda. Primárne podocyty z CST'g myší vykazovali zníženú aktivitu calpainu v reakcii na AngII v porovnaní s podocytmi z kontrolných myší (obrázok 3c). Nadmerná expresia kalpastatínu v podocytoch teda znížila aktiváciu kalpaínu sprostredkovanú AngII.

Cistanchetubulosamá veľaúčinky, kliknite sem a dozviete sa viac

Ďalej sme hodnotili hladiny autofágie v podocytoch z myší CSTTg. Vytvorili sme CST myši s GFP-LC3 transgénom. Reportér LC3-GFP umožnil počítanie autofagozómov ako GFP plus /P62 plus bodky. P62 sa bude akumulovať v agregátoch v bunkách, keď je autofagický tok blokovaný. V bazálnom stave sme spočítali menej GFP plus P62 plus bodky (obrázok 4a, b a e) a menej akumulácie P62 (obrázok 4c, d a f) v podocytoch myší CST1g GFP-LC3 ako v podocytoch normálnych

Obrázok 4|Vyhodnotenie autofagického toku v podocytoch kalpastatínových transgénnych (CST9) myší. (a,b) Reprezentatívne imunofluorescenčné snímky expresie zeleného fluorescenčného proteínu (GFP) (zelený) a P62 (červený) v glomeruloch od 12-týždňových myší GFP-LC3 a CST'GFP-LC3. Šípky označujú GFP plus P62 plus autofagozómy. (c, d) Reprezentatívne imunofluorescenčné snímky expresie P62 (zelená) a Podokalyxínu (PODXL; červená) v glomeruloch od 12-týždňových myší GFP-LC3 a CST'9 GFP-LC3. Časti obrázku s prvočíslom označujú väčšie zväčšenie. Jadrá boli zafarbené s Hoechst （modrá）. Bary=50 μm. （e） Kvantifikácia počtu LC3 plus P62 plus bodiek na podocyt. Mann-Whitney test:**P=0.0065. f) Kvantifikácia P62 plus plocha na glomerulárnu sekciu. Mann-Whitney test:*P= 0.0420.In(e,f), n =5 myší GFP-LC3 a n =8 myší CST'9 GFP-LC3. Hodnoty sú uvedené ako jednotlivé grafy a priemer ± SEM. Ak chcete optimalizovať prezeranie tohto obrázka, pozrite si online verziu tohto článku na myšiach GFP-LC3, čo naznačuje zvýšený autofagický tok v podocytoch myší s vysokým výskytom kalpastatínu.

Autofagický tok možno monitorovať meraním konverzie cytoplazmatickej formy LC3, LC3-I, na autofagozomálne štiepenú a fosfatidyletanolamínom spojenú formu LC3, LC3-II, na Western blote . Podocyty z myší CST vykazovali zvýšenú konverziu LC3-I na LC{6}}II a zníženú expresiu P62, a to v prítomnosti aj v neprítomnosti bafilomycínu A (obrázok 5a a b), čo naznačuje zvýšený autofagický tok v podocytoch s nadmernou expresiou kalpastatínu. Nakoniec, akumulácia GFP plus P62 plus bodiek v podocytoch po podaní chlorochínu bola dôležitejšia u myší CST'g GFP-LC3 ako u myší GFP-LC3, čím sa potvrdilo, že nadmerná expresia kalpastatínu indukuje autofagický tok v podocytoch in vivo (obrázok 5c -e). Celkovo naše údaje naznačujú, že AngII stimuluje aktivitu calpainu v podocytoch, že autofágia je inhibovaná calpainom v podocytoch a že inhibícia endogénnej aktivity calpainu nadmernou expresiou calpastatínu je dostatočná na stimuláciu autofagického toku v podocytoch.

