Časť 2: Odtok horčíka z buniek Drosophila Kenyon je rozhodujúci pre normálnu dlhodobú pamäť vylepšenú diétou

pre viac informácií:{0}}

Pls kliknite na ňu do časti 1

Prosím, kliknite na ňu do časti 3

Kliknite naCistanche tubulosa prášok na pamäť

Úloha uex v telách húb

Na lokalizáciu uex v mozgu sme najskôr využili transgénne muchy VT23256-GAL4, v ktorých je GAL4 poháňaný sekvenciou 853 bp z prvého intrónu uex (Kvon et al., 2014). VT23256-riadený UAS-EGFP odhalil obmedzenú expresiu v ab KC s obzvlášť silnou značkou v ab core (abc) neurónoch (obrázok 3A). Použili sme tiež CRISPR na vloženie C-terminálnej značky HA-epitopu do otvoreného čítacieho rámca uex (obrázok 3 - doplnok k obrázku 1A). Tieto muchy boli životaschopné ako homozygoti, čo naznačuje, že výsledný fúzny proteín UEX::HA si zachováva funkciu. Imunofarbenie múch nesúcich tento lokus uex::HA s protilátkou anti-HA odhalilo výrazné značenie všetkých hlavných tried KC v MB, okrem nižšej expresie v mozgu (obrázok 3B). Tento profil expresie uex podporujú aj analýzy sekvenovania jednotlivých buniek (obrázok 3 – doplnok k obrázku 1B; Croset a kol., 2018; Davie a kol., 2018). Vzhľadom na zavedenú úlohu ab KC v čuchovom LTM (Pascual a Pre'at, 2001; Yu a kol., 2006; Krashes a kol., 2007; Krashes a Waddell, 2008), usúdili sme, že mnemotechnická úloha pre UEX môže zahŕňať vyjadrenie v KC.

Ďalej sme použili GAL4-riadenú expresiu RNAi na testovanie, či 24 hodPamäťpožadovaný výkon uex v MB. Muchy exprimujúce uexRNAi (Perkins a kol., 2015) vo všetkých ab KC (c739-GAL4; Yang a kol., 1995; Perisse a kol., 2013) alebo iba v abc KC (NP7175- GAL4; Tanaka a kol., 2008) vykazovali normálne okamžitéPamäťale výrazne narušená 24-hodinová pamäť (obrázok 3C). Naproti tomu expresia uexRNAi na povrchu ab (abs, 0770-GAL4; Parisse a kol., 2013) alebo a0 b0 KCs (c305a-GAL4; Krashes a kol., 2007) významne nezmenili okamžitú výkonnosť ani výkonnosť LTM. Normálna 24-hodinová chuť do jedlaPamäťvýkon je preto obzvlášť citlivý na expresiu uex v abc neurónoch. Na zníženie pravdepodobnosti, že uexRNAi spojený s pamäťovým defektom je výsledkom vývojového dôsledku, sme tiež obmedzili expresiu UAS-uexRNAi na dospelosť pomocou GAL80ts-sprostredkovanej časovej kontroly (McGuire et al., 2003). Pri permisívnych 18 °C sa GAL80ts viaže na GAL4 a potláča jeho funkciu transkripčného aktivátora. Pri reštriktívnych 30 °C sa GAL80ts už nemôže viazať na GAL4, čo uvoľňuje GAL4 na priamu expresiu UAS-uexRNAi transgénu. Muchy boli chované vývojom pri 18 °C a po eklózii sa posunuli na 30 °C. Obmedzenie expresie UAS-uexRNAi na ab KC u dospelých múch pomocou c739-GAL4 s GAL80ts produkovalo podobnú 24-hodinovú špecifickosťPamäťdefekt oproti tomu, ktorý sa pozoroval, keď bol UAS-uexRNAi exprimovaný bez časovej kontroly (obrázok 3D–F). Hodnotili sme účinnosť knockdown UAS-uexRNAi pomocou nášho označeného lokusu uex::HA. Mozgy z heterozygotných uex::HA múch exprimujúcich uexRNAi v ab a g KC s MB247-GAL4 (Zars et al., 2000) boli imunofarbené s použitím anti-HA protilátky. Porovnanie intenzity imunoznačenia v mozgoch z uex::HA; MB247-GAL4/uexRNAi letí s tým z uex::HA; MB247-GAL4/ plus muchy ukázali, že expresia uexRNAi významne znížila signál anti-HA v ab a g KC (obrázok 3G a H). Tento výsledok demonštruje účinnosť transgénu uexRNAi a užitočnosť lokusu uex::HA upraveného CRISPR/Cas9.

