ČASŤ 2 Izolácia a identifikácia fenyletanoidných glykozidov z Aloysia Polystachya a jej aktivity ako inhibítorov monoaminooxidázy-A

Aký je dôvod, prečo môžu Cistanche Actosidy inhibovať aktivitu enzýmov?

Princíp antioxidačného účinku Cistanche

Pre viac informácií kontaktujte:joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola má mnoho účinkov, kliknite sem a dozviete sa viac

Separácia a identifikácia zložiek pomocou ultravýkonnej kvapalinovej chromatografie-hmotnostnej spektrometrie

Chromatografické analýzy sa uskutočňovali s použitím systému Waters Acquity UPLC H-Class vybaveného detektorom diódového poľa (DAD) a tandemovým kvadrupólovým hmotnostným spektrometrom Waters Xevo TQ-S so Z-sprejovým zdrojom pracujúcim v režime negatívnych iónov. Zásobné roztoky obsahujúce 10mg/ml extraktu alebo štandardovakteozid, izoakteozid, 6'-acetylakteozida 4',4''',5,5''-tetrahydroxy-6,6'',3'''-trimetoxy-[C7–O–C7'']-biflavón v metanole kvality LC boli pripravené oddelene, v prípade potreby sonikáciou na 30minúty, a prefiltrované cez 0.45μm filtre Millipore (Merck Millipore). Roztoky sa zriedili na 10ug/ml metanolom a alikvóty (5μl) sa vstrekli na kolónu Sigma-Aldrich Ascentis Express C18 (1{{30}}}0 x 4,6 mm id; veľkosť častíc 2,7 um). Mobilná fáza pozostávala z vody obsahujúcej 0,1 percenta kyseliny mravčej (rozpúšťadlo A) a metanolu obsahujúceho 0,1 percenta kyseliny mravčej (rozpúšťadlo B) dodávané s prietokovou rýchlosťou 0,5 ml/min podľa elučného profilu: izokratický s 3 percentami B medzi 0 a 4 min, nasledovali lineárne gradienty od 3 do 60 percent B medzi 4 a 19 min a od 60 do 90 percent B medzi 19 a 23 min a nakoniec sa vrátili na 3 percentá B medzi 23 a 28 min. Výtok bol monitorovaný DAD v rozsahu 210 až 720 nm a MS s optimalizovaným zdrojom a prevádzkovými parametrami nasledovne: kapilárne napätie 2,50 kV, teplota zdroja Z-spreja 150 stupňov, teplota desolvatácie (N2) 350 stupňov, prietok desolvatačného plynu 600 l/h a hmotnostný rozsah m/z 150 až 600 v režime úplného skenovania.

Purifikácia identifikovaných zložiek

Surový hydroetanolický extrakt (10 g) sa rozpustil v zmesi voda:etanol (50:50; obj./obj.) a rozdelil sa postupne medzi hexán, etylacetát a n-butanol. Butanolová frakcia sa skoncentrovala na rotačnej odparke a 3 g vzorka frakcionovaného extraktu sa naniesla na sklenenú kolónu (10 x 3 cm od) naplnenú C-18 RP silikagélom (230-400 sito; Sigma -Aldrich) a eluoval sa vodou, po ktorej nasledovali po sebe nasledujúce zmesi voda:metanol (90:10, 50:50 a 10:90; v/v). Subfrakcia získaná elúciou zmesou voda:metanol (90:10; obj./obj.) sa ďalej purifikovala pomocou RP-HPLC s použitím systému Shimadzu LC-20AP spojeného s detektorom SPD-20A UV/Vis a vybavené kolónou Phenomenex Luna® C-18 (250 x 10 mm vnútorný priemer; veľkosť častíc 5 μm). Mobilnou fázou bola voda:metanol so začiatkom v pomere 90:10 (obj./obj.) a zmenou na 30:70 (obj./obj.) v priebehu 100 minút, čím sa získali štyri známe zlúčeninyakteozid(750 mg), izolovaná strana (430 mg), 6'-acetylakteozid(42 mg) a 4',4''',5,5''-tetrahydroxy-6,6'',3'''-trimetoxy-[C7–O–C7'']-biflavón ( 13 mg). Prietok mobilnej fázy bol 1 ml/min, objem nástreku bol 500 ul, chromatogram sa zaznamenával pri 340 nm a UV spektrá sa získali v rozsahu 240 až 400 nm. Identita purifikovaných zložiek bola potvrdená z ich 1H- (500 MHz) a 13C-NMR (125 MHz) spektier zaznamenaných na spektrometri Bruker model DPX 500 a porovnaním údajov s údajmi dostupnými v literatúre [18, 19, 41]. Čistoty izolovaných zlúčenín boli potvrdené pomocou UPLC-DAD-MS (▶Obr. 1b–da NMR (6Obr. S1–S12, Podporujúce informácie).

