Časť 2: Epigenetická regulácia cirkadiánneho génu Per1 prispieva k vekom podmieneným zmenám v hipokampálnej pamäti

Kontakt: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com

Pls kliknite sem pre časť 1

Zníženie Per1 dlhodobo zhoršujePamäťu mladých myší.Ďalej, aby sa otestovalo, či je z dlhodobého hľadiska potrebná zvýšená regulácia Per1 v dorzálnom hipokampePamäť48 hodín pred 10-minútovým tréningom OLM sme infundovali siRNA zacielenú na Per1 do dorzálneho hipokampu mladých myší. Infúzia Per1 siRNA spôsobila významné zníženie proteínu PER1 v dorzálnom hipokampe, ako sa meralo 2 hodiny po poslednej testovacej relácii (obr. 4d, doplnkový obrázok 5). Toto relatívne mierne zníženie proteínu PER1 (~ 30 percent) spôsobilo vážne poškodeniePamäťformácia pre OLM; myši s infúziou Per1 siRNA nevykazovali žiadne významné zvýšenie DI medzi tréningom a testovaním a vykazovali výrazne menšiu preferenciu pohybujúceho sa objektu počas testovania ako kontrolné myši (obr. 4e) bez vplyvu na celkový prieskum objektu pri teste (obr. 4f). a žiadny rozdiel v pohybe počas predtréningových návykových sedení (doplnkový obrázok 8c). To po prvý raz dokazuje, že lokálne narušenie základného génu cirkadiánnych hodín selektívne v hipokampe môže poškodiťPamäťtvorenie.

Zlepšuje sa nadmerná expresia Per1Pamäťu starnúcich myší. nakoniecurčiť, či nadmerná expresia Per1 v dorzálnom hipokampe je dostatočná na zlepšenie súvisiace s vekomPamäťnarušenia, lokálne sme upregulovali Per1 pomocou dvoch komplementárnych metód. Najprv sme použili lentivírus exprimujúci Per1 divokého typu s epitopovou značkou v5 (pLVX-v5Per1) (obr. 5a, doplnkový obrázok 6a). Aby sme potvrdili, že tento plazmid nadmerne exprimuje Per1, transfekovali sme bunky HT22 s pLVX-v5Per1 alebo pLVX-EV a zmerali sme expresiu Per1 mRNA. Po 24 aj 48 hodinách po transfekcii bola mRNA Per1 významne zvýšená v bunkách transfekovaných pLVX-v5Per1 v porovnaní s bunkami transfekovanými kontrolným plazmidom (obr. 5b). Transfekcia pLVX-v5Per1 tiež viedla k významnému zvýšeniu mRNA pre Per2 (člen rodiny Period clock, ktorý interaguje s Per1) po 24 hodinách (doplnkový obrázok 6b), hoci toto zvýšenie bolo oveľa menšie ako pozorované zvýšenie Per1 (pri 24 h, za 1: 466-násobný nárast oproti EV, za 2: 1.6-násobný nárast oproti EV). Nadmerná expresia Per1 však neovplyvnila transkripciu najbližšieho downstream génu Hes7 (doplnkový obrázok 6c).

Na určenie, či sa nadmerná expresia Per1 zlepšujePamäťvýkonnosti u starnúcich myší bol pLVX-v5Per1 infúzne podaný do dorzálneho hipokampu 18-mo myší 2 týždne pred týmto správaním. Myši pLVX-v5Per1 vykazovali významné zlepšeniePamäťpre OLM pri teste v porovnaní s kontrolami pLVX-EV (prázdny vektor) (obr. 5c). Iba myši pLVX-v5Per1 vykazovali významné zvýšenie preferencie pohybujúceho sa objektu v pokoji v porovnaní s tréningom bez pozorovaných rozdielov medzi skupinami v celkovom prieskume pri teste (obr. 5d) alebo v pohybe počas habituácie (doplnkový obrázok 8d).

Po správaní bolo hipokampálne tkanivo z podskupiny zvierat spracované na sekvenovanie RNA, aby sa potvrdila prítomnosť transkriptov pLVX-EV a pLVX-v5Per1 vo vhodných skupinách in vivo (doplnkový obrázok 7a, b, f, g).

Na doplnenie tohto prístupu sme tiež použili systém CRISPR / dCas9 Synergistic Activation Mediator (SAM) 33 na riadenie transkripčnej aktivácie Per1 v dorzálnom hipokampe. Tento systém pozostáva z troch lentivírusových zložiek: katalytickyneaktívny Cas9 (dCas9) fúzovaný s VP64 transkripčnou aktivačnou doménou s GFP tagom (dCas9-VP64-GFP), modifikovanou single-guide RNA (sgRNA) zacielenou na Per1 s dvoma MS2 RNA aptamérmi, ktoré môžu získať tretiu zložku, fúzny proteín MS2- dvojitého transkripčného aktivátora (MS2-p65-HSF1)(obr. 5e). Kontrolné zvieratá dostali kontrolnú sgRNA, ktorej chýbala 20 nukleotidová sekvencia potrebná na zacielenie systému SAM na Per1 (označované ako ctrl sgRNA). Zostavenie týchto komponentov v promótore Per1 umožňuje trom efektorovým doménam (VP64, p65 a HSF1) riadiť transkripciu Per1. Na potvrdenie, účinnosť Obr. 5 Nadmerná expresia Per1 v dorzálnom hipokampe zlepšuje poruchy súvisiace s vekom v umiestnení objektu.Pamäť. Schéma lentivírusového konštruktu použitého na nadmernú expresiu v{0}}označeného Per1 (pLVX-v5Per1) v porovnaní s prázdnou vektorovou kontrolou (pLVX-EV). b Per1 mRNA sa významne zvýšila 24 a 48 hodín po transfekcii pLVX-v5Per1 v HT22 bunkách v porovnaní s bunkami transfekovanými EV (Dvojcestná ANOVA: Interakcia skupiny x časový bod (F(1,8)=52.8, p < {{20}}.0{{40}}1),="" sidakove="" post="" hoc="" testy,="" ***p="">< 0.001,="" n="3," 3,="" 3,="" 3).="" c="" 18-mo="" myši,="" ktorým="" sa="" podávali="" hipokampálne="" infúzie="" plvx-v5per1,="" vykazovali="" výrazne="" lepšiu="" pamäť="" pre="" olm="" ako="" myši,="" ktorým="" bol="" podaný="" kontrolný="" vírus="" plvx-ev="" (dvojcestná="" anova:="" interakcia="" vírus="" x="" relácia,="" (f(1,29)="" {{34)="" }}.15,="" p="">< 0,05),="" sidakove="" post="" hoc="" testy,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001,="" n="16," 15,="" všetci="" muži).="" d="" celkový="" prieskum="" bol="" podobný="" pre="" obe="" skupiny="" v="" teste="" (t(29)="0.57," p="0.57)." e="" schéma="" systému="" crispr/dcas9="" synergistic="" activation="" mediator="" (sam)="" používaného="" na="" riadenie="" transkripcie="" per1.="" hore:="" jednotlivé="" komponenty="" sam.="" dole:="" komponenty="" zostavené="" v="" promótore="" per1,="" ktoré="" riadia="" transkripciu="" per1.="" f="" per1="" mrna="" sa="" významne="" zvýšila="" 48="" hodín="" po="" transfekcii="" zložiek="" crispr-sam="" v="" bunkách="" ht22="" v="" porovnaní="" s="" bunkami="" transfekovanými="" kontrolnou="" sgrna="" (dvojcestná="" anova:="" interakcia="" skupiny="" x="" časový="" bod="" (f(1,8)="14.77" ,="" p="">< 0,01),="" sidakove="" post="" hoc="" testy,="" **p="">< 0,001,="" n="3,3,3,3)." g="" 18-mo="" myši,="" ktorým="" boli="" podané="" hipokampálne="" infúzie="" systému="" crispr-sam="" so="" sgrna="" zacielením="" na="" per1,="" vykazovali="" výrazne="">Pamäťpre OLM v porovnaní s kontrolnými myšami EV s kontrolnou sgRNA (Dvojcestná ANOVA: Interakcia vírus x relácia (F(1,30)=5,83, p < 0,05)="" ,="" sidakove="" post="" hoc="" testy,="" ***p="">< 0,001,="" n="17," 15,="" všetci="" muži).="" h="" celkový="" prieskum="" bol="" podobný="" pre="" obe="" skupiny="" v="" teste="" (t(30)="0.41," p="0.68)." údaje="" sú="" prezentované="" ako="" priemer="" ±="" sem="" v="" systéme="" crispr-sam,="" bunky="" ht22="" sme="" transfekovali="" všetkými="" tromi="" plazmidmi,="" bunky="" sme="" zozbierali="" o="" 24="" alebo="" 48="" hodín="" neskôr="" a="" merali="" expresiu="" per1="" mrna.="" do="" 48="" hodín="" po="" transfekcii="" sa="" per1="" mrna="" výrazne="" zvýšila="" v="" skupine,="" ktorej="" bola="" podávaná="" per1="" sgrna="" v="" porovnaní="" s="" kontrolami="" (obr.="" 5f),="" čo="" potvrdzuje,="" že="" systém="" crispr-sam="" účinne="" riadi="" expresiu="" per1="" mrna.="" nepozorovali="" sme="" žiadnu="" zmenu="" v="" expresii="" ani="" pre="" mrna="" per2="" (doplnkový="" obrázok="" 6e)="" ani="" mrna="" hes7="" (doplnkový="" obrázok="" 6f),="" čo="" naznačuje,="" že="" systém="" crispr-sam="" riadi="" selektívnu="" nadmernú="" expresiu="" cieľového="" génu="">