Myši CSTT9 sú chránené pred poškodením podocytov vyvolaným Angel plus HSD

CSTT: myši nevykazovali žiadneobličkyzmena do veku najmenej 12 mesiacov (doplnkový obrázok S5). Analyzovali sme poškodenie podocytov u myší CST'号 počas liečby AngII plus HSD. Aj keď sa u myší WT vyvinula mierna glomeruloskleróza a poškodenie podocytov po 4 týždňoch hypertenzie, čo dokazuje abnormálna expresia podokalyxínu a nefrínu, myši CSTTg vykazovali menej sklerotických glomerulárnych lézií (obrázok 6a

Obrázok 5|Blokovanie autofagozomálnej degradácie potvrdilo zvýšený autofagický tok podocytov u kalpastatínových transgénnych (CSTT) myší. (a) Western blot analýza expresie LC3. Sekvestozóm 1 (SOSTM1)/P62 a ATG5 v primárnych podocytoch z myší divokého typu (W alebo CST'9. Expresia tubulínu slúži ako normalizácia. Podocyty boli alebo neboli ošetrené bafilomycínom A1 (BafA1; 100 nM) počas 4 hodín pred kultiváciou zatknutie. (b) Kvantifikácia pomerov LC3-ll/'tubulín a P62/tubulín.n=10 myší WT a n =8 myší CST'9. Hodnoty sú prezentované ako jednotlivé grafy a priemer ± SEM. Obojsmerná analýza rozptylu spárovaného na liečbu: pre LC3-}ll/tubulín: genotyp, P= 0.0008;liečba, P<0.0001; for="" p62/tubulin:="" genotype,="" p="0.0884;" treatment,="">< 0.0001.sidak's="" multiple="" comparison="" test:="" for=""><0.0001 for="" wt-bafa1="" versus="" wt+=""><0.0001 for="" cst'9-bafa1="" versus="" cst'9+bafa1,"*p="0.0028" for="" wt+bafa1="" versus="" cstt9="" +bafa1:for=""><0.0001 for="" wt-bafa1="" versus=""><0.0001 for="" cst'9-bafa1="" versus="" cst'9+="" bafa1.(c,d)representative="" immunofluorescence="" images="" of="" the="" expression="" of="" green="" fluorescent="" protein="" (gfp;="" green)="" and="" p62="" (red)="" in="" glomeruli="" from="" 12-week-old="" gfp-lc3="" and="" cst'9="" gfp-lc3="" mice.="" figure="" subparts="" with="" prime="" indicate="" higher="" magnification.="" nuclei="" were="" stained="" with="" hoechst="" （blue）.="" bars="50" μm.="" mice="" were="" treated="" with="" chloroquine（cq;="" 80="" mg/kg）="" 4="" hours="" before="" killing.="" the="" arrowheads="" indicate="" gfp+="" p62+autophagosomes.="" (e)="" quantification="" of="" the="" number="" of="" lc3+="" p62+="" dots="" per="" podocyte.="" n="5" mice="" per="" genotype.="" values="" are="" presented="" as="" individual="" plots="" and="" mean="" ±="" sem.="" unpaired="" t-test="" with="" equal="" sd:*p="0.0302." to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">obličky-international.org.

Obrázok 6| Nadmerná expresia kalpastatínu zabraňuje poškodeniu podocytov sprostredkovanému angiotenzínom II (Angel) plus diétou s vysokým obsahom soli (HSD). (a,b)

Cistanchemôže uľaviťochorenie obličiek

Reprezentatívne obrázky Massonových trichrómom zafarbených rezov glomerulov z myší divokého typu (WT a calpastatin transgenic (CST'9) myši po 6 týždňoch Angll plus HSD.Bars=50 um.(c,d,f,g) Reprezentatívne imunofluorescenčné snímky expresie (c,d) podokalyxínu (PODXL) a (f,g)nefrínu (NPHS1) u myší WT a CST'9 po 6 týždňoch liečby Angel plus HSD a súvisiace kvantifikácie (e,h). {8}} um. (ii)

cistanchemôže liečiťakútne zlyhanie obličiek

Reprezentatívne imunofluorescenčné snímky expresie Wilmovho nádoru 1 (WT1; zelená) a PODXL (červená) v glomeruloch od myší WT a CST' po 6 týždňoch liečby Angel plus HSD a (k) súvisiacej kvantifikácie počtu buniek WT1 plus na glomerulár oddiele. Jadrá boli zafarbené Hoechst (modrá). Bary =50 um. V (e,h,k) sú hodnoty prezentované ako jednotlivé grafy a priemer ± SEM, n =9 WT myší a n =7 CSTTg myší. Nepárový t-test s rovnakou SD:**P =0,0095 in (e),*P=0,0249 in (h), P=0,7891 in (k).

a b) a zachovaná expresia podokalyxínu a nefrínu (obrázok 6c-h). Takéto rozdiely vo fenotype podocytov boli pozorované v štádiu, keď sa hustota jadier podocytov nelíšila medzi WT a hypertenznými CST'g myšami (obrázok 6i-k).