Ďalej sme testovali, či sa expresia v špecifických KC transgénu UAS-uex môže obnoviť 24 hodínPamäťkapacita na uexMI01943 lieta.Pamäťvýkonnosť múch uexMI{{10}}1943 vyjadrujúcich UAS-uex v ab a g KC (MB247-GAL4; Zars et al., 2000) alebo iba ab KCs (c{{5 }}GAL4) sa výrazne zlepšila v porovnaní s muchami uexMI01943 a bola štatisticky nerozoznateľná od kontrol s neporušeným lokusom uex (obrázok 4A). Naproti tomu expresia UAS-uex v a0b0, abc alebo abs KCs sa neobnovilaPamäťvýkon muchám uexMI01943 a nadmerná expresia uex v ab KC muchov divokého typu nezvýšila 24-hodinovú pamäť (obrázok 4A a B). Normálne 24 hodPamäťvýkon by sa mohol obnoviť aj na muchy uexMI01943, ak by sa expresia UAS-uex obmedzila na neuróny c739-GAL4 (všetky ab KC) v dospelosti pomocou dočasnej kontroly sprostredkovanej GAL80ts (obrázok 4C a D). Spoločne tieto experimenty so stratou funkcie RNAi a obnovou ukazujú, že UEX hrá dôležitú úlohu u dospelých

Obrázok 3. Zníženie expresie uex v ab Kenyon bunkách (KCs) zhoršuje LTM. (A) Fragment promótora uex-GAL4 riadi expresiu GFP v abc KC. Anti-GFP imunofarbený uex-GAL4 (VT23256); Linka UAS-EGFP. (B) Anti-HA imunofarbenie mozgov s CRISPR/Cas9-editovaným lokusom uex::HA

ukazuje silné označenie UEX vo všetkých hlavných pododdeleniach tela huby (MB). Mierka 20 mm. (C) RNAi knockdown uex vo všetkých ab (c739- GAL4) alebo len abc (NP7175-GAL4) KC špecificky narušených 24 hodínPamäť. abs ({{0}}GAL4) alebo a0 b0 (c305a-GAL4) KC výraz nemal žiadny účinok (p<0.05, figure="" 3="" continued="" on="" next-figure="" 3="">

ANOVA, n=6–10 okamžite a n=8–14 na 24 hodínPamäť). (D) Defektný LTM bol pozorovaný, ak bola expresia uexRNAi obmedzená na ab KC dospelých múch pomocou dočasnej kontroly sprostredkovanej GAL80ts. (E) Výkon LTM nebol ovplyvnený, ak bol uexRNAi po celý čas potlačený a (F) Výkon LTM bol obnovený na normálnu úroveň, ak bola expresia uexRNAi opätovne potlačená na 3 dni (p<0.05, anova,="" n="6" for="" immediate="" and="" n="8" for="" 24="" hr="" memory).="" (g)="" immunostaining="" shows="" the="" effectiveness="" of="" uexrnai.="" fluorescence="" intensity="" in="" the="" ab="" and="" globes="" of="" uex::ha="" flies="" decreased="" significantly="" when="" uas-uexrnai="" was="" expressed="" with="" mb247-gal4.="" scale="" bars="" 20="" mm.="" (h)="" quantification="" of="" fluorescence="" intensity="" in="" g=""><0.05, t-test,="" n="6–8)." the="" online="" version="" of="" this="" article="" includes="" the="" following="" figure="" supplement(s)="" for="" figure="">

Dodatok k obrázku 1. Konštrukčná schéma pre čiaru uex::HA a grafy tSNE vyjadrenia uex.

ab KCs. Zistenie, že knockdown abc RNAi uex produkuje aPamäťdefekt (obrázok 3C), ale expresia UAS-uex v abc nezachráni mutantný defekt uexMI01943 (obrázok 4A) naznačuje, že funkcia UEX v abc KC je nevyhnutná pre apetitívny LTM, zatiaľ čo abc aj abs KC musia mať funkčný UEX na podporu LTM. Okrem toho schopnosť UAS-uex obnoviť výkon muchám uexMI0194 poskytuje ďalšiu podporu, že uex je zodpovedný zaPamäťzhoršenie múch uexMI01943.

uex výraz v MB podporuje Mg2 plus -vylepšenéPamäť

Ďalej sme skúmali, či sa môže zlepšiť Mg2 plus kŕmenie (4 dni s 80 mM MgCl2).Pamäťvýkon v muchách s ohrozenou funkciou uex. Muchy nesúce alelu uexMI01943 (obrázok 4F) alebo tie, ktoré exprimujú UAS-uexRNAi v ab KC s c739-GAL4 (obrázok 4E) nevykazovali zvýšenéPamäťpri kŕmení 80 mM MgCl2 v porovnaní s muchami kŕmenými 1 mM MgCl2. Okrem toho sa pamäť vylepšená Mg2 plus obnovila v mutantných muchách uexMI01943, keď sa expresia uex obnovila v ab KC (obrázok 4F). Všetky kontrolné muchy (c739-GAL4, UAS-uexRNAi a UAS-uex) s nerušenou expresiou uex vykazovali výrazne zvýšenéPamäťpri podávaní 80 mM v porovnaní s 1 mM MgCl2. Nadmerná expresia UAS-uex v ab KC s c739-GAL4 u múch s genetickým pozadím divokého typu ani nezvýšená pravidelná 24-hodinováPamäť(obrázok 4B), alebo u múch kŕmených počas 4 dní 40 alebo 80 mM MgCl2 (obrázok 4G). Tiež sme testovali, či 4 dni suplementácie 80 mM MgCl2 zlepšili 24-hodinový pamäťový výkon po averzívnom rozloženom tréningu. Opäť platí,Pamäťmutantné muchy divokého typu, ale nie uexMI01943, vykazovali zlepšenie (obrázok 4 - doplnok k obrázku 1). Tieto výsledky spolu naznačujú, že optimálnePamäťvylepšenie kŕmením Mg2 plus vyžaduje a môže byť plne podporované funkciou UEX v ab KC.