Ďalej 18-mo myšiam boli podané intra-hippokampálne infúzie lentivírusov CRISPR-SAM (doplnkový obrázok 6d) a o 2 týždne neskôr boli trénované v OLM. Ako bolo pozorované pri našej nadmernej expresii pLVX-v5Per1, nadmerná expresia Per1 sprostredkovaná CRISPR-SAM sa výrazne zlepšilaPamäťvýkonnosť u myší s infúziou Per1 sgRNA v porovnaní s kontrolnými zvieratami (obr. 5g) bez ovplyvnenia celkového prieskumu (obr. 5h) alebo pohybu počas návyku (doplnkový obrázok 8e). Iba myši, ktorým bola podávaná sgRNA Per1, vykazovali významné zvýšenie preferencie pohybujúceho sa objektu v pokoji v porovnaní s tréningom, čo naznačuje neporušenéPamäťpre umiestnenie objektov (obr. 5g). Po správaní bolo hipokampálne tkanivo z podskupiny zvierat spracované na sekvenovanie RNA, aby sa potvrdila prítomnosť transkriptov CRISPR vo vhodných skupinách in vivo (doplnkový obrázok 7c – g). Tieto výsledky spolu ukazujú, že nadmerná expresia Per1 v dorzálnom hipokampe je dostatočná na zlepšenie vekom súvisiacich porúch v dlhodobej pamäti umiestnenia objektu. Per1 je preto kľúčový gén, ktorý je rozhodujúci pre tvorbu dlhodobej pamäti, je regulovaný HDAC3 a je narušený v starnúcom mozgu.

Diskusia

Naše výsledky ukazujú, že delécia alebo narušenie represívnej histónovej deacetylázy HDAC3 môže zlepšiť poruchy súvisiace s vekom v oboch dlhodobýchPamäťa synaptickú plasticitu. Ďalej, delécia HDAC3 obnovuje skúsenosťou indukovanú expresiu cirkadiánneho génu Per1 v dorzálnom hipokampe. Keďže expresia PER1 v hipokampe je kritická pre tvorbu dlhodobej pamäte (obr. 4) a nadmerná expresia Per1 v hipokampe zlepšuje poruchy pamäti súvisiace s vekom (obr. 5), PER1 je potenciálnym mechanizmom, prostredníctvom ktorého sa zlepšuje delécia HDAC3Pamäťa synaptickú plasticitu u starnúcich myší. Všeobecnejšie povedané, narušenie Per1 súvisiace s vekom môže spájať poruchy súvisiace s vekom v dlhodobej pamäti a cirkadiánnej rytmike v závislosti od štruktúry.

Jedným z kľúčových zistení zo súčasnej štúdie bolo, že poruchy súvisiace s vekom v hipokampálnej LTP by sa mohli zlepšiť deléciou alebo narušením HDAC3. To je v súlade s nedávnou prácou z laboratória Sajikumar, ktorá dokazuje, že farmakologická blokáda HDAC3 môže tiež zlepšiť poruchy súvisiace s vekom v asociatívnom hipokampálnom LTP34. Zaujímavé je, že sme zistili, že plátky zo starých zvierat HDAC3flox/flox a HDAC3(Y298H) nedosiahli rovnakú úroveň potenciácie ako plátky z mladých zvierat HDAC3flox/flox alebo HDAC3(Y298H) (obr. 2c, f), čo naznačuje, že starnúce mozgy môžu mať nižší strop plasticity ako mladé mozgy. Jedným z možných vysvetlení tohto rozdielu v potenciácii je, že strata synaptických kontaktov v CA122 súvisiaca s vekom by mohla znížiť strop plasticity v starnúcom hipokampe, pretože menej dostupných synapsií by sa nasýtilo rýchlejšie ako relatívne hojné synapsie u mladých DH. Ak je to tak, posilnenie stimulačného protokolu alebo poskytovanie rozložených stimulačných záchvatov35 by nemalo ďalej zvyšovať LTP v starnúcom hipokampe, pretože nie sú k dispozícii žiadne ďalšie synapsie. Na určenie mechanizmu, ktorý je základom tohto rozdielu, bude potrebná ďalšia práca.

Naše výsledky sekvenovania RNA ukázali, že len malá podskupina génov spĺňa kritériá na obnovenie starnúceho mozgu deléciou HDAC3 (obr. 3e). Namiesto rekapitulácie profilu génovej expresie mladého mozgu teda vymazanie HDAC3 v starnúcom mozgu obnovilo skúsenosťou indukovanú expresiu niekoľkých kľúčových génov, ktoré sú kriticky dôležité pre tvorbu dlhodobej pamäte, vrátane Per1. Zdá sa, že Per1 je priamo regulovaný HDAC3, pretože fokálna delécia HDAC3 obnovila skúsenosťou indukovanú expresiu Per1 a HDAC3 je fyzicky odstránený z promótora Per1 v reakcii na tréning OLM. Ďalej je potrebný výraz Per1Pamäť, ako siRNA-sprostredkované knock-down proteínu PER1 v DH dlhodobo narušenéPamäťu mladých myší a zlepšila sa nadmerná expresiaPamäťpre OLM u starnúcich myší. Je pozoruhodné, že obidva lentivírusové systémy používané na nadmernú expresiu Per1 transfekovali iba malý počet buniek v oblasti CA1b dorzálneho hipokampu (doplnkový obrázok 6a, d), takže je potrebné potvrdiť prítomnosť týchto konštruktov sekvenovaním RNA (pozri metódy ). Ako predchádzajúca práca ukázala, že táto presná oblasť dorzálneho hipokampu je kritická pre OLM36, ukazuje to, že aj malá fokálna zmena Per1 v štruktúre relevantnej pre pamäť môže ovplyvniť tvorbu dlhodobej pamäte. Toto rozširuje predchádzajúci výskum, ktorý ukazuje, že nešpecifická delécia Per1 v mozgu môže narušiť tvorbu pamäte u mladých myší6,28,29. Abnormálna HDAC3-sprostredkovaná represia Per1 v starnúcom mozgu je preto kľúčovou udalosťou, ktorá by mohla viesť k poruchám súvisiacim s vekom pri tvorbe dlhodobej pamäte a cirkadiánnej rytmike. Hoci táto štúdia jasne ukazuje, že Per1 je dôležitý gén, prostredníctvom ktorého HDAC3 reguluje dlhodobú pamäť v starnúcom mozgu, iné gény s najväčšou pravdepodobnosťou prispievajú k účinkom delécie HDAC3 na zlepšenie pamäte. Ďalšie gény navrhnuté na sprostredkovanie účinkov HDAC3 na synaptickú plasticitu a pamäť zahŕňajú NF-KB34, FMRP37 a Nr4a226. V súčasnej štúdii sme identifikovali ďalšie tri gény (obr. 3f: Nr4a1, Egr1, Tsc22d3), ktoré podobne ako Per1 vykazujú zhoršenú expresiu v starnúcom mozgu, ktorá je zlepšená deléciou HDAC3. Ako tieto rôzne gény jedinečne prispievajú k účinkom delécie HDAC3 na zlepšenie pamäte, je v súčasnosti nejasné. Je pozoruhodné, že všetky tieto gény sú prepojené s dráhou CBP/CREB, ktorá je kritická pre tvorbu dlhodobej pamäte38,39 a je tak nad, ako aj za PER16,28. Keďže PER1 je pred fosforyláciou CREB6, je možné, že HDAC3-sprostredkovaná represia Per1 znižuje fosforyláciu CREB, čo v konečnom dôsledku zhoršuje transkripciu génov sprostredkovaných CREB, ako sú Fmrp40,41 a členovia rodiny génov Nr4a Nr4a1 a Nr4a226. Pochopenie komplexnej dynamiky medzi HDAC3, PER1 a týmito ďalšími molekulárnymi hráčmi bude dôležitým cieľom budúceho výskumu.