Podobne po 6 týždňoch hypertenzie myši GFP-LC3 a CST'1 GFP-LC3 vykazovali poškodenie podocytov, ale lézie boli výraznejšie u myší GFP-LC3 (obrázok 7). Pomer albumínu a kreatinínu v moči bol vyšší u myší GFP-LC3 po 4 týždňoch AngLI plus HSD (obrázok 7a). Počet podocytov sa medzi týmito 2 genotypmi nelíšil, ale expresia nefrínu bola výrazne znížená u myší GFP-LC3 (kontrola) (obrázok 7b-e). V korelácii s ochranou sprostredkovanou calpastatínom ultraštrukturálna analýza ukázala mierne a fokálne vymazanie výbežku podocytov u myší GFP-LC3 liečených Angl plus HSD s lepším zachovaním vymazania výbežku chodidiel u myší CST'g, hoci globálna kvantifikácia počtu procesy chodidiel na dĺžku glomerulárnej bazálnej membrány (GBM) neboli štatisticky odlišné, s najväčšou pravdepodobnosťou preto, že poškodenie podocytov je v našom modeli fokálne a segmentové (obrázok 7f-h). Za zmienku stojí makrofágy a infiltrácia T-lymfocytov vobličkysa medzi skupinami nelíšili (doplnkový obrázok S6). Celkovo tieto výsledky ukázali, že kalpastatín zabránil AngII plus HSD-indukovanému poškodeniu podocytov.

Nadmerná expresia kalpastatínu obnovuje autofagický tok v podocytoch z myší po liečbe Angel plus HSD

Nakoniec nás zaujímalo, či glomerulárna ochrana sprostredkovaná calpastatínom v modeli AngII plus HSD implikuje autofágiu v podocytoch. Je zaujímavé, že akumulácii P62 v podocytoch indukovanej AngLI plus HSD sa zabránilo u myší CSTTg a GFP-LC3 CST'g (obrázok 8a-d), čo naznačuje, že kalpastatín zabránil blokáde autofágie podocytov. Je potrebné poznamenať, že počet GFP plus P62 plus bodky značenia autofagozómov bol podobný v podocytoch z hypertenzných myší GFP-LC3 a GFP-LC3 CST, čo naznačuje, že AngLI plus HSD vyvolali skôr spomalenie autofagického toku podocytov než úplné zastavenie. (Obrázok 8e-g).

In silico predikcia calpainového štiepneho miesta v podocytových proteínoch

Použili sme niekoľko nástrojov in silico na predpovedanie potenciálnych cieľov calpainu v podocytoch (doplnkové tabuľky S1 a S2). Porovnávali sa tri online databázy: GPS-CCD, 4CaMPDB, 5 a DeepCalpain. stupňa In silico analýza identifikovala niekoľko podocytových proteínov, medzi nimi nefrín a podocín, ktoré by mohli byť štiepené kalpaínmi. Takže glomerulárna ochrana sprostredkovaná calpastatínom by mohla byť spojená so znížením enzymatickej aktivity calpainu, čo by viedlo k zníženej degradácii niektorých proteínov podocytov.

Okrem toho sú aspoň 3 proteíny súvisiace s autofágiou priamymi cieľmi calpaínov. ATG5 je štiepený calpainmi, čo vedie k poruche tvorby komplexu ATG12-ATG5.57 Podávanie inhibítorov calpainu in vivo tiež zabránilo štiepeniu autofagického proteínu Beclin-1.5"In silico analýza predpokladané miesto štiepenia na proteínoch súvisiacich s autofágiou podporuje hypotézu, že calpain by mohol regulovať autofágiu prostredníctvom enzymatického štiepenia autofágových proteínov.

