Časť 2: Karbamylovaný sortilín spojený s kardiovaskulárnou kalcifikáciou u pacientov s chronickými obličkovými diseami

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

KliknúťtuPre časť 2.

Carbamylated sortilin mení väzbu ligandu

Sortilín je coreceptor pre niekoľko ligandov.8 Karbamylácia lyzínu významne mení vlastnosti lyzínového sidechaínu, pričom kladne nabitá aminokyselinová skupina je nahradená objemnou polárnou skupinou, ktorá potenciálne ovplyvňuje väzbu ligandu. Skúmali sme interakcie najčastejšie modifikovaných druhovilínových lyzínových sidechainov, ktoré sa nachádzajú vchronický obličkachoroba(aminokyselinová sekvencia [sekvencia kryštálovej štruktúry]), Lys95(62), Lys205(172), Lys260(227) a Lys294(261) in silickým modelovaním na predpovedanie možných účinkov karbamylácie lyzínu na štruktúru a funkciu. Použili sme existujúcu štruktúru kryštálových kryštálov sortilínového ektodomínu z oboch neurotenzínom viazanej formy pri neutrálnom pH (súbor PDB Q24: 4PO7; Obrázok 3a) a forma bez ligandu pri kyslom pH (súbor PDB: 6EHO; Doplnková tabuľka S5).

Pri neutrálnom pH tvorí Lys95(62) soľný most s Glu609(576) a vodíkovú väzbu s karbónovou skupinou Arg90 (57) s hlavným reťazcom. Pri kyslom pH je interakcia s Glu609(576) užšia, pretože vzdialenosť medzi aminokyselinovou skupinou Lys95(62) a karboxylovou skupinou Glu609(576) teraz umožňuje vytvorenie vodíkovej väzby, zatiaľ čo interakcia s Arg90(57) nie je prítomná. Preto karbamylácia v Lys95(62) môže destabilizovať obe triedilínové konformácie. Karbamylácia na Lys205 by teda mohla uprednostňovať kyslú konformáciu pH sortilínu. Lys294(261) nemá žiadne interakcie pri neutrálnom aj kyslom pH.

Účinky cistanchu: liečba ochorení obličiek

Nakoniec, pri neutrálnom pH, Lys260(227) interaguje s neurotenzínom-Tyr11 v mieste väzby ligandu v b-vrtuľovom tuneli sortilínu. Keďže kyslá štruktúra triedenia pH nemá ligandovú afinitu, v tejto štruktúre nenachádzame žiadne interakcie sidechainu Lys260(227). Interakcia s neurotensinTyr11 bude ovplyvnená karbamyláciou a môže viesť k nižšej afinite k neurotenzínu. Interleukín 6 (IL-6), známy triedilínový ligand,20 viaže triedilín cez chvost C-terminálu, ktorý obsahuje arginín v ekvivalentnej polohe neurotenzínu-Tyr11. Karbamylácia Lys260(227) by teda mohla pravdepodobne zvýšiť afinitu k IL-6, potenciálnemu prispievateľovi k vaskulárnej kalcifikácii.

Následné záväzné štúdie s použitím povrchovej spektroskopie rezonančnej spektroskopie a SortCo alebo SortCarb odhalili efektívnejšiu väzbu IL-6 na SortCarb (KD 1/4 23 nM) v porovnaní s Q25 s nemodifikovaným SortCo (KD 1/4 141 nM), čo naznačuje karbamylovaný triedilín ako potenciálneho partnera väzby IL-6 (obrázok 3b a c). Progranulin, ďalší známy triedilínový ligand,22 viazaný na SortCo, ale väzba na SortCarb sa nedala zistiť (doplnkový obrázok S7A a B). SortCo aj SortCarb sú viazané na proteín spojený s ľudským receptorom spojený s GST značkou,23 ale nie len na GST, podporujú štrukturálnu integritu triedilínu Q26 bez ohľadu na jeho stav karbamylácie a demonštrujú špecifickosť nášho experimentálneho nastavenia (doplňujúci obrázok S7C–F).