UEX je funkčne zachovaný transportér horčíka

Vzhľadom na silnú konzerváciu sekvencie UEX s cicavčím CNNM2/4 sme testovali, či CNNM2 môže funkčne nahradiť UEX a obnoviť defekt LTM mušiek uexMI01943. U ľudských pacientov s hypomagneziémiou, ktorá je spojená s malformáciou mozgu a intelektuálnym postihnutím, bolo identifikovaných niekoľko bodových mutácií v CNNM2 (Arjona et al., 2014). Zavedenie ekvivalentných mutácií do myšieho CNNM2 (CNNM2E357K, CNNM2T568I, CNNM2S269W a CNNM2E122K) ukázalo, že tieto lézie odvodené od pacienta zhoršujú transport horčíka (Arjona et al., 2014). Skonštruovali sme muchy nesúce transgény divokého typu a tento mutantný variant UAS-CNNM2 (obrázok 5A). Farbenie na pridružený C-terminálny HA-tag odhalilo jasnú expresiu všetkých variantov UAS-CNNM2::HA v ab neurónoch, keď boli poháňané c739-GAL4 (obrázok 5 – doplnok k obrázku 1). Avšak iba expresia divokého typu CNNM2, a nie bodovo mutantných foriem, v ab KC uexMI01943

mutantné muchy obnovené 24 hodínPamäťvýkon (obrázok 5B).

Tiež sme testovali, či UEX môže sprostredkovať extrúziu Mg2 plus. UEX exprimovaný v bunkách HEK293 lokalizovaných na plazmatickej membráne a bunkách naložených s Mg2 plus a Mg2 plus indikátorom Magnézium zelená vykazovala rýchly Mg2 plus eflux (obrázok 5 - obrázok doplnok 2 a video 1), v porovnaní s bunkami transfekovanými prázdnym vektorom. Extrúzia Mg2 plus poháňaná UEX bola zreteľne menej účinná ako v bunkách exprimujúcich ľudský CNNM4 (obrázok 5 – doplnok k obrázku 2), o ktorom je známe, že má podobnú účinnosť ako CNNM2 (Hirata et al., 2014). Nevieme však, či je vyjadrenie UEX a CNNM4 ekvivalentné. Napriek tomu demonštrácia medzidruhovej komplementácie a Mg2 plus efluxnej aktivity definuje UEX ako funkčný homológ cicavčieho CNNM2/4.

Obrázok 4. Záchrana defektu LTM u mušiek uexMI01943. Obnovenie expresie UAS-uex v ab a g (MB247-GAL4) alebo ab Kenyonových bunkách (KCs) zachránených 24 hodínPamäťvýkon uexMI01943 letí, zatiaľ čo výraz v abc, abs alebo a0 b0 KC nie (p<0.05, anova="" and="" t-test,="" n="8–12)." (b)="" overexpression="" of="" uas-uex="" in="" ab="" kcs="" did="" not="" enhance="" 24="" hr="">Pamäťvýkonnosť u múch divokého typu (ANOVA, n=8–12). (C) Defektný LTM bol zachránený, ak bola expresia UAS-uex obmedzená na ab KC dospelých múch pomocou dočasnej kontroly sprostredkovanej GAL80ts (p<0.05, anova,="" n="6" for="" immediate="" and="" n="8" figure="" 4="" continued="" on="">

na 24 hodPamäť), ale (D) zostalo chybné, ak sa neuvoľnila expresia UAS-uex. (E)Pamäťzlepšenie pomocou diétneho Mg2 plus je podporované UEX v ab KC. Pamäť múch exprimujúcich UAS-uexRNAi v ab KC nemôže byť posilnená kŕmením Mg2 plus (t-test, n=8). (F) Pamäť mutantných múch uexMI01943 nemožno zlepšiť kŕmením Mg2 plus, ale zlepšenie bolo obnovené expresiou UAS-uex v ab KC (p<0.05, t-test,="" n="8–12)." (g)="" the="" memory="" of="" wild-type="" flies="" was="" not="" sensitized="" to="" mg2+="" enhancement="" by="" overexpressing="" uas-uex="" in="" ab="" kcs.="">Pamäťbola zvýšená, ak boli muchy kŕmené 80 mM MgCl2, ale nie suboptimálnym 40 mM MgCl2 (p<0.05, anova,="" n="">

Online verzia tohto článku obsahuje nasledujúce dodatky k obrázku 4:

Doplnok k obrázku 1. Mg2 plus kŕmenie zosilnené LTM po averzívnom rozmiestnenom tréningu u mutantných múch divokého typu, ale nie uexMI01943.

Vyžaduje sa neporušená doména CNBHPamäť

Vzhľadom na zavedenú úlohu signalizácie cAMP vPamäť- relevantná plasticita u bezstavovcov a cicavcov (Kandel, 2012), testovali sme dôležitosť domény CNBH v UEX. Skonštruovali sme muchy nesúce bodovo mutovaný transgén CNBH UAS-uexR622K (Obrázok 6A). Ekvivalentná substitúcia aminokyseliny R622K ruší väzbu cAMP v regulačnej podjednotke cAMP-dependentnej proteínkinázy, PKA (Bubis a kol., 1988). Expresia UAS-uexR622K v neurónoch ab pomocou c739-GAL4 neobnovila 24-hodinový výkon pamäte ani nezmenila okamžitúPamäťvýkon mutantných múch uexMI01943 (Obrázok 6B).