Expresia mRNA endoplazmatického retikula (ER) a markerov oxidačného stresu v glomerulách z myší liečených Angll plus HSD

Hodnotili sme stres endoplazmatického retikula (ER) a oxidačný stres pomocou kvantitatívnej PCR v glomeruloch počas liečby AngII plus HSD (tabuľka 1). Na začiatku sme nepozorovali žiadnu zmenu v expresii mRNA analyzovaných génov u myší glomeruli5loxlox (doplnok z WT a Nphs2.cre Atg5 obrázok S7). Po 6 týždňoch hypertenzie sa glomeruly z Nphs2. Myši cre Atg5loxlox vykazovali rôzne profily mRNA génov ER stresu a dráh oxidačného stresu so zvýšenou expresiou Sod1, Prdxl, Atf4, Gpxl a Hsp90b1 v porovnaní s WT glomerulami, čo naznačuje, že autofágová deplécia v podocytoch uprednostňovala AngII plus HSD-indukované ER stres a oxidačný stres. Naopak, glomeruly z CST myší vykazovali downreguláciu niekoľkých génov ER stresu a dráh oxidačného stresu, ako aj zníženú expresiu niektorých proapoptotických génov (obrázok 9).

Celkovo tieto výsledky naznačujú, že nadmerná expresia kalpastatínu by mohla zabrániť glomerulárnemu poškodeniu znížením AngII plus HSD-indukovaného ER a oxidačného stresu.

DISKUSIA

V tejto štúdii sme demonštrovali, že pri hypertenzii indukovanej AngII plus HSD je autofágia podocytov výrazne znížená. Okrem toho myši s deléciou Atg5 špecifickou pre podocyty boli náchylnejšie na glomerulosklerózu indukovanú Angl plus HSD a stratu podocytov, čo ukazuje, že autofágia v podocytoch zabraňuje rozvoju hypertenznej nefropatie, čo zdôrazňuje kritickú úlohu autofágie v podocytoch indukovaných Angl plus HSD zranenie. O extracelulárnych stimuloch, ktoré regulujú bunkovú autofágiu, je známe len málo a tieto výsledky vrhajú svetlo na patofyziologickú reguláciu autofágie podocytov pomocou AngII.

Pri väčšine ľudských glomerulopatií je vymazanie výbežku podocytov na nohách charakteristickým znakom glomerulárneho poškodenia vedúceho k proteinúrii. Autofágia bude pravdepodobne hrať zásadnú úlohu pri udržiavaní funkcie podocytov, pretože tieto terminálne diferencované bunky vykazujú vysokú mieru autofágie aj v neprítomnosti stresu. Predchádzajúca štúdia ukázala, že Angi podporuje autofágiu prostredníctvom vytvárania reaktívnych foriem kyslíka v podmienene imortalizovanej bunkovej línii myších podocytov.5 Produkcia reaktívnych foriem kyslíka je skutočne všeobecným induktorom autofágie v mnohých typoch buniek a dôvody takéhoto nesúladu s našimi zistenia sú nejasné. Na rozdiel od tejto poslednej štúdie sme použili myšacie primárne kultivované podocyty, ktoré si zachovali expresiu podocínu a nefrínu a in vivo prístupy, a nie myšacie bunkové línie. Potvrdzujeme predchádzajúce správy, že postmitotické podocyty vykazujú nezvyčajne vysokú úroveň konštitutívnej autofágie. Meranie zvýšeného množstva LC3-II po stimulácii AngII v prítomnosti alebo neprítomnosti lyzozomálnych inhibítorov je potrebné na stanovenie

či je autofagický tok zvýšený alebo blokovaný. Predchádzajúce štúdie tento jav zanedbávali.

Tu sme použili hypertenzný model založený na perfúzii AngLI a HSD. Podocyty vykazujú ATI receptory a sú vystavené voľným filtrovaným peptidom, ako je AngII1,6,26,61-6 Predpokladá sa, že pozorované renoprotektívne účinky inhibície RAAS by mohli byť – aspoň čiastočne – spôsobené blokádou tohto podocytu -špecifické RAAS. Podobne aj štúdie in vivo

Cistanchemôže uľaviťochorenie obličiek