Ďalej sme posúdili, či zmenená afinita k IL-6 môže ovplyvniť signálne dráhy zapojené do vaskulárnej kalcifikácie. Pri kalcifikácii hSMC pridanie IL-6 do SortCarbu podporovalo výraz ALPL a RUNX2 mRNA (obrázok 3d a e), ako aj aktivitu TNAP (obrázok 3f), zatiaľ čo v kombinácii s SortCo nemalo žiadny účinok. Tieto údaje naznačujú, že karbamylácia sortilínu zvyšuje schopnosť väzby ligandu na IL-6, čo spôsobuje zvýšenú kalcifikáciu buniek hladkého svalstva.

Sortilín karbamylácia je spojená s vaskulárnou kalcifikáciou vchronickýobličkachorobapacienti Na základe našich údajov sa zistilo, že karbamylované zvyšky triedilínu sa spájajú schronickýobličkachorobaa kalcifikácia, ďalej sme študovalichronickýobličkachorobaúčastníci štúdie CARVIDA, v ktorých vypočítané tomografické skeny kvantifikovali CAC. Rovnako ako starostlivosť o účastníkov štúdie HOMe, väčšina účastníkov CARVIDA mala 2 a 3 PTM, pričom často boli postihnuté rezíduá lyzínu 95 a 260 (doplnkový obrázok S8A). V porovnaní s pacientmi bez karbamylovaných rezíduí boli pacienti s 1 druhovými karbamyl-lyzínovými zvyškami starší (P 1/4 0,002), mali nižší eGFR (P 1/4 0,008), častejšie (bývalí) fajčiari (P 1/4 0,023) a mali výrazne vyšší objem CAC (P 1/4 0,023).< 0.001;="" figure="" 4a="" and="" supplementary="" table="">

Ln-(CAC+1) na začiatku koreloval s prítomnosťou a zvýšením posttransklačne karbamylovaného sortilínu (doplnková tabuľka S7). Okrem toho bol Ln-(CAC þ 1) tiež spojený s mužským pohlavím, diabetes mellitus, antidiabetickými liekmi a liekmi znižujúcimi lipidy, vyšším vekom, sérom IL-6 a hemoglobínom A1c a nižším eGFR a sérovým lipoproteínom s vysokou hustotou (doplnková tabuľka S7). Napriek tomu súvislosť medzi karbamylovanými triediacimi zvyškami a východiskovou hodnotou Ln-(CAC þ 1) zostala významná po úprave pre všetky uvedené premenné (P 1/4 0,029; Tabuľka 3).

Účinky cistanchu: liečba ochorení obličiek

Ďalej sme posúdili, či prítomnosť karbamylovaných zvyškov má vplyv na progresiu CAC. Prítomnosť karbamylovaného sortilínu (vs. žiadna karbamylácia) zvýšila progresiu CAC (P 1/4 0,047). Podrobnechronickýobličkachorobapacienti s karbamylovaným sortilínom (n 1/4 33) vykazovali významne zvýšenú progresiu CAC počas mediánu času sledovania 4, 4 roka (obrázok 4b) s ročným nárastom mediánu objemu CAC o 30, 32 Q27 (medzikvartilový rozsah 1/4 84, 0) (obrázok 4C). Naopak,chronickýobličkachorobapacienti bez karbamylácie triedilínu (n 1/4 8) odhalili ročnú zmenu mediánu objemu CAC 1, 63 (medzikvartilový rozsah 1/4 8, 54) a žiadnu významnú progresiu CAC počas sledovaného obdobia (obrázok 4b a c). Po úprave na kovariáty spojené s progresiou CAC (základný objem CAC, vek, pohlavie, index telesnej hmotnosti, eGFR, diabetes mellitus, sérum IL-6, lipoproteín s vysokou hustotou s vysokou hustotou s vysokou hustotou a lieky na zníženie lipidov) už stav karbamylácie nebol spojený s progresiou CAC (P 1/4 0, 286).