CRISPR sme použili aj na pokus o zavedenie mutácie R622K do CNBH natívneho lokusu uex (Bassett a kol., 2013; Gratz a kol., 2013; Yu a kol., 2013). Neočakávane tento prístup nezaviedol substitúciu R622K, ale namiesto toho nahradil T626 v CNBH s NRR. Našťastie muchy homozygotné pre túto alelu uexT626NRR boli životaschopné ako dospelí, na rozdiel od tých, ktoré sú homozygotné pre uexD, čo naznačuje, že UEX kódovaný uexT626NRR si zachováva funkciu. Mušky homozygotné pre uexT626NRR alebo heterozygotné muchy uexT626NRR/uexMI01943 však vykazovali silné 24 hod.Pamäťdefekt (Obrázok 6C). OkamžitýPamäťbol tiež narušený u homozygotných mušiek uexT626NRR, na rozdiel od múch nesúcich všetky ostatné kombinácie alel uex. Okrem toho,Pamäťmušiek uexT626NRR nebolo možné vylepšiť kŕmením Mg2 plus (Obrázok 6D). Mutácia uexT626NRR teda oddeľuje to podstatné

Obrázok 5. uex kóduje evolučne konzervovaný transportér Mg2 plus. (A) Model štruktúry proteínu CNNM2 vykazujúci klinicky relevantné bodové mutácie.

Upravené a upravené podľa Arjona et al., 2014. (B) Nadmerná expresia divokého typu, ale nie mutantného, ​​CNNM2 v ab Kenyon bunkách zachraňujePamäťdefekt mutantných múch uexMI01943 (s<0.05, anova,="" n="6–8" for="" immediate="" and="" n="8–12" for="" 24="" hr="">

Online verzia tohto článku obsahuje nasledujúce dodatky k obrázku 5:

Doplnok k obrázku 1. Transgénna expresia mutantných variantov CNNM2.

Doplnok k obrázku 2. UEX-dependentný Mg2 plus eflux v HEK293 bunkách.

rola pre uex z funkcie vPamäťa naznačuje, že aktivita regulovaná cyklickými nukleotidmi je kritická pre UEX na podporu normálneho a Mg2 plus - zvýšenéhoPamäť. Aj keď sme pomocou westernového prenosu potvrdili, že proteín plnej dĺžky je exprimovaný v muchách uexT622NRR (obrázok 6E), naša protilátka nám neumožnila overiť, či sa proteín UEXT626NRR vhodne lokalizuje v mozgu. Je preto potrebná ďalšia práca na charakterizovanie bunkovej lokalizácie, väzby cAMP a transportnej funkcie Mg2 plus proteínu kódovaného touto náhodnou alelou uexT626NRR.

Chronická manipulácia s cAMP mení lokalizáciu UEX v KC

Testovali sme, či cAMP môže akútne zmeniť aktivitu UEX aplikáciou forskolínu na bunky HEK293 exprimujúce UEX. Nebola však pozorovaná žiadna zjavná zmena v dynamike Mg2 plus eflux závislej od UEX (údaje nie sú uvedené). Preto sme testovali, či sa expresia KC UEX:: HA zmenila u múch s chronickými zmenami

metabolizmus cAMP zavedením mutácií relevantných pre učenie do adenylátcyklázy stimulovanej Ca2 plus stimulovanou rutabaga alebo fosfodiesterázy špecifickej pre cAMP kódovanú podľa dunce. Anti-HA imunofarbenie mozgov z rut2080; uex::HA a dnc1; mušky uex::HA odhalili výraznú zmenu v lokalizácii UEX (obrázok 7A a B a videá 2–4). Zatiaľ čo UEX::HA sa zvyčajne deteguje v lalokoch všetkých KC na zhruba ekvivalentnej úrovni u múch divokého typu, značenie bolo nižšie v laloku MB g a výraznejšie v abc KC na pozadí mutantov rut2080 a dnc1 (obrázok 7C) , hoci celková MB expresia UEX::HA je podobná medzi muchami divokého typu a mutantmi (obrázok 7D). Okrem toho analýzy westernového prenosu proteínu extrahovaného z hláv týchto múch neodhalili významný rozdiel v celkových hladinách expresie UEX::HA (údaje nie sú uvedené). Tieto údaje sú preto v súlade s funkciou UEX regulujúcou cAMP a možno aj s jeho bunkovou lokalizáciou v KC.