V súčasnej štúdii sme použili dve doplnkové metódy na nadmernú expresiu Per1 v starnúcom mozgu: nadmernú expresiu konštruktu cDNA Per1 s plnou dĺžkou pomocou pLVX-v5Per1 a transkripčnú aktiváciu endogénneho Per1 pomocou systému CRISPR-SAM. Hoci nadmerná expresia sprostredkovaná pLVX viedla k veľkému zvýšeniu mRNA Per1 (obr. 5b), sprevádzalo to zvýšenie Per2, ďalšieho člena rodiny obdobia (doplnkový obrázok 6b). Expresia downstream génu Hes7 sa však nezmenila pomocou pLVX-v5Per1 (doplnkový obrázok 6c). Systém CRISPR-SAM na druhej strane produkoval jemnejší nárast mRNA Per1, ktorý sa vyhýbal mimocieľovým vylepšeniam expresie Per2 alebo Hes7 (doplnkový obrázok 6e – f). Keďže oba prístupy sa z dlhodobého hľadiska podobne zlepšiliPamäťu starnúcich myší je nepravdepodobné, že by mimocieľové zvýšenie Per2 pozorované pri pLVX-v5Per1 bolo príčinou pozorovaného zlepšenia dlhodobej pamäte.

Cirkadiánne účinky na dlhodobéPamäťsa tradične verí, že pochádzajú z dysregulácie v SCN, ktorá potom riadi zmeny v periférnych štruktúrach zapojených do tvorby pamäte, ako je dorzálny hipokampus. Málo sa vie o úlohe jednotlivých génov cirkadiánnych hodín v DH, napriek jasnému spojeniu medzi cirkadiánnou rytmicitou a tvorbou dlhodobej pamäte. Pamäť je úzko spätá s časom dňa, keďže génové kaskády súvisiace s plasticitou vykazujú cirkadiánne oscilácie3,6 aPamäťmožno ľahšie získať v určitých obdobiach cirkadiánneho cyklu. Kondicionovanie strachu z kontextu sa napríklad získava silnejšie počas dňa, keď hladiny fosforylácie MAPK vrcholia3. Ďalej je dobre zdokumentované, že starnutie je sprevádzané rozpadom cirkadiánnych rytmov, pravdepodobne v dôsledku zmien v centrálnych cirkadiánnych hodinách, suprachiasmatic nucleus (SCN) (pre prehľad 1). Ako toto narušenie cirkadiánnych hodín súvisí s poruchami súvisiacimi s vekomPamäťje otvorená otázka. Naše výsledky naznačujú, že HDAC3 obmedzuje skúsenosťami indukovaný Per1 v starnúcom hipokampe, čo pravdepodobne prispieva k pozorovaným poruchám dlhodobej pamäte. Epigenetická represia Per1 môže preto predstavovať dôležité rozhranie medzi poruchami súvisiacimi s vekom v cirkadiánnej rytmike a tvorbe dlhodobej pamäte.

Zo základných kanonických génov cirkadiánnych hodín je Per1 jedinečne pripravený dramaticky ovplyvniť hipokampálny dlhodobýPamäť. Zdá sa, že Per1 sa prevažne podieľa na výstupných dráhach SCN a hrá kľúčovú úlohu v periférnych hodinách po prúde od SCN, ako je hipokampus42. Nedávna práca ďalej naznačuje, že Per1 môže „brániť“ formovanie priestorovej pamäte počas cyklu deň/noc riadením fosforylácie CREB6, 28, 29. Upregulácia mRNA hipokampu Per1 bola skutočne pozorovaná po kontextovom alebo priestorovom učení v najmenej troch ďalších štúdiách RNA-seq, vrátane práce na potkanoch, čo naznačuje, že Per1 je zvyčajne upregulovaný po učení naprieč druhmi20, 43, 44. Spolu s výsledkami súčasnej štúdie táto práca naznačuje, že expresia PER1 je kriticky dôležitá pre tvorbu hipokampálnej dlhodobej pamäte; zníženie PER1, ku ktorému dochádza v noci29 alebo so starnutím, môže poškodiť hipokampusPamäť. Randiť,

výskum zahŕňajúci Per1 inPamäťformácia sa spoliehala výlučne na globálne knockouty, ktoré narúšajú expresiu Per1 v základných cirkadiánnych hodinách a ďalších oblastiach okrem štruktúr dôležitých pre pamäť, ako je hipokampus6, 28, 29, 45, 46, čo znemožňuje určiť, či je hipokampálny PER1 špecificky potrebný pre formovanie pamäti. Globálna delécia Per1 v niektorých správach skutočne ovplyvňuje cirkadiánnu rytmiku42. Tu po prvýkrát ukazujeme, že zníženie expresie PER1 priamo v dorzálnom hipokampe môže poškodiťPamäťu mladých myší, zatiaľ čo lokálna nadmerná expresia Per1 v dorzálnom hipokampe môže zlepšiť pamäť u starnúcich myší. Keďže selektívna delécia HDAC3 (ktorá reguluje Per1) v dorzálnom hipokampe nemala v súčasnej štúdii žiadny vplyv na vzorce cirkadiánnej aktivity (doplnkový obrázok 4), a dokonca ani elektrolytické lézie dorzálneho hipokampu nie sú dostatočné na ovplyvnenie cirkadiánnej rytmicity47, zdá sa nepravdepodobné, že manipulácia s Per1 v dorzálnom hipokampe ovplyvňuje funkciu centrálnych cirkadiánnych hodín. Je však možné, že skúsenosťami vyvolané zvýšenie Per1 alebo vírusom sprostredkovaná nadmerná expresia Per1 môže ovplyvniť cirkadiánnu osciláciu iných molekulárnych hráčov, ako sú iné hodinové gény, v hipokampálnych neurónoch, a to aj bez ovplyvnenia vzorcov cirkadiánnej aktivity. Cieľom budúcej práce bude pochopenie toho, ako Per1 funguje pri zmene formovania pamäte, vrátane identifikácie týchto potenciálnych interagujúcich partnerov.

Spoločne tieto výsledky ukazujú, že kľúčový gén pre cirkadiánne hodiny Per1 hrá v rámci lokálnychPamäťštruktúry na zmenu tvorby pamäte, čo je úloha, ktorá je nezávislá od jej funkcie v SCN. Vo všeobecnosti to spochybňuje tradičnú hypotézu, že cirkadiánne zmenyPamäťformovanie je poháňané zmenami v základných cirkadiánnych hodinách a namiesto toho podporuje hypotézu, že gény cirkadiánnych hodín hrajú autonómnejšiu úlohu v hipokampálnych bunkách, čo môže viesť k vytváraniu pamäte na základe dennej doby6.

Metódy

Myši. Mladé dospelé myši mali v čase testovania 2 až 4 mesiace a starnúce myši mali 18 až 20 mesiacov. Všetky myši boli C57BL/6J alebo boli udržiavané na pozadí C57BL/6 (myši HDAC3 plus/plus a HDAC3flox/flox). Myši mali voľný prístup k potrave a vode a svetlá sa udržiavali v 12-hodinovom cykle svetlo/tma. Všetky testy správania sa uskutočnili počas svetelného cyklu. Všetky experimenty sa uskutočňovali podľa usmernení amerického Národného inštitútu zdravia pre starostlivosť o zvieratá a ich používanie a boli schválené Inštitucionálnym výborom pre starostlivosť o zvieratá a používanie zvierat Kalifornskej univerzity v Irvine.