Pacienti so zvyškami karbamyl-lyzínu 260 vykazovali najvyšší nárast objemu CAC ako pacienti bez karbamylovaných zvyškov alebo karbamyl-lyzínových zvyškov iných ako 260 (doplnkový obrázok S8B).

Celkovo údaje naznačujú, že posttranslačný karbamylovaný sortilín je spojený s objemom CAC a jeho progresiou u pacientov schronickýobličkachoroba.

DISKUSIA

V rôznych experimentálnych štúdiách in vitro a in vivo a 2 nezávislých prospektívnych kohortách demonštrujeme, že pacienti schronickýobličkachorobavykazujú špecifický vzor posttranslačných karbamylovaných zvyškov triedenia lyzínu v obehu, ktoré možno zistiť aj v cievnej stene. Okrem toho, sortilín karbamylácia bola spojená s CAC vchronickýobličkachorobapacienti, nezávislí od veku,obličkafunkcia a ďalšie rizikové faktory kalcifikácie. Mechanisticky by sme mohli ukázať, že karbamylácia sortilínu zvyšuje jeho schopnosť viazať IL-6 a pôsobí priamo na cievne bunky na podporu vaskulárnej kalcifikácie (obrázok 4d). Táto štúdia spolu odhalila nový netradičný rizikový faktor kalcifikácie, ktorý potenciálne prispieva k vysokému zaťaženiuKardiovaskulárnechoroby vchronickýobličkachoroba.

Karbamylácia bielkovín môže byť sprostredkovaná kyanátom, ktorý sa vyvíja počas spontánneho rozkladu močoviny alebo je generovaný oxidáciou tiokyanátu katalyzovanej myeloperoxidázou v miestach zápalu.24 Ukázali sme, žechronický obličkachorobapacienti s vyššou hladinou močoviny v dôsledku zníženej hladinyobličkafunkcia vykazovala viac zvyškov karbamylácie triedenia ako zdravé kontroly. Nenašli sme však žiadnu súvislosť medzi celkovými hladinami a aktivitou myeloperoxidázy a karbamylácie sortilínu, čo naznačuje, že uremia ako primárny hnací motor pre triedilín karbamyláciu vchronickýobličkachoroba. Okrem toho naše údaje ukazujú, že vek, NT-proBNP a nižší príjem antagonistov aldosterónu sú spojené s väčším množstvom karbamylovaných zvyškov. Naše údaje sú v súlade s predchádzajúcimi správami, ktoré identifikovali starnutie ako významného mediátora karbamylácie bielkovín.25 Ukázalo sa, že antihypertenzívne lieky hydrochlorothiazid a amlodipín ovplyvňujú hladiny homocitrulínu, aminokyselinu súvisiacu s močovinovým cyklom a produkt odvodený od karbamylácie.26 Či príjem antagonistov aldosterónu znižuje homocitrulín, a tým znižuje karbamylované rezíduá vchronickýobličkachorobaPacienti nie sú známi. Drechsler a spol. preukázali koreláciu medzi karbamylovaným albumínom séra a NTproBNP, ktorý bol spojený so srdcovým zlyhaním v závislosti od dialýzychronickýobličkachorobapacienti.27 Či karbamylácia sortilínu môže slúžiť aj ako rizikový faktor srdcového zlyhania, nie je známe, ale zvýšená koronárna kalcifikácia s potenciálne následnými škodlivými účinkami na funkciu srdca by mohla vysvetliť súvislosť medzi karbamylovanými rezíduami triedilínu a hladinami NTproBNP v našej štúdii.