UEX sa vyžaduje na udržanie kolísavého [Mg2 plus ]i v ab KC

Hoci MagFRET môže hlásiť [Mg2 plus ], nereaguje dostatočne rýchlo na zaznamenanie signálov vyvolaných stimulom. Preto sme skonštruovali muchy obsahujúce UAS-transgény pre dva novšie geneticky kódované Mg2 plus senzory, MagIC (bez FRET; Koldenkova a kol., 2015) a MARIO (založené na FRET; Maeshima a kol., 2018). Nepodarilo sa nám zistiť expresiu UAS-MARIO v mozgu muchy, a preto sme mohli použiť iba UAS-MagIC. Uvádza sa, že MagIC reaguje najsilnejšie na Mg2 plus, ale v menšej miere aj na Ca2 plus (Koldenkova et al., 2015). Preto sme najprv overili špecifickosť odpovedí MagIC v bunkovo ​​permeabilizovanom prípravku mozgu mušiek ex vivo. Muchám exprimujúcim UAS-MagIC v ab KC s c739-GAL4 (obrázok 8A) boli odstránené mozgy, inkubované v miske s fyziologickým roztokom (Barnstedt et al., 2016) a zmeny fluorescencie boli monitorované pred a po kúpeli. - tok chemikálií. Zatiaľ čo aplikácia MgCl2 vyvolala na dávke závislé zvýšenie odozvy MagIC, chelácia Mg2 plus s EDTA vyvolala pokles závislý od dávky (obrázok 8B a videá 5 a 6). Na porovnanie, CaCl2 zaznamenal len mierne zvýšenie pri najvyšších koncentráciách, zatiaľ čo Ca2 plus-selektívny chelátor EGTA mal malý účinok (obrázok 8B). Tieto výsledky ukazujú, že UAS-MagIC môže monitorovať [Mg2 plus ]i v ab KC v mozgu muchy.

Ukázalo sa, že zvýšenie intracelulárneho cAMP vyvoláva tok Mg2 plus z buniek cicavcov (Romani a Scarpa, 2000; Vormann a Gunther, 1987; Jakob a kol., 1989; Romani a Scarpa, 1990b; Romani a Scarpa, 1990a; Gu¨nther, 1987; Gu¨nther a kol., 1990; Howarth a kol., 1994). Pretože naše experimenty tiež ukázali, že cAMP môže regulovať UEX, ďalej sme testovali, či stimulácia syntézy cAMP s forskolínom (FSK) môže zmeniť signály MagIC v ab.

Obrázok 6. Pre pamäť je potrebná doména cyklickej nukleotidovej homológie (CNBH) UEX. (A) Schéma zobrazujúca detail sekvencie domény CNBH v UEX a zmeny aminokyselín vykonané v uexR622K a uexT626NRR. (B) Expresia transgénu UAS-uexR622K v bunkách ab Kenyon nezachránila defekt LTM mutantných múch uexMI01943 (p<0.05, anova,="" n="8)." immediate="" memory="" was="" also="" unaffected.="" (c)="" flies="" homozygous="" for="" uext626nrr="" have="" defective="" short-="" and="" long-term="" memory,="" while="" trans-heterozygous="" uext626nrr/uexmi01943="" flies="" only="" exhibit="" impaired="" ltm=""><0.05, anova,="" n="8)." figure="" 6="" continued="" on="" next="">

Obrázok 6 pokračuje

(D) Diétne Mg2 plus nezlepšilo pamäť homozygotných múch uexT626NRR / uexT626NRR (p<0.05, t-test,="" n="8)." (e)="" western="" blot="" analysis="" of="" uex="" protein="" expression="" in="" fly="" head="" extracts.="" genotype="" from="" left="" to="" right:="" wild-type,="" uext626nrr/uext626nrr,="" uext626nrr/+,="" uext626nrr/uexmi01943,="" uexmi01943/+.="" the="" blot="" was="" first="" probed="" with="" anti-uex="" antibody="" (upper="" panel),="" and="" then="" stripped="" and="" re-probed="" with="" anti-tubulin="" antibody="" (lower="" panel)="" as="" a="" loading="">

KCs. Pre tieto experimenty sme opäť použili ex vivo mozgový prípravok, ale tentoraz bunky neboli permeabilizované. Ukázalo sa, že 30 mM FSK vyvoláva maximálny nárast cAMP v KC, ktorý sa približuje tomu, čo sa pozorovalo po apetitívnom kondicionovaní (Louis et al., 2018). Aplikácia 30 mM FSK na c739-GAL4; Mozgy UAS-MagIC vyvolali konzistentnú dynamiku fluorescencie MagIC. Po prudkom počiatočnom vzostupe sa reakcie pomaly znížili späť k základnej čiare a potom opäť pomaly stúpali do bodu, v ktorom signál začal kolísať. (Obrázok 8C a D a video 7). Kľúčové znaky tejto odpovede boli zaznamenané iba v signáli Venuše citlivom na Mg2 plus (obrázok 8D). Na rozdiel od toho fluorescencia mCherry nekolísala, ale neustále klesala v priebehu záznamu (pravdepodobný výsledok bielenia svetlom), čo dokazuje, že kolísanie signálu Venuše nie je pohybovým artefaktom (obrázok 8E). Dôležité je, že reakcie MagIC indukované FSK boli väčšie ako reakcie po aplikácii fyziologického roztoku (obrázok 8 – obrázok doplnok 1A). Kolísavá odpoveď sa však vyvinula aj po aplikáciách fyziologického roztoku (obrázok 8 - doplnok k obrázku 1B), čo naznačuje, že rytmický signál MagIC môže byť všeobecnou odpoveďou na zvýšenie [Mg2 plus ]i, ktoré nasleduje po bunkovej perturbácii.