Chirurgia. Myši sa anestetizovali izofluránom (indukovaný, 4 percentá; udržiavaný 1,5 až 2 0 percent) a umiestnili sa do stereotaxie. Injekčné ihly sa spúšťali do dorzálneho hipokampu rýchlosťou 0,2 mm/15 s (AP, -2.0 mm; ML, ± 1,5 mm, DV, -1,5 mm vzhľadom na Bregma ). Dve minúty po dosiahnutí cieľovej hĺbky bol 1,{15}} ul vírusu alebo siRNA infúziou bilaterálne do DH rýchlosťou 6 ul/h. Pre lentivírusové infúzie CRISPR-SAM sa infúziou podával koktail troch vírusov do konečného objemu 1, 5 μl na hemisféru rovnakou rýchlosťou. Injekčné ihly zostali na mieste dve minúty po injekcii, aby sa umožnila difúzia vírusu. Injektory sa potom zdvihli 0 0,1 mm a nechali sa sedieť ďalšiu minútu a potom sa odstránili rýchlosťou 0,1 mm za 15 s. Vírusové infúzie sa uskutočnili 2 týždne pred analýzou správania, zatiaľ čo knockdown siRNA sa uskutočnil 2 dni pred tréningom13. Pre všetky injekčné experimenty boli zvieratá náhodne priradené k rôznym injekčným podmienkam (s výnimkou myší HDAC3 plus/plus a HDAC3flox/flox, ktorým bola všetkým injekčne podaná AAV-CaMKII-Cre). Pre všetky behaviorálne experimenty boli zvieratá v rámci každého vírusového stavu náhodne rozdelené do skupín v domácej klietke/trénovaných skupinách a všetky podmienky (predmety, boxy atď.) boli medzi skupinami vyvážené.

AAV produkcia. AAV2.1-CaMKII-Cre bol zakúpený od Penn Vector Core (titer: 1,81 × 1013 GC/ml). Pre AAV2.1-HDAC3(Y298H)-v5 sme amplifikovali divoký typ HDAC3 z hipokampálnej cDNA a klonovali produkt do modifikovaného pAAV-IRES-hrGFP (Agilent) pod kontrolou CMV promótora a -globínového intrónu. Značka 3x-FLAG, prvok IRES a hrGFP boli z vektora odstránené a nahradené značkou V5, čo umožnilo C-terminálnu fúziu s HDAC3 (plazmid MW91). Na vytvorenie bodovej mutácie sme zmenili nukleotidy tak, aby kódovali histidínový zvyšok namiesto tyrozínu v aminokyseline 298 (plazmid MW92). Pre prázdnu vektorovú kontrolu nebola prítomná kódujúca sekvencia HDAC3, ale všetky ostatné prvky zostali (plazmid MW87). AAV bol vyrobený pomocou Penn Vector Core a konečné titre boli stanovené pomocou qPCR (AAV-HDAC3(Y298H): 6,48 x 1012 GC/ml; AAV-EV: 1,35 x 1013 GC/ml).

Produkcia lentivírusu. Pre systém CRISPR/dCas9 Synergistic Activation Mediator (SAM) boli lentivírusové plazmidy zakúpené od Addgene pre dCas9- VP64-GFP (#61422-LVC) a MS2- Konštrukty P65-HSF1_Hygro (#61426-LVC) (titre väčšie alebo rovné 8 × 106 TU/ml). Pre Per1 sgRNA sme klonovali a vložili antisense vodiacu sekvenciu zodpovedajúcu CRE elementu v Per1 promótore (AGAGGGAGGTGACGTCAAAG) do Addgene sgRNA(MS2) klonovacej kostry (#61427). Kontrolná sgRNA bola identická, okrem toho, že do plazmidu nebola klonovaná žiadna vodiaca sekvencia. Lentivírusy pre Per1 sgRNA (titer: 6,8 x 107 IFU/ml) aj kontrolnú sgRNA (3,5 x 107 IFU/ml) vyrobilo lentivírusové laboratórium USC School of Pharmacy.

Pre konštrukt s nadmernou expresiou pLVX-V5Per1 sme amplifikovali divoký typ Per1 plnej dĺžky z plazmidu Addgene pCMV-Sport2-mPer1 (#16203) a klonovali produkt do modifikovaného pLVX-EF1 -IRES-mCherry chrbtica (Takara, #631987). Prvky IRES a mCherry sa odstránili a nahradili sa značkou V5, čo umožnilo N-koncovú fúziu s PER1 (plazmid MW206). Pre kontrolu s prázdnym vektorom (EV) nebola prítomná kódujúca sekvencia PER1, ale zostali všetky ostatné prvky (plazmid MW93). Lentivírusy pre pLVX-v5Per1 (titer: 1,3 x 108 IFU/ml) a pLVX-EV (titer: 1,5 x 108 IFU/ml) vyrobilo lentivírusové laboratórium USC School of Pharmacy. Všetky lentivírusové konštrukty boli exprimované pod promótorom EF1.

Overenie bunkovej kultúry pLVX-v5Per1 a CRISPR-SAM. Aby sa overilo, že pLVX-v5Per1 produkuje nadmernú expresiu Per1 mRNA, myšie HT22 bunky (Salk Institute, La Jolla, CA, #T09031) sa transfekovali s pLVX-v5Perl alebo pLVX-EV (obr. 5a) s použitím Lipofectaine LTX (Invitrogen). Podobne, aby sa overilo, že systém CRISPR-SAM dokáže účinne riadiť transkripciu Per1, bunky HT22 boli transfekované dCas9-VP64 (lenti MS2-P65_HSF1_Blast bol dar od Feng Zhang Addgene plazmidu #61425), MS2-P65-HSF1 (lenti dCAS-VP64_Blast bol dar od Feng Zhang, Addgene plazmid #61426) a buď Per1 sgRNA (Per1 sgRNA) alebo necielená kontrolná sgRNA (ctrl sgRNA) (lenti sgRNA (MS2)_zeo chrbtica bola darom od Feng Zhang, Addgene plazmid #61427) s použitím Lipofectamine LTX (Invitrogen). Bunky boli zozbierané po 24 alebo 48 hodinách, lyzované a mRNA bola izolovaná, ako je opísané vyššie. qRT-PCR sa uskutočnila tak, ako je opísané vyššie, s použitím primérov a sond Per1, Per2 a Hes7 uvedených v tabuľke S4.

siRNA. Pre experiment s knockdownom Per1 boli malé interferujúce RNA Accell SMARTpool (siRNA; Dharmacon, GE) zacielené na Per1 nariedené na konečnú celkovú koncentráciu 1 0 μM v ddH20 a infúzne podávané do DH (1,0 ul/strana). Ako kontrola sa použila Accell necielená poolová siRNA (celková koncentrácia, 10 uM) a infúzia sa podala rovnakým spôsobom. Pre experimenty siRNA sa s myšami zaobchádzalo a zvykali si, ako je opísané vyššie, a operácia sa uskutočnila deň po poslednom dni zvyknutia. Myšiam bol po operácii poskytnutý celý deň zotavenia a nasledujúci deň (~ 48 hodín po operácii) boli trénované, aby sa zabezpečilo maximálne zníženie cieľa. Aby sa zabezpečilo knockdown, myši boli obetované ~ 1 hodinu po teste a údery z dorzálneho hipokampu boli spracované pomocou western blotov, aby sa zabezpečilo knockdown proteínu PER1.

Umiestnenie a rozpoznávanie objektovPamäťúlohy. Pri úlohách týkajúcich sa lokalizácie objektov a rozpoznávania objektov sa s myšami manipulovalo 2 minúty/deň počas 4 dní a potom sa privykali na kontext počas 5 minút/deň počas šiestich po sebe nasledujúcich dní v neprítomnosti objektov. Počas tréningu boli myši vystavené dvom identickým predmetom (100 ml kadičky, nádobky na korenie alebo sklenené svietniky) a nechali sa 10 minút skúmať. Počas retenčného testu (o 24 hodín neskôr pre dlhodobéPamäťalebo o 60 m neskôr pre krátkodobú pamäť), myši sa nechali skúmať 5 minút. Pre umiestnenie objektuPamäť, bol jeden z dvoch známych objektov presunutý na nové miesto. Na rozpoznávanie objektovPamäť, umiestnenie objektov zostalo konštantné, ale jeden z objektov bol nahradený novou položkou. Privykanie na pamäť rozpoznávania objektov sa začalo najmenej jeden týždeň po dokončení testovania OLM a bol použitý nový kontext a neznáme objekty48. Prieskum bol hodnotený, keď sa hlava myši orientovala smerom k objektu a priblížila sa na 1 cm alebo keď sa nos dotkol objektu. Zaznamenal sa celkový čas prieskumu (t) a preferencia novej položky sa vyjadrila ako diskriminačný index (DI=(tnovel -tfamiliar) / (tnovel plus tfamiliar) x 100 percent). Pre tréningové stretnutia bol objekt určený na presunutie pri teste použitý ako nový objekt, aby bolo možné priamo porovnávať tréningové a testovacie DI. Myši, ktoré skúmali oba objekty menej ako 2 s počas testovania alebo 3 s počas tréningu, boli odstránené z ďalšej analýzy. Myši, ktoré počas tréningu uprednostňovali jeden objekt (DI > ±20), boli tiež odstránené. Habituačné relácie sa analyzovali (na určenie prejdenej vzdialenosti a rýchlosti) pomocou softvéru na analýzu správania ANY-bludisko (Stoelting Co). Všetky návyky, tréningy, testovanie a skórovanie vykonávali experimentátori zaslepení voči experimentálnym skupinám.