Účinky doplnku cistanche: liečba ochorení obličiek a zlepšenie imunity

Nedávne štúdie identifikovali úlohu sortilínu v patogenéze cievnych a metabolických porúch, ale zamerali sa najmä na tkanivovú expresiu sortilínu, a nie na skúmanie funkcie rozpustnej formy.7 Cirkulujúci triedilín môže pochádzať z bunkového vylučovania ich luminálnej domény, ako sa preukázalo in vitro, 28 – 30, a z vylučovaných extracelulárnych vezikul nabitých sortilínom.9,31 Karbamylácia vedie k zmenám vo vedení, štrukturálne a funkčné vlastnosti proteínov, sprostredkúvajúce stratu funkcie a potenciálne patofyziologické bunkové a molekulárne reakcie.5 Po prvýkrát sme vytvorili špecifický karbamylačný vzor karbamylačného lyzínu rezíduajúceho cirkulujúceho sortilínu vchronickýobličkachoroba, s využitím cieleného prístupu MS a predpovedaných funkčných a štrukturálnych zmien modelovaním in silico. Navrhujeme, aby karbamylácia lyzínu uprednostňovala kyslú konformáciu pH sortilínu, ktorá ovplyvňuje ligand afinitu sortilínu závislú od pH. Predchádzajúce štúdie kryštálovej štruktúry preukázali, že pri pH 5,5, ktoré predstavuje prostredie podobné prostrediu neskorých endozómov, triedilín prechádza konformačnými zmenami a tvorbou dimérov, takže známe väzbové miesta nie sú k dispozícii pre väzbu ligandu.32,33

Lyzín 260 vytvára vodíkovú väzbu na tyrozín neurotenzínu vo vnútri tunela b-vrtule, čo naznačuje, že by boli ovplyvnené aj iné ligandy, ktoré sa viažu podobne ako neurotenzín. Naše vyšetrovanie zistilo zvýšenú afinitu IL-6 k karbamylovanému triedilínu, čo naznačuje účasť na signálnych dráhach IL-6. Niekoľko štúdií naznačuje, že IL-6 môže prispieť k vaskulárnej kalcifikácii vchronickýobličkachoroba.22,34,35 funkčná úloha v kalcificnej vaskulárnej patológii. Rozpustný karbamylovaný sortilín podporoval vaskulárnu kalcifikáciu in vitro a ex vivo zvýšením osteogénnych cieľových génov, aktivity TNAP a mineralizácie matrice. Okrem toho pridanie IL-6 do karbamylovaného sortilínu ďalej zvýšilo osteogénne cieľové gény a aktivitu TNAP.

Karbamylácia bola spojená s extracelulárnou zmenou matrice, 36 oxidačným stresom, 25 endotelovými dysfunkciami, 37 a aterosklerózou,38 všetky sa podieľajú na iniciácii a progresii kalcifikácie. Hoci Mori a spol. uviedli, že karbamylácia bielkovín podporuje kalcifikáciu ciev prostredníctvom karbamylácie mitochondriálnych proteínov, neboli identifikované žiadne špecifické cieľové proteíny. Nedávna štúdia preukázala, že karbamylácia uromodulínu viedla k strate jeho antikalorických vlastností in vitro. Obe štúdie použili západnú škvrnu na detekciu karbamylácie vo všeobecnosti. Preukázali sme, že karbamylovaný sortilín in vitro napodobňuje špecifický vzor modifikácie lyzínu in vivo, ktorý sa nachádza vchronickýobličkachorobapacientov užívajúcich SM. Naša štúdia teda poskytuje vodítka ku konkrétnym mechanizmom, ktoré spájajúchronickýobličkachoroba, karbamylácia bielkovín, IL-6 a kalcifikácia.