V minulosti bolo hlásené, že Drosophila MB vykazuje pomalú (0.004 Hz) Ca2 plus osciláciu v ex vivo mozgoch, zatiaľ čo oveľa rýchlejšiu 20 Hz osciláciu vyvolávajú pachy v kobylke MB (Laurent a Naraghi, 1994; Rosay a kol., 2001). Aj keď naša počiatočná charakterizácia MagIC v mozgu muchy naznačovala preferenčnú reakciu na Mg2 plus (obrázok 8B), napriek tomu sme explicitne testovali, či FSK vyvolal fluktuáciu [Ca2 plus]i ab KC, pomocou expresie UAS-GCaMP6f (Chen et al., 2013). FSK vyvolal oneskorené zvýšenie odpovede GCaMP, ale nepozorovala sa žiadna jasná oscilačná aktivita (obrázok 8 – doplnok k obrázku 1C–E).

Nakoniec sme testovali, či pozorované reakcie MagIC boli citlivé na stav génu uex. Vygenerovali sme muchy uexMI01943, ktoré tiež ukrývali c379-GAL4 a UAS-MagIC, a porovnali sme ich reakcie MagIC vyvolané FSK a soľným roztokom s odpoveďami múch s lokusom uex divokého typu. Mutované muchy uexMI01943 vykazovali zvýšenú reakciu FSK na reakciu múch divokého typu, zatiaľ čo reakcie vyvolané fyziologickým roztokom boli nerozoznateľné (obrázok 8F a G). Odpovede vyvolané neaktívnym analógom FSK, ddFSK, boli tiež necitlivé na stav uex (obrázok 8 – doplnok k obrázku 1F). Mutácia uex preto selektívne zvyšuje priemerné FSK-evokované MagIC reakcie.

Tiež sme si všimli, že stopy MagIC z mutantných múch uex nevykazovali kolísavý signál (obrázok 8H a obrázok 8 - doplnok k obrázku 1G). Na kvantifikáciu tohto rozdielu sme vypočítali strednú výkonovú spektrálnu hustotu (PSD) stôp z uexMI01943 a múch divokého typu ošetrených FSK alebo fyziologickým roztokom. V oboch podmienkach bol priemerný PSD významne posunutý doľava smerom k nižším frekvenciám v mutantoch uexMI01943 v porovnaní s kontrolami divokého typu (obrázok 8I). Mozgy muchy divokého typu mali výrazne väčšiu oscilačnú aktivitu sústredenú okolo 0, 015 Hz ako tie z mutantov uexMI01943. Tieto údaje preto naznačujú, že UEX je potrebný na pomalé rytmické udržiavanie KC [Mg2 plus ]i. Dôležité je, že zistenie, že signály MagIC sú zvýšené a zmenené v mutantoch uex, potvrdzuje, že pozorované reakcie MagIC sú závislé od Mg2 plus. Okrem toho naznačujú, že KC vyjadril limity UEX Mg2 plus akumuláciu, čo je v súlade s úlohou pri extrúzii.

Diskusia

Pozorovali sme zlepšenie čuchového výkonu LTM, keď boli muchy kŕmené 4 dni pred tréningom potravou doplnenou o 80 mM [Mg2 plus ]. Tento výsledok sa podobá výsledku hlásenému u potkanov, hoci na zvýšenie mozgu [Mg2 plus ] na úrovne zlepšujúce pamäť boli potrebné dlhšie obdobia kŕmenia (Slutsky et al., 2010). Rozdiel v optimálnom čase kŕmenia môže odrážať veľkosť zvieraťa a možno väčšiu biologickú dostupnosť Mg2 plus v potrave u Drosophila. Zatiaľ čo Mg2 plus -L-treonát (MgT) bol u potkanov účinnejší prostriedok na dodávanie Mg2 plus ako chlorid horečnatý (Slutsky et al., 2010), pozorovali sme podobné zlepšenie výkonnosti pamäte, keď boli muchy kŕmené chloridom horečnatým. síran horečnatý alebo MgT (údaje nie sú uvedené).

Obrázok 7. Expresia uex Kenyonových buniek (KC) je zmenená u mušiek rutabaga a dunce mutant. (A) Anti-HA zafarbené mozgy ukázali, že lokalizácia proteínu UEX::HA je zmenená v rut2080; uex::HA a dnc1; uex::HA letí, čoraz výraznejšie v abc KC (šípky). Mierka 20 mm. (B) Zväčšené obrázky tiel húb (MB) zvýrazňujúce expresiu abc KC v mutantných muchách rut2080 a dnc1 v porovnaní s muchami divokého typu uex::HA. Mierka 20 mm. (C) Kvantifikácia intenzity fluorescencie. Vľavo, mikrosnímka s meracou čiarou cez hrot laloku a pravouhlé oblasti záujmu pre lalok g a kontrolnú oblasť. Stredné profily relatívnej intenzity fluorescencie cez špičku laloku ukazujú výrazne vyšší signál v mutantných muchách rut2080 a dnc1 v strednej oblasti obsadenej jadrom ab KC (*p<0.05, anova,="" n="6–10)." right,="" the="" relative="" intensity="" in="" the="" g="" lobe="" was="" significantly="" lower="" in="" rut2080="" and="" dnc1="" mutant="" flies,="" as="" compared="" to="" wild-type="" controls=""><0.05, anova,="" n="6–10)." scale="" bars="" 10="" mm.="" (d)="" left,="" micrograph="" showing="" circular="" rois.="" right,="" figure="" 7="" continued="" on="" quantification.="" total="" intensity="" over="" all="" six="" rois="" on="" the="" mbs="" was="" not="" significantly="" different="" between="" the="" rut2080,="" dnc1,="" and="" wild-type="" brains="" (p="">0.13; ANOVA, n=6–10).