Kvantifikáciaakteoziddetektorom HPLC-diódového poľa

Vzorka (1 mg) vysušeného hydroetanolového extraktu sa znovu rozpustila v 1 ml zmesi (80:20; v/v) metanolu (JT Baker HPLC grade) a Milli-Q Ultračistá voda (Merck Millipore), sonikovaná 30 min a prefiltrovaná cez 0.45-μm filter Millipore. Alikvóty (20 ul) tohto roztoku sa analyzovali na systéme Shimadzu LC-10APvp pripojenom k ​​SPD-M10Avp DAD a opatrenému stĺpcom Phenomenex Luna C18 (250 x 4,6 mm id, 5 µm) chráneným Phenomenex C18 predkolóna (4,0 x 3,0 mm vnútorný priemer, 5 um). Separácie sa uskutočnili pri teplote miestnosti (22 ± 1 stupeň) s použitím mobilnej fázy obsahujúcej kyselinu octovú 0,1 percenta vo vode (rozpúšťadlo A) a metanol (rozpúšťadlo B;

JT Baker HPLC grade) dodávaný pri konštantnom prietoku 1.0 ml/min podľa programu: lineárny gradient od 10 do 70 percent B medzi 0 a 32 min, od 70 do 10 percent B medzi 32 a 35 minútami a konečná izokratická elúcia s 10 percentami B medzi 35 a 40 minútami. Detekčná vlnová dĺžka bola nastavená na 330 nm.

Obsahakteozidv extrakte bol odhadnutý pomocouakteozid(Sigma-Aldrich; CAS č. 61276-17-3) ako externý štandard. Pripravili sa roztoky obsahujúce 500, 250, 125, 62,5, 31,2 a 15,6 ug/ml referenčného štandardu a zostrojili sa kalibračné krivky podrobením každého roztoku trojitej analýze HPLC [42]. Pomer plochy píku štandarduakteozidna zodpovedajúcu koncentráciu analytu bola stanovená lineárnou regresiou štandardných kriviek (▶Obr. S13, Podporujúce informácie). Analytické údaje boli validované s ohľadom na linearitu, presnosť a presnosť podľa smerníc vydaných Agência Nacional de Vigilância Sanitária [42]. Limity detekcie (LoD) a kvantifikácie (LoQ).akteozidboli {{0}},30 a 0,92 ug/ml, v danom poradí.

Testy inhibície monoaminooxidázy-A

Rekombinantný ľudský MAO-A, tyramín, klorgylín, kyselina vanilka, 4-aminoantipyrín a chrenová peroxidáza boli zakúpené od Sigma-Aldrich. Testy inhibície MAO-A sa uskutočňovali s použitím 96-jamkových doštičiek podľa modifikovanej verzie metódy opísanej Lópezom a kol. [43]. Do každej jamky bolo nanesených 50 μl chromogénneho roztoku (0,8 mM kyselina vanilka, 2,5 mM 4-aminoantipyrín a 4 U/ml chrenovej peroxidázy vo fosfátovom pufri pri pH 7,6), 100 μl 3 mM tyramínu a 50-μl alikvótu surového hydroetanolového extraktu alebo jedného z purifikovaných fenyletanoidov rozpustených v metanole. Nakoniec sa do každej jamky pridali 50 ul alikvóty 8 U/ml MAO-A a doštička sa inkubovala pri 37 stupňoch počas 30 minút, počas ktorých sa každých 5 minút zaznamenávali absorbancie pomocou čítačky mikrodoštičiek. Clorgylín (väčší alebo rovný 97 percent GC; Sigma-Aldrich) a metanol boli zahrnuté ako pozitívne a negatívne kontroly na každej testovacej doštičke.

Štatistická analýza

Uskutočnili sa tri nezávislé hodnotenia inhibičných aktivít MAO-A a získané údaje sa analyzovali pomocou softvéru Graph-Pad Prism. IC₅₀hodnoty hydroetanolového extraktu, purifikovaných fenyletanoidov a pozitívnej kontroly sa vypočítali nelineárnou regresiou, simulujúc grafy log (koncentrácia inhibítora) proti normalizovanému percentu inhibície.