Súvislosť strachu s podmienkou. Pre kontextové podmieňovanie strachu sa s myšami najprv zaobchádzalo 5 dní. Počas akvizície boli myši vystavené kontextu na 2 minúty a 28 s, po ktorých nasledoval 2 s (0 0,75 mA) šok, čo je protokol, ktorý zvyčajne vytvára robustnú dlhodobú pamäť12,20. Myši zostali v kontexte ďalších 30 s pred odstránením. Myši boli obetované 60 m po tréningu spolu s kontrolami v domácej klietke, s ktorými sa manipulovalo, ale neboli trénované. Správanie pri mrazení sa meralo pomocou softvéru Ethovision 11 (Noldus)12.

Zvýšené plus-bludisko. Plus-bludisko vykonal experimentátor slepý k experimentálnym skupinám. Jeden týždeň po dokončení ORM bola podskupina myší testovaná v plus-bludisku. Dve ramená bludiska boli otvorené (30 × 5 cm) a dve ramená boli uzavreté (30 × 5 × 15 cm), spojené centrálnou plošinou (5 × 5 cm). Bludisko bolo vyvýšené 40 cm nad podlahou. Myši boli testované počas 5 minút na zariadení, ktoré pozostávalo z umiestnenia každej myši na centrálnu platformu otočenú k jednému z otvorených ramien. Medzi subjektmi sa bludisko vyčistilo 70 percentným etanolom. Percento času stráveného v zatvorených a otvorených ramenách bolo hodnotené pomocou softvéru ANY-bludisko.

Analýza cirkadiánneho rytmu. Mladé ({{0}}} mes.) a starnúce (18-} mes.) myši HDAC3 plus/plus a HDAC3flox/flox boli chované a umiestnené v 12-hodinovom cykle svetlo/tma (LD). Dva týždne po infúzii AAV-CaMKII-Cre (opísanej vyššie) boli myši prenesené do izolovanej 12-hodinovej miestnosti na strhávanie LD na 7 dní. Myši sa potom preniesli do miestnosti na analýzu aktivity chránenej pred svetlom, kde sa analyzovala lokomotorická aktivita pomocou detektorov pohybu s optickým lúčom (Philips Respironics). Aktivita sa monitorovala počas 2 týždňov strhnutia cyklu LD v miestnosti chránenej pred svetlom predtým, ako sa myši prepli do konštantnej tmy (DD) na ďalšie 3 týždne. Monitorovanie aktivity pokračovalo počas fázy DD, aby sa určilo, či delécia HDAC3 v DH ovplyvnila endogénne cirkadiánne rytmy. Údaje sa zbierali pomocou Minimitter VitalView 5.0 a na určenie nástupu voľnej aktivity sa použil softvér Clocklab (Actimetrics). Hodnoty Tau sa vypočítali získaním sklonu tohto nástupu a výpočtom zhody najmenších štvorcov pomocou softvéru Clocklab49,50.

Imunohistochémia. Po dokončení správania boli myši usmrtené cervikálnou dislokáciou a ich mozgy boli odstránené a rýchlo zmrazené v ľadovo studenom izopentáne. Dvadsaťmikrometrové rezy sa odobrali v celom dorzálnom hip-campuse, rozmrazili sa na podložné sklíčka a skladovali sa pri -80 stupňoch. Sklíčka boli fixované 4 percentami paraformaldehydu (10- min), permeabilizované v 0.01 percento Tritonu X-100 v 0,1 M PBS (5- min) a blokované na 1 hodinu s 8 percentami normálneho kozieho séra (Jackson). Sklíčka sa inkubovali cez noc (4 stupne) v králičej protilátke proti HDAC3 (1:250, Abcam, klon Y415, ab32369) alebo V5 (1:1000, Abcam, ab9116), alebo v kuracej protilátke proti GFP (1:250, Aves Labs, #GFP1010). Nasledujúci deň sa sklíčka premyli a inkubovali 1 hodinu pri teplote miestnosti s kozím anti-králičím Alexa 488 (HDAC3 a V5; 1:1000, ThermoFisher, #A-11008) alebo kozím anti-kuracím Alexa 488 (GFP ; 1:1000, ThermoFisher, #A-11039) v tme. Sklíčka sa potom premyli PBST a inkubovali sa 50 mv NeuroTrace 530/615 (1:50; ThermoFisher, #N21482), fluorescenčnom nissl farbení. Na potlačenie nešpecifickej autofluorescencie51 sa plátky potom premyli v PBS s 0,01 % Tritonom, opláchli sa vo vode a inkubovali sa 10- min v 10 mM CuS04 v 50 mM tlmivom roztoku octanu amónneho. Plátky sa opäť opláchli vo vode, premyli v PBS a prekryli montážnym médiom VectaShield Antifade (Vector Laboratories).

Všetky obrázky boli získané pomocou skenera Olympus Scanner VS110 s 20x apochromatickým objektívom (numerická apertúra 0,75) so softvérom skenera VS110. Všetky liečené skupiny boli zastúpené na každom sklíčku a všetky obrázky na sklíčku boli zachytené s rovnakým expozičným časom za nesaturujúcich podmienok. Intenzita imunoznačenia bola kvantifikovaná pomocou ImageJ vzorkovaním optickej hustoty bunkovej vrstvy v CA1 a odčítaním vzorky fluorescencie pozadia na rovnakom obrázku. Vo všetkých experimentoch s AAV boli zvieratá, ktoré nedokázali exprimovať vírus v oblasti CA1 dorzálneho hipokampu, z analýz vylúčené. Zobrazovanie a kvantifikáciu uskutočňovali experimentátori slepí k experimentálnym podmienkam.

Western blot. Na overenie knockdownu PER1 boli myši Per1 siRNA a kontrolná siRNA obetované 2 hodiny po testovaní a mozgy boli bleskovo zmrazené. Mozgy boli koronálne narezané a z 500 μm rezov boli odobraté 1 mm DH razníky. Raznice sa homogenizovali v T-PER pufri (Thermo Fisher) s Halt proteázou a inhibítorom fosfatázy (Thermo Fisher) s použitím homogenizátora Dounce. Proteínové lyzáty sa kvantifikovali pomocou modifikovaného Bradfordovho testu (BioRad) a 5 0 ug celkového proteínového lyzátu sa nanieslo do každej dráhy 7,5 % NuPAGE Bis-Tris gélu (Thermo Fisher). Gély bežali 50 minút pri 200 voltoch a bloty sa preniesli cez noc pri 15 V pri 4 stupňoch na nitrocelulózové membrány (Novexi, LC2001). Nasledujúci deň boli membrány inkubované v blokovacom pufri počas 1 hodiny (5 percent odtučneného mlieka v Tris-pufrovanom fyziologickom roztoku s 0,01 percentami Tween 20), premyté (0,1 percenta Tween 20 v TBS) a potom inkubované v primárnej protilátke (1:500, králičie anti-Per1, Thermo Fisher #PA1-524) v primárnom protilátkovom pufri (3 percentá BSA v TBS s 0,1 percentami Tween) cez noc pri 4 stupňoch. Membrány sa potom premyli a inkubovali v HRP-konjugovanej myšacej protilátke proti králikovi (1:10, 000, Jackson Laboratories, špecifické pre ľahký reťazec, #211-032-171) počas 1 hodiny. Membrány sa premyli a vyvolali s použitím chemiluminiscenčného substrátu Pierce SuperSignal West Pico (Pierce, 34077). Na overenie linearity sa použili viacnásobné filmové expozície. Bloty sa premyli a stripovali 10 m pomocou Restore Western Blot Stripping Buffer (Thermo Fisher #21059), znova sa premyli a potom sa cez noc znova sondovali (4 stupne) s králičou protilátkou proti GAPDH (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, SC25778 ). Bloty PER1 a GAPDH s plnou dĺžkou sú znázornené na doplnkovom obrázku 5. Relatívne optické hustoty boli vypočítané z naskenovaného filmu pomocou ImageJ (Národné inštitúty zdravia USA) experimentátorom, ktorý nevidel experimentálne podmienky. Všetky hodnoty boli normalizované na hladiny expresie GAPDH.

qRT-PCR. Tkanivo bolo odobraté z DH razidiel (opísaných vyššie) a zmrazené pri -80 stupňoch až do spracovania. RNA sa izolovala pomocou RNeasy Minikit (Qiagen, #74104) a cDNA sa vytvorila pomocou súpravy Transcriptor First Strand cDNA Synthesis kit (Roche, 04379012001). Priméry a sondy boli odvodené z Roche Universal ProbeLibrary (tabuľka S4) a boli použité na multiplexovanie v stroji Roche Light-Cycle 480 II (Roche). Všetky hodnoty boli normalizované na Gapdh. Analýzy a štatistiky boli uskutočnené pomocou vlastných algoritmov Roche a softvéru REST 2009 založeného na metóde Pfafffl52,53.