Predtým boli vysoké hladiny triedilínu v sére spojené s kalcifikáciou brušnej aorty a kalcifikáciou aorty aKardiovaskulárneudalosti nezávislé od tradičných Framinghamových rizikových faktorov v komunitnej kohorte mužov vo veku > 50 rokov.10 U pacientov s nízkym až stredným rizikom bolesti na hrudníku sa hladiny sortilínu nespájali so závažnosťou ochorenia koronárnych artérií.40 V tejto štúdii by sme mohli ukázať, že pacienti s bolesťou na hrudníku s nízkym až stredným rizikom sa hladiny sortilínu nespájali so závažnosťou ochorenia koronárnych artérií.40 V tejto štúdii sme mohli ukázať, že pacienti s bolesťou na hrudníku sa hladiny sortilínu nespájali so závažnosťou ochorenia koronárnych artérií.40 V tejto štúdii sme mohli ukázať, že pacienti s bolesťou na hrudníku s nízkym až stredným rizikom sa hladiny sortilínu nespájali so závažnosťou ochorenia koronárnych artérií.40 V tejto štúdii sme mohli ukázať, že pacienti s bolesťou na hrudníku s nízkym až stredným rizikom sa hladiny sortilínu nespájali so závažnosťou ochoreniachronickýobličkachorobamajú vyššie úrovne triedenia ako kontroly s normálnymobličkafunkcia. Hladiny sortilínu sa nezvýšili so zníženímobličkaFunkcia, keď pacient malchronickýobličkachorobas eGFR<60 ml/min="" per="" 1.73="" m2.="" however,="" we="" observed="" an="" increase="" of="" carbamylated="" sortilin="" residues="" with="" decreased="">obličkafunkcia. Podobne Kalim a spol. nehlásili žiadnu súvislosť medzi celkovými a karbamylovanými hladinami albumínu vchronickýobličkachorobapacienti.41 Sortilín karbamylácia, ktorá je výsledkom poškodeniaobličkafunkcia, môže ďalej zvýšiť vaskulárnu kalcifikáciu súvisiacu schronickýobličkachorobasúvisiace minerálne poruchy. Naše štúdium má niekoľko silných a silných stránok. Medzi silné stránky patrí analýza údajov získaných in vitro, ex vivo a u pacientov pomocou rôznych experimentálnych prístupov. Starostlivá charakteristika pacientov schronickýobličkachoroba, vrátane štandardizovaných dotazníkov na posúdenie charakteristík účastníkov, prezenčných študijných návštev vykonaných vyškolenými študijnými sestrami a meraní mnohých laboratórnych hodnôt a kalcifikácie, je osobitnou silnou stránkou štúdie. Môže sa zdať, že malá kohorta obmedzuje našu štúdiu; Použili sme nezávisléchronickýobličkachorobakohorty s následnými údajmi na kalcifikáciu na overenie stavu karbamylácie sortilínu pracnou cielenou MS. Klinické nálezy boli vykonané v nemčinechronickýobličkachorobapacientov, a tak môžu obmedziť zovšeobecnenie zistení na iné krajiny alebo etniká. Nakoniec, hoci návrh štúdie umožnil úpravu pre mnohých dôležitých mätúcich, reziduálne zmätenie, ako v každej pozorovacej štúdii, nemožno úplne vylúčiť.

Účinky cistanchu: prevencia zlyhania obličiek

Záver

Na záver, toto je prvá štúdia demonštrujúca špecifické aminokyseliny, ktoré sú posttransklačne modifikované v cirkulujúcom sortilíne. Naše údaje naznačujú, že prítomnosťchronickýobličkachorobapodporuje karbamyláciu cirkulujúceho sortilínu a karbamylovaný triedilín vykazuje plodné vlastnosti, ako sa preukázalo in vitro, ex vivo a prítomnosťou v kalcifikovanom tkanive. Sortilín karbamylácia bola spojená s CAC, a to aj po úprave veku,obličkafunkcia a niekoľko ďalších rizikových faktorov, ktoré naznačujú, že prevencia karbamylácie triedilínu by mohla znížiť riziko vznikuKardiovaskulárnekalcifikácia a tedaKardiovaskulárneKomplikácie u pacientov schronickýobličkachoroba. Naše výsledky teda poukazujú na karbamylovaný triedilín ako prispievateľa kKardiovaskulárnechorobná záťaž vchronickýobličkachorobaPacientov.

cistanche

REFERENCIE

Tento zdroj je od Vera Jankowski, IMCAR, Lekárska fakulta, RWTH Aachen University, Aachen, Nemecko atď.