Zvýšenie [Mg2 plus ]e v mozgu potkana vedie ku kompenzačnej upregulácii expresie NR2B podjednotky NMDAR, a teda k zvýšeniu podielu postsynaptických NMDAR obsahujúcich NR2B. Táto trieda NMDAR má dlhší otvárací čas (Chen et al., 1999; Erreger et al., 2005), čo naznačuje, že tento prepínač v zložení podjednotiek predstavuje mechanizmus homeostatickej plasticity (Turrigiano, 2008) na prispôsobenie sa zvýšenému bloku NMDAR vyvolanému zvýšenie [Mg2 plus ]e. Navyše nadmerná expresia NR2B v prednom mozgu myši môže zvýšiť synaptickú facilitáciu a učeniePamäťvýkonnosť (Tang et al., 1999), podporujúca zvýšenie NR2B, ktoré je dôležitým faktorom pri zvyšovaní Mg2 plusPamäť. Avšak aj v pôvodnej in vitro štúdii synaptickej plasticity so zvýšenou Mg2 plus (Slutsky et al., 2004) sa zistilo, že prúdy NMDAR nestačili na úplné vysvetlenie pozorovaných zmien.

Naše štúdie straty funkcie podjednotiek NMDAR v KC Drosophila nezhoršili pravidelné alebo Mg2 plus - vylepšenéPamäť. Okrem toho sme nezistili zjavnú zmenu v hladinách expresie podjednotiek glutamátového receptora v celom mozgu u mušiek kŕmených Mg2 plus. Hoci aktivita NMDAR bola predtým zapletená do Drosophila olfactoryPamäť, účinky sa väčšinou pripisovali fungovaniu mimo MB (Xia a kol., 2005; Wu a kol., 2007). Okrem toho nadmerná expresia Nmdar1 vo všetkých neurónoch alebo špecificky vo všetkých KC nezmenila STM alebo LTM. Ektopická nadmerná expresia v MB verzie NMDARN631Q, ktorú nemôže blokovať Mg2 plus, narušila LTM (Miyashita et al., 2012). Táto mutácia však umožňuje vstup Ca2 plus riadený ligandom bez potreby korelovanej depolarizácie neurónov, ktorá môže narušiť funkciu KC neočakávaným spôsobom. Možno najpozoruhodnejšie je, že synaptickú depresiu relevantnú pre učenie v MB možno poháňať dopaminergnými vyučovacími signálmi dodávanými do cholinergných výstupných synapsií z KC reagujúcich na zápach po špecifické MBON (Claridge-Chang et al., 2009; Aso et al., 2012 Burke a kol., 2012; Liu a kol., 2012; Owald a kol., 2015; Hige a kol., 2015; Barnstedt a kol., 2016; Parisse a kol., 2016; Aso a kol., 2014; Owald a Waddell, 2015; Handler a kol., 2019). Je možné, že KC dostávajú glutamát zo zdroja, ktorý ešte nebol identifikovaný, ale v súčasnosti nie je v sieti MB zjavné miesto pre plasticitu závislú od NMDAR. Dôkazy preto naznačujú, že normálny a Mg2 plus - vylepšený Drosophila LTM je nezávislý od signalizácie NMDAR v KC. Okrem toho naše merania MagFRET naznačujú, že Mg2 plus kŕmenie tiež zvyšuje [Mg2 plus ]i ab KC o približne

približne 50 mM.

Identifikovali sme úlohu pre uex, ortológ jednej muchy evolučne konzervovanej rodiny Mg2 plus efluxných transportérov typu CNNM (Ishii et al., 2016). Existujú štyri odlišné gény CNNM u myší a ľudí, päť u C. elegans a dva u zebričiek (Ishii et al., 2016; Arjona et al., 2013). Lokus uex produkuje štyri alternatívne zostrihané transkripty mRNA, ale všetky kódujú rovnaký proteín 834 aa. Presná úloha proteínov CNNM v transporte Mg2 plus je trochu sporná (Funato a kol., 2018a; Arjona a de Baaij, 2018; Funato a kol., 2018b; Gime'nez-Mascarell a kol., 2019). Niektorí navrhujú, že proteíny CNNM sú priamymi transportérmi Mg2 plus, zatiaľ čo iní uprednostňujú, aby fungovali ako senzory intracelulárnej koncentrácie Mg2 plus [Mg2 plus] a/alebo regulátory iných transportérov Mg2 plus. Zistili sme, že ektopická expresia Drosophila UEX zvyšuje Mg2 plus eflux v HEK293 bunkách a že endogénny UEX obmedzuje [Mg2 plus ]i v ab KC v mozgu muchy. Preto, ak UEX sám nie je transportérom Mg2 plus, musí ním byť

schopné účinne interagovať s ľudskými transportérmi Mg2 plus eflux a ovplyvňovať extrúziu Mg2 plus u Drosophila. Keďže UEX je jediným proteínom CNNM v muche, môže slúžiť všetkým úlohám štyroch individuálnych cicavčích CNNM. Avšak schopnosť myši CNNM2 obnoviťPamäťkapacita mutantných mušiek uex naznačuje, žePamäť-príslušná funkcia UEX môže byť nahradená funkciou CNNM2.