RNA sequencing. RNA was isolated from dorsal hippocampus punches as described above, using the RNeasy Minikit (Qiagen, 74104). RNA quality was assessed by Bioanalyzer and samples with an RNA integrity number >9 bolo zahrnutých do našej analýzy. cDNA knižnice pre každú skupinu boli pripravené podľa TruSeq RNA Sample Preparation Guide (Illumina). Dvestopäťdesiat nanogramov celkovej RNA z každej myši sa purifikovalo pomocou poly-T oligo-naviazaných magnetických guľôčok a tepelne fragmentovalo. Potom sa syntetizoval a purifikoval prvý a druhý reťazec cDNA. Po zatupení koncov bol 3' koniec adenylovaný, aby sa zabránilo zreťazeniu templátu počas ligácie adaptéra. Pre každú skupinu sa na konce cDNA pridala jedinečná sada adaptérov a knižnice sa amplifikovali pomocou PCR. Kvalita knižnice bola hodnotená Bioanalyzerom a kvantifikovaná pomocou qRT-PCR so štandardnou krivkou pripravenou z komerčnej sekvenačnej knižnice (Illumina). Vzorky boli multiplexované, pričom každá behaviorálna skupina bola zastúpená v každej prietokovej bunke sekvenátora. 10 nM z každej knižnice sa spojilo v štyroch multiplexných knižniciach a sekvenovalo sa na prístroji Illumina HiSeq 2500 počas sekvenovania s veľkosťou 50 bp na jedno čítanie, ktoré vykonávalo Genomic High-throughput Facility na University of California, Irvine. Výsledné sekvenčné údaje pre každú knižnicu boli následne spracované, aby sa vytvorili súbory FastQ. Údaje sa potom demultiplexovali a filtrovali pomocou softvéru Illumina CASAVA 1.8.2, ako aj vlastného softvéru. Hodnoty nízkej kvality (neúspešné v štandardných testoch kvality spoločnosti Illumina) a kontrolné hodnoty úspešne zarovnané s kontrolným genómom PhiX boli odstránené z analýz. Kvalita zostávajúcich sekvencií bola ďalej hodnotená pomocou skóre kvality PHRED produkovaných v reálnom čase počas základného kroku sekvenovania (doplnkový obrázok 3a).

Zarovnanie s referenčným genómom a transkriptómom. Čítania z každého experimentu boli oddelene zarovnané s referenčným genómom a zodpovedajúcim transkriptómom pomocou vyrovnávacích zariadení na krátke čítanie ELAND v2e (Illumina) a Bowtie24. Čítania jedinečne zarovnané oboma nástrojmi so známymi exónmi alebo zostrihovými spojeniami s nie viac ako dvoma nezhodami na akomkoľvek 25 bp fragmente čítania boli zahrnuté do transkriptómu. Hodnoty jedinečne zarovnané, ale s viac ako dvoma nezhodami na akomkoľvek 25 bp fragmente čítania boli odstránené z analýz. Podobne boli z analýzy odstránené hodnoty zodpovedajúce niekoľkým miestam v referenčnom genóme. Percento čítaní priradených referenčnému genómu a transkriptómu pomocou tohto protokolu sa uvádza pre každú skupinu replikátov (doplnkový obrázok 3b). Výsledkom bolo v priemere približne 30 miliónov čítaní na vzorku.

Na overenie prítomnosti plazmidov pLVX a CRISPR-SAM po lentivírusovej infúzii sme vykonali sekvenovanie RNA na hipokampálnych vzorkách z podskupiny troch zvierat na skupinu podľa správania. Keďže počet buniek infikovaných lentivírusmi in vivo bol príliš malý na to, aby spoľahlivo detegoval prítomnosť vhodných transkriptov pomocou RT-qPCR (doplnkový obrázok 6a, d), použili sme RNA-seq ako citlivejšiu metódu na detekciu prítomnosti týchto prepisov. Aktualizovaná verzia zostavy genómu a anotácie genómu boli zostavené pripojením sekvencií a anotácie plazmidových konštruktov k pôvodnému mm10 myšaciemu genómu a k mm10 myšaciemu genómu, v danom poradí. Pomocou nástroja na zarovnanie čítania TopHat v Tuxedo Suite54 sa čítania mapovali do genómu a iba zásahy, ktoré boli jedinečné pre plazmidové transkripty v porovnaní s endogénnym myšacím referenčným genómom, sa považovali za "zhodné čítania" s plazmidovými konštruktmi. Počet týchto zhodných čítaní sa potom kvantifikoval pre každý konštrukt pre každú vzorku.

Génová expresia a diferenciálna analýza. Úrovne génovej expresie sa priamo vypočítali z výsledkov čítania zoradenia pre každý replikát. Štandardné hodnoty RPKM55, odčítania na kilobázu exónového modelu na milión mapovaných čítaní) boli extrahované pre každý gén pokrytý sekvenčnými údajmi a každý replikát použitý v tejto štúdii.

Diferenciálne transkripčné analýzy sa uskutočňovali pomocou Cyber ​​T56, 57 v každom páre skupín (domáca klietka verzus 60 m po tréningu), aby sa identifikovali gény regulované smerom nahor alebo nadol po OLM. Okrem 18-mesačných myší HDAC3 plus/plus a HDAC3flox/flox trénovaných na súčasnú štúdiu boli identicky spracované údaje o sekvenovaní RNA od {{10}}mesačných myší divokého typu C57 ( homecage a OLM-trénovaný rovnakým spôsobom ako súčasná štúdia) z predchádzajúcej štúdie20 sa použil na diferenciálne analýzy. Počet zvierat (biologické replikáty) pre každú skupinu bol: mladý HDAC plus / plus HC: 6, mladý HDAC3 plus / plus OLM: 6, starý HDAC3 plus / plus HC: 6, starý HDAC3 plus / plus OLM: 6, starý HDAC3flox/flox HC: 8, staré HDAC3flox/flox OLM: 8. Neboli použité žiadne technické repliky. Prah p-hodnoty použitý na stanovenie diferenciálnej expresie je 0,05 pre všetky skupiny. Miera falošného objavenia (FDR) meraná pomocou Benjaminiho & Hochberga (BH) q-hodnota sa použila na korekciu pre viacnásobné testovanie s prahom FDR 0,15. Súbory génov upregulovaných po skúsenostiach (v porovnaní s domácou klietkou) pre tieto 3 skupiny (mladý divoký typ, starnúci HDAC plus/plus alebo starnúci HDAC3flox/flox) sa pretínali, aby sa určili gény spoločné pre dve alebo viac skupín. Obohatenie každej skupiny pre tkanivovo špecifickú expresiu, termíny génovej ontológie58 a KEGG dráhy59,60 sa hodnotilo pomocou DAVID61 na základe rozdielne exprimovaných génov po správaní. Vizualizácia údajov bola vykonaná pomocou "matplotlib" pre python a "ggplot" pre R.

Imunoprecipitácia chromatínu. ChIP sa uskutočnil na DH razidlách na základe protokolu zo súpravy Millipore ChIP11,12,62. Tkanivo bolo zosieťované 1 percentom formaldehydu (Sigma), lyzované a sonikované a chromatín bol cez noc imunoprecipitovaný s 2 ul anti-H4K8Ac (Millipore #17-10099) alebo 4 ul anti-HDAC3 (Millipore #{{ 13}}) alebo ekvivalentné množstvo normálneho králičieho séra (H4K8Ac negatívna kontrola, Millipore) alebo anti-myšieho IgG (HDAC3 negatívna kontrola, Millipore). Po premytí bol chromatín eluovaný z guľôčok a reverzne zosieťovaný v prítomnosti proteinázy K pred čistením DNA na kolóne. Sekvencie primérov pre promótory každého génu boli navrhnuté programom Primer 3 (tabuľka S4). Päť ul vstupného imunoprecipitátu anti-H4K8Ac IgG/anti-HDAC3 IgG alebo anti-králičieho/myšieho IgG z každého zvieraťa sa skúmalo v duplikáte. Na normalizáciu údajov ChIP-qPCR sme použili metódu percentuálneho vstupu. Vstupná vzorka sa upravila na 100 percent a vzorky IP aj IgG sa vypočítali ako percento tohto vstupu pomocou vzorca 100*AE^(upravený vstup – Ct(IP)). Násobné obohatenie sa potom vypočítalo ako pomer ChIP k priemernému IgG. Štandardná krivka na platni určila účinnosť amplifikácie (AE).

