Časť 2: Proteinurické chronické ochorenie obličiek je spojené so zmenenou životnosťou červených krviniek, deformovateľnosťou a metabolizmom

V prípade časti 1 kliknite na položkuTU.

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

Poškodenie obličiek vyvolané doxorubicínom mení životnosť murínu RBC, morfológiu a biofyzikálne vlastnosti

Dvadsať dní po indukcii DIN, čo sa zhoduje s vývojom zníženejfunkcia obličiek(obrázok 1b), fluorescenčné farbivo 5 (6) - CFDA, SE,24, ktoré sa rýchlo preberá do RBC, bolo vstreknuté, t. v. vstreknuté na preskúmanie rýchlosti klírensu RBC v uvedených časových bodoch in vivo. Reprezentatívne histogramy, znázornené na obrázku 4a, naznačujú odstránenie označených RBC z obehu a nahradenie neoznačenými RBC. Zvýšená strata RBC bola zjavná už 3 dni po podaní farbiva a klírens RBC bol výrazne rýchlejší u myší 129S1/SvImJ s DIN až do dňa 37. Na 41. deň bolo u týchto myší z obehu odstránených z obehu z17% viac RBC v porovnaní so zdravými myšami (obrázok 4b).

Cistanchezlepšiťfunkcia obličiekaVýhodyobličky

Obrázky zhotovené z krvného steru odhalili morfologické zmeny v RBC čerpané z 129S1/SvImJ myší s DIN (obrázok 4c) a Nphs2Dipod (doplnkový obrázok S4A). U zdravých myší vykazujú RBC tvar bikoncave disku. U myší 129S1/SvImJ s DIN sme pozorovali zvýšený počet stomatocytov (červené hviezdy), buniek slznej kvapky (čierny trojuholník), schistocytov (čierne body) a mikrocytických buniek (čierna šípka) (obrázok 4c). Myši Nphs2Dipod vykazovali zvýšený podiel schistocytov (čierne body, doplnkový obrázok S4A, spodný obraz, ľavá strana) a bunky boli polychromatické (doplnkový obrázok S4A, spodný obrázok, pravá strana).

Na ďalšie skúmanie funkčných zmien RBC sa merania deformability v 30. deň vykonali pomocou ektakcytometrie.³²Deformovateľnosť RBC bola významne znížená u myší 129S1/SvImJ s DIN, ako aj u myší Nphs2Dipod, čo naznačuje znížený maximálny index predĺženia (EImax) (obrázok 