Je zaujímavé, že žiadny z variantov CNNM2 relevantných pre ochorenie nebol schopný doplniťPamäťdefekt uex mutantných múch. Variant CNNM2 T568I nahrádza jednu aminokyselinu v druhej doméne CBS (Arjona et al., 2014). Onkogénne proteín tyrozín fosfatázy z rodiny PRL (fosfatáza regenerujúcej pečene) sa viažu na CBS domény CNNM2 a CNNM3 a môžu inhibovať ich transportnú funkciu Mg2 plus (Hardy et al., 2015; Gime'nez-Mascarell et al., 2017 Zhang a kol., 2017). Bude preto zaujímavé otestovať úlohu domén UEX CBS a to, či fly PRL-1 reguluje aktivitu UEX.

Analýza RNA-seq odhaľuje, že uex je silne exprimovaný v tráviacom trakte a nervovom systéme lariev a dospelých múch, ako aj vo vaječníkoch (Gelbart a Emmert, 2010; Croset a kol., 2018; Davie a kol., 2018), čo naznačuje, že mnohé uex mutácie budú pleiotropné. Naša alela uexD, ktorá odstraňuje 272 aminokyselín (vrátane časti druhej CBS a celej domény CNBH) z C-konca UEX, vedie k vývojovej letalite, keď je homozygotná, čo dokazuje, že uex je esenciálny gén. Cicavčí CNNM4 je lokalizovaný na bazolaterálnej membráne črevných epitelových buniek (Yamazaki et al., 2013). Tam sa predpokladá, že funguje pri transcelulárnom transporte Mg2 plus výmenou intracelulárneho Mg2 plus za extracelulárny Na plus po apikálnom vstupe cez kanály TRPM7. Letalita u Drosophila by preto mohla vzniknúť z neschopnosti absorbovať dostatočné množstvo Mg2 plus cez črevo lariev. Neurónovo obmedzená expresia uexRNAi s elav-GAL4 však tiež vedie k letalite lariev (údaje nie sú uvedené), čo naznačuje, že UEX má ďalšiu úlohu v ranom vývoji nervového systému, ako je CNNM2 u ľudí a zebričiek (Arjona et al., 2014; Accogli a kol., 2019). Možno prekvapivo, muchy nesúce homozygotné alebo trans-heterozygotné kombinácie niekoľkých hypomorfných alel uex majú chybnú chuť do jedla a averziu.Pamäťvýkon, napriek tomu sa zdajú byť inak nedotknuté.

Genetická úprava lokusu uex na pridanie C-terminálnej značky HA k proteínu UEX nám umožnila lokalizovať jeho expresiu v mozgu. Označovanie je obzvlášť významné vo všetkých hlavných triedach KC. Obmedzenie knockdown expresie uex na všetky ab KC dospelých múch alebo dokonca len na podmnožinu abc reprodukovalo defekt LTM. Poškodenie LTM bolo evidentné, ak expresia uexRNAi v ab neurónoch

Obrázok 8. UEX obmedzuje nárast [Mg2 plus ]i a podporuje pomalú osciláciu v ab Kenyonových bunkách (KC). (A) Explantovaný mozog muchy exprimujúci UAS-MagIC riadený c739-GAL4. Horný panel, zobrazenie fázového kontrastu so širokým poľom; stredné panely, fluorescenčné pohľady na kanály Venuše a mCherry; dolný panel, konfokálny rez na úrovni somat KC zobrazujúci kanály Venuše a mCherry. Mierka 20 mm. (B) MagIC selektívne reaguje na zmeny [Mg2 plus]i v KC. Stopy pomeru MagIC po aplikácii kúpeľa s 10, 20 alebo 40 mM MgCl2 alebo CaCl2; 5, 10 alebo 20 mM EDTA alebo EGTA. (C) Reprezentatívna krivka na obrázku 8 pokračuje ďalej - obrázok 8 pokračuje

Pomer MagIC po aplikácii FSK ukazuje počiatočnú vlnu, po ktorej nasleduje postupný vzostup a rozvoj pomalej oscilácie. (D) Primárne reakcie vyplývajú zo zmien signálu Venuše citlivého na Mg2 plus. (E) Signál mCherry vykazuje stály pokles. (F) FSK-evokované MagIC reakcie sú väčšie u mušiek mutantov uex. Priemerné odpovede MagIC ukazujú, že FSK vyvolal výrazne väčší nárast mutantu uexMI{10}}1943 ako u múch divokého typu. (G). Priemerné reakcie MagIC vyvolané soľným roztokom neboli významne zmenené u mušiek mutantov uex. (H) Jednotlivé stopy kanálov Venuše (zelená) a mCherry (červená) ukazujú, že pomalá oscilácia je zrejmá iba vo Venušine kanáli múch divokého typu, ale nie mutantov uex. (I) Analýza výkonovej spektrálnej hustoty (PSD) časových radov od 200 do 900 s všetkých údajov ukazuje, že stopy od múch divokého typu majú výrazne väčšiu oscilačnú aktivitu, sústredenú okolo 0,015 Hz, ako stopy od múch mutantov uex.

Online verzia tohto článku obsahuje nasledujúce doplnky k obrázku 8:

Doplnok k obrázku 1. Jednotlivé stopy pre zobrazovanie MagIC a GCaMP.