Podporujúce informácie

H- a13C-NMR spektráakteozid, izoakteozid, 6'-acetylakteozid a 4,4,5,5-tetrahydroxy-6,6,3 trimetoxy-[C7–O– C7'']-biflavón a korelačné analýzy HSQC/HMBC pre tri fenyletanoidy sú dostupné ako podporné informácie.

Referencie

[1] Svetová zdravotnícka organizácia. Depresia a iné bežné duševné choroby

Poruchy: Globálne odhady zdravia. Ženeva: WHO; 2017

[2] Ferguson JM. SSRI antidepresíva: Nežiaduce účinky a znášanlivosť. Prim Care Companion J Clin Psychiatry 2001; 3: 22–27

[3] van der Watt G, Laugharne J, Janca A. Doplnková a alternatívna medicína v liečbe úzkosti a depresie. Curr Opin Psychiatry 2008; 21: 37-42

[4] Sarris J, McIntyre E, Camfield DA. Rastlinné lieky na úzkostné poruchy, časť 1: Prehľad predklinických štúdií. CNS Drugs 2013; 27: 207-219

[5] Sarris J, McIntyre E, Camfield DA. Rastlinné lieky na úzkostné poruchy, časť 2: Prehľad klinických štúdií s podpornými predklinickými dôkazmi. CNS Drugs 2013; 27: 301-319

[6] Del Vitto LA, Petenatti EM, Petenatti ME. Recursos herbolarios de San Luis (República Argentína). Hlavná časť: Plantas Nativas. Multekvina 1997; 6: 49-66

[7] González Y, Arrúa RD, Rojas GD, García MG. Etnofarmacobotánica foliar de "burrito",Aloysia polystachya (Griseb.) Moldenke (Verben- aceae), cultivado en Paraguay. Rojasiana 2014; 13: 31-41

[8] Mora S, Díaz-Véliz G, Millán R, Lungenstrass H, Quirós S, Coto-Morales T, Hellión-Ibarrola MC. Anxiolytické a antidepresívne účinky hydroalkoholového extraktu zAloysia polystachyau potkanov. Pharmacol Biochem Behav 2005; 82: 373-378

[9] Hellión-Ibarrola MC, Ibarrola DA, Montalbetti Y, Kennedy ML, Heinichen O, Campuzano M, Tortoriello J, Fernández S, Wasowski C, Marder M, De Lima TCM, Mora S. Anxiolytické účinkyAloysiapolystachya(Griseb.) Moldenke (Verbenaceae) u myší. J Ethnopharmacol- col 2006; 105: 400-408

[10] Hellión-Ibarrola MC, Ibarrola DA, Montalbetti Y, Kennedy ML, Heinichen O, Campuzano M, Ferro EA, Alvarenga N, Tortoriello J,

De Lima TCM, Mora S. Účinky podobné antidepresívamAloysiapolystachya(Griseb.) Moldenke (Verbenaceae) u myší. Fytomedicína 2008; 15: 478-483

[11] Herraiz T, González D, Ancín-Azpilicueta C, Arán VJ, Guillén H.

-Karbolínové alkaloidy v Peganum harmala a inhibícia ľudskej monoaminooxidázy (MAO). Food Chem Toxicol 2010; 48: 839-845

[12] Herraiz T, Guillén H, Arán VJ, Salgado A. Identifikácia, výskyt a aktivita chinazolínových alkaloidov v Peganum harmala. Food Chem Toxicol 2017; 103: 261-269

[13] Herraiz T, Guillén H. Inhibícia monoaminooxidázy-A a súvisiaca antioxidačná aktivita v rastlinných extraktoch s potenciálnym antidepresívnym účinkom. Bio-Med Res Int 2018; 1018: 4810394

[14] Carradori S, D'Ascenzio M, Chimenti P, Secci D, Bolasco A. Selektívne inhibítory MAO-B: Poučenie z prírodných produktov. Mol Divers 2014; 18: 219-243

[15] Fajemiroye JO, Silva DM, Oliveira DR, Costa EA. Liečba úzkosti a depresie: Liečivé rastliny v retrospektíve. Fundam Clin Pharmacol 2016; 30: 198-215

[16] Fišar Z. Drogy súvisia s aktivitou monoaminooxidázy. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry 2016; 69: 112-124

[17] Naoi M, Maruyama W, Shamoto-Nagai M. Monoaminooxidáza typu A a serotonín sa koordinovane podieľajú na depresívnych poruchách: od nerovnováhy neurotransmiterov po poruchu neurogenézy. J Neural Transm 2017; 125: 53-66