Príprava a nahrávanie plátkov. Mladým (približne 3- mes.) a starnúcim (18- mes.) myšiam bola stereotaxická infúzia vírusu. V prvom experimente sa mladým a starým myšiam HDAC3 plus/plus a HDAC3flox/flox podala infúzia AAV-CaMKII-Cre bilaterálne do DH. V druhom experimente boli mladým a starým myšiam C57 divokého typu infúzne podané AAV-HDAC3 (Y298H) do DH jednej hemisféry a kontrola AAV-EV do druhej hemisféry. Dva týždne po infúzii (na umožnenie optimálnej expresie vírusu)2 sa priečne hipokampálne rezy (320 μm) umiestnili do interfejsovej záznamovej komory s predhriatou (31 ± 1 stupeň) umelou cerebrospinálnou tekutinou (124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,25 mM KH2P04, 1,5 mM MgS04, 2,5 mM CaCl2, 26 mM NaHC03 a 10 mM D-glukózy). Rezy boli kontinuálne perfundované rýchlosťou 1,75–2 ml za minútu, zatiaľ čo povrch rezov bol vystavený teplému, zvlhčenému 95 % O2/5 % CO2. Záznamy začali po najmenej 2 hodinách inkubácie.

Poľné excitačné postsynaptické potenciály (fEPSP) boli zaznamenané z CA1b stratum radiatum pomocou jedinej sklenenej pipety (2–3 MΩ) naplnenej 2 M NaCl. Stimulačné impulzy (0.05 Hz) boli dodávané do Schafferových kolaterálnych-komisurálnych projekcií pomocou bipolárnej stimulačnej elektródy (krútený nichrómový drôt, 65 μm) umiestnenej v CA1c. Intenzita prúdu bola upravená tak, aby sa získalo 50 percent maximálnej odozvy fEPSP. Potom, čo sa stanovila stabilná základná línia, bol LTP indukovaný jediným sledom piatich théta vzplanutí, v ktorých bol každý vzplanutie (štyri impulzy pri 100 Hz) dodané s odstupom 200 ms (tj pri frekvencii theta). Intenzita stimulácie sa počas TBS nezvýšila. Dáta boli zhromaždené a digitalizované systémom NAC 2.0 Neurodata Acquisition System (Theta Burst).

Štatistická analýza. Štatistické analýzy sa uskutočňovali tak, ako je uvedené v texte a v legendách obrázkov s použitím Prism 6 (GraphPad). Naše analytické prístupy sú založené na predtým publikovaných prácach12,20,63,64. Na predbežné určenie veľkosti vzoriek sa nepoužili žiadne štatistické metódy, ale naše veľkosti vzoriek sú podobné tým, ktoré sa bežne používajú v tejto oblasti, vrátane tých, ktoré sú uvedené v predchádzajúcich publikáciách12, 20, 64, 65. Predpokladalo sa, že distribúcia údajov je normálna, s podobným rozptylom pozorovaným medzi skupinami, ale toto nebolo formálne testované. Keď mal experiment na porovnanie dve skupiny, použili sa dvojstranné Studentove t-testy. Keď sa porovnávali dva faktory (ako je vek a genotyp alebo relácia a skupina), údaje sa analyzovali pomocou dvojcestných ANOVA, po ktorých nasledovali Sidakovo viacnásobné porovnania post hoc. Všetky analýzy sú obojstranné s hodnotou 0,05 vyžadovanou pre významnosť. Chybové úsečky na všetkých obrázkoch predstavujú SEM. Pre všetky experimenty boli hodnoty ± 2 SD od priemeru skupiny považované za odľahlé hodnoty a boli odstránené z analýz.

Dostupnosť údajov. Údaje podporujúce zistenia tejto štúdie sú dostupné od príslušného autora na základe primeranej žiadosti. Údaje o sekvenovaní RNA boli uložené v NCBI Gene Expression Omnibus a sú dostupné prostredníctvom prístupového čísla GEO Series GSE94832.

Referencie

1. Deibel, SH, Zelinski, EL, Keeley, RJ, Kovalchuk, O. & McDonald, RJ Epigenetické zmeny v suprachiazmatickom jadre a hipokampe prispievajú ku kognitívnemu poklesu súvisiacemu s vekom. Oncotarget 6, 23181–23203 (2015).

2. Gerstner, JR & Yin, JC Cirkadiánne rytmy a formovanie pamäti. Nat. Neurosci. 11, 577-588 (2010).

3. Eckel-Mahan, KL a kol. Cirkadiánna oscilácia hipokampálnej aktivity MAPK a cAmp: dôsledky pre pretrvávanie pamäte. Nat. Neurosci. 11, 1074 – 1082 (2008).

4. Chaudhury, D. & Colwell, CS Cirkadiánna modulácia učenia a pamäte u myší podmienených strachom. Správaj sa. Brain Res. 133, 95-108 (2002).

5. Kondratová, AA & Kondratov, RV Denné hodiny a patológia starnutia mozgu. Nat. Neurosci. 13, 325 – 335 (2012).

6. Rawashdeh, O., Jilg, A., Maronde, E., Fahrenkrug, J. & Stehle, JH Perióda 1 ohraničuje cirkadiánnu moduláciu pamäťovo relevantnej signalizácie v myšom hipokampe reguláciou jadrového presunu CREB kinázy pP90RSK. J. Neurochem. 138, 731 – 745 (2016).

7. Penner, MR, Roth, TL, Barnes, CA & Sweatt, JD Epigenetická hypotéza kognitívnej dysfunkcie súvisiacej so starnutím. Predné starnutie Neurosci. 2, 9 (2010).

8. Peleg, S. a kol. Zmenená acetylácia histónov je spojená s poruchou pamäti u myší závislou od veku. Science 328, 753–756 (2010).

9. Snigdha, S. a kol. Inhibícia H3K9me3 zlepšuje pamäť, podporuje tvorbu chrbtice a zvyšuje hladiny BDNF v staršom hipokampe. J. Neurosci. 36, 3611 – 3622 (2016).

10. Spiegel, AM, Sewal, AS & Rapp, PR Epigenetické príspevky ku kognitívnemu starnutiu: oddeľovanie mysle a dĺžky života. Naučte sa Mem. 21, 569 – 574 (2014).

11. Malvaez, M. a kol. Selektívny inhibítor HDAC3-trvalým spôsobom zvyšuje zánik správania pri hľadaní kokaínu. Proc. Natl Acad. Sci. USA 110, 2647–2652 (2013).

12. Kwapis, JL a kol. Kontext a sluchový strach sú diferencovane regulované aktivitou HDAC3 v laterálnych a bazálnych subjadrách amygdaly. Neuropsychofarmakológia 42, 1284– 1294 (2017).

13. McQuown, SC a kol. HDAC3 je kritický negatívny regulátor tvorby dlhodobej pamäte. J. Neurosci. 31, 764 – 774 (2011).

14. Bieszczad, KM a kol. Inhibícia históndeacetylázy prostredníctvom RGFP966 uvoľňuje brzdy senzorickej kortikálnej plasticity a špecifickosti tvorby pamäte.J. Neurosci. 35, 13124 – 13132 (2015).

15. Lahm, A. a kol. Rozlúštenie skrytej katalytickej aktivity históndeacetyláz triedy IIa stavovcov. Proc. Natl Acad. Sci. USA 104, 17335 – 17340 (2007).

16. Sun, Z. a kol. Funkcia HDAC3 pri transkripcii a metabolizme nezávislá od deacetylázy vyžaduje korepresor jadrového receptora. Mol. Cela 52, 769-782 (2013).

17. Alaghband, Y. a kol. Odlišné úlohy deacetylázovej domény HDAC3 v hipokampe a mediálnom prefrontálnom kortexe pri tvorbe a zániku pamäte. Neurobiol. Učte sa. Mem. 145, 94 – 104 (2017).

18. Nott, A. a kol. Histón deacetyláza 3 sa spája s MeCP2 na reguláciu FOXO a sociálneho správania. Nat. Neurosci. 19, 1497 – 1505 (2016).

19. Norwood, J., Franklin, JM, Sharma, D. & D'Mello, SR Histón deacetyláza 3 je nevyhnutná pre správny vývoj mozgu. J. Biol. Chem. 289, 34569 – 34582 (2014).

20. Vogel-Ciernia, A. a kol. Neurónovo špecifická chromatínová regulačná podjednotka BAF53b je nevyhnutná pre synaptickú plasticitu a pamäť. Nat. Neurosci. 16, 552 – 561 (2013).

21. Alberini, CM Transkripčné faktory v dlhodobej pamäti a synaptickej plasticite. Physiol. 89, 121 – 145 (2009).

22. Barnes, CA Dlhodobá potenciácia a starnutie mozgu. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B 358, 765-772 (2003).

23. Speir, ML a kol. Databáza UCSC Genome Browser: aktualizácia z roku 2016. Nucleic Acids Res. 44, D717 – D725 (2016).

24. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M. & Salzberg, SL Ultrarýchle a pamäťovo efektívne priradenie krátkych sekvencií DNA k ľudskému genómu. Genome Biol. 10, R25 (2009).

25. Rowe, WB a kol. Analýzy hipokampálnej expresie odhaľujú selektívne spojenie bezprostredných, skorých, neuroenergetických a myelinogénnych dráh s kognitívnym poškodením u starých potkanov. J. Neurosci. 27, 3098-3110 (2007).

26. McNulty, SE a kol. Rozdielne úlohy pre Nr4a1 a Nr4a2 v umiestnení objektu vs. dlhodobá pamäť rozpoznávania objektov. Naučte sa Mem. 19, 588 – 592 (2012).

27. Vecsey, CG, Park, AJ, Khatib, N. & Abel, T. Účinky deprivácie spánku a starnutia na dlhodobú a vzdialenú pamäť u myší. Naučte sa Mem. 22, 197 – 202 (2015).

28. Rawashdeh, O. a kol. PERIOD1 koordinuje hipokampálne rytmy a spracovanie pamäte s denným časom. Hippocampus 24, 712–723 (2014).

29. Jilg, A. a kol. Časová dynamika génovej expresie hipokampálnych hodín u myší podporuje spracovanie pamäte. Hippocampus 20, 377–388 (2010).

30. Eckel-Mahan, KL Cirkadiánne oscilácie v hipokampe podporujú tvorbu pamäte a vytrvalosť. Front Mol. Neurosci. 5, 46 (2012).

31. Guzowski, JF, Setlow, B., Wagner, EK & McGaugh, JL Génová expresia závislá od skúseností v potkanom hipokampe po priestorovom učení: porovnanie bezprostredných skorých génov Arc, c-fos a zif268. J. Neurosci. 21, 5089-5098 (2001).

32. Kouzarides, T. Chromatínové modifikácie a ich funkcia. Cela 128, 693-705 (2007).

33. Konermann, S. a kol. Transkripčná aktivácia na úrovni genómu pomocou skonštruovaného komplexu CRISPR-Cas9. Príroda 517, 583–588 (2015).

34. Sharma, M., Shetty, MS, Arumugam, TV & Sajikumar, S. Inhibícia histónovej deacetylázy 3 obnovuje synaptické označovanie a zachytávanie pri starnutí prostredníctvom aktivácie jadrového faktora kappa B. Sci. Rep. 5, 16616 (2015).

35. Kramár, EA a kol. Synaptické dôkazy o účinnosti priestorového učenia. Proc. Natl Acad. Sci. USA 109, 5121–5126 (2012).

36. Barrett, RM a kol. Hipokampálny fokálny knockout CBP ovplyvňuje špecifické modifikácie histónov, dlhodobú potenciáciu a dlhodobú pamäť. Neuropsychofarmakológia 36, ​​1545– 1556 (2011).

37. Franklin, AV, Rusche, JR & McMahon, LL Zvýšená dlhodobá potenciácia pri mediálnych-perforantných synapsiách dentátových granulových buniek indukovaná selektívnou inhibíciou históndeacetylázy 3 vyžaduje proteín mentálnej retardácie Fragile X. Neurobiol. Učte sa. Mem. 114, 193 – 197 (2014).

38. Silva, AJ, Kogan, JH, Frankland, PW & Kida, S. CREB a pamäť. Annu. Neurosci. 21, 127-148 (1998).

39. Kida, S. & Serita, T. Funkčné úlohy CREB ako pozitívneho regulátora pri tvorbe a zlepšovaní pamäte. Brain Res. Bull. 105, 17-24 (2014).

40. Smith, KT, Nicholls, RD & Reines, D. Gén kódujúci krehký proteín viažuci RNA X je riadený jadrovým respiračným faktorom 2 a rodinou transkripčných faktorov CREB. Nucleic Acids Res. 34, 1205 – 1215 (2006).

41. Wang, H. a kol. Úlohy CREB pri regulácii FMRP metabotropnými glutamátovými receptormi skupiny I v cingulárnej kôre. Mol. Mozog 5, 27 (2012).

42. Cermakian, N., Monaco, L., Pando, MP, Dierich, A. & Sassone-Corsi, P. Zmenené behaviorálne rytmy a expresia hodinového génu u myší s cielenou mutáciou v géne Period1. EMBO J. 20, 3967-3974 (2001).

43. Halder, R. a kol. Zmeny metylácie DNA v génoch plasticity sprevádzajú tvorbu a udržiavanie pamäte. Nat. Neurosci. 19, 102 – 110 (2016).

44. Duke, CG, Kennedy, AJ, Gavin, CF, Day, JJ & Sweatt, JD Epigenomická reorganizácia v hipokampe závislá od skúseností. Naučte sa Mem. 24, 278 – 288 (2017).

45. Sakai, T., Tamura, T., Kitamoto, T. & Kidokoro, Y. Hodinový gén, bodka, hrá kľúčovú úlohu pri tvorbe dlhodobej pamäte u Drosophila. Proc. Natl Acad. Sci. USA 101, 16058 – 16063 (2004).

46. ​​Abarca, C., Albrecht, U. & Spanagel, R. Kokaínová senzibilizácia a odmena sú pod vplyvom cirkadiánnych génov a rytmu. Proc. Natl Acad. Sci. USA 99, 9026-9030 (2002).

47. Phan, TX, Chan, GC, Sindreu, CB, Eckel-Mahan, KL & Storm, DR Denná oscilácia aktivít MAP (mitogénom aktivovaný proteín) kinázy a adenylyl cyklázy v hipokampe závisí od suprachiazmatického jadra. J. Neurosci. 31, 10640 – 10647 (2011).

48. Vogel-Ciernia, A. & Wood, MA Skúmanie polohy objektov a pamäte rozpoznávania objektov u myší. Curr. Protoc. Neurosci. 69, 1 – 17 (2014).

49. Orozco-Solis, R. a kol. Cirkadiánne hodiny vo ventromediálnom hypotalame riadia cyklický výdaj energie. Cell Metab. 23, 467 – 478 (2016).

50. Eckel-Mahan, K. & Sassone-Corsi, P. Fenotypizácia cirkadiánnych rytmov u myší. Curr. Protoc. Mouse Biol. 5, 271 – 281 (2015).

51. Schnell, SA, Staines, WA & Wessendorf, MW Zníženie autofluorescencie podobnej lipofuscínu vo fluorescenčne označenom tkanive. J. Histochem. Cytochem. 47, 719-730 (1999).

52. Pfafffl, MW Nový matematický model relatívnej kvantifikácie v RT-PCR v reálnom čase. Nucleic Acids Res. 29, e45 (2001).

53. Pfafffl, MW, Horgan, GW & Dempfle, L. Softvérový nástroj pre relatívnu expresiu (REST) ​​na skupinové porovnanie a štatistickú analýzu výsledkov relatívnej expresie v PCR v reálnom čase. Nucleic Acids Res. 30, e36 (2002).

54. Trapnell, C. a kol. Analýza diferenciálnej génovej a transkriptovej expresie experimentov RNA-seq s TopHat a Cufflinks. Nat. Protoc. 7, 562 – 578 (2012).

55. Mortazavi, A., Williams, BA, McCue, K., Schaeffer, L. & Wold, B. Mapovanie a kvantifikácia cicavčích transkriptómov pomocou RNA-Seq. Nat. Methods 5, 621-628 (2008).

56. Kayala, MA & Baldi, P. Cyber-T web server: diferenciálna analýza údajov s vysokou priepustnosťou. Nucleic Acids Res. 40, W553 – W559 (2012).

57. Baldi, P. & Long, AD Bayesovský rámec pre analýzu údajov o expresii mikročipov: regularizovaný t-test a štatistické závery o zmenách génov. Bioinformatics 17, 509-519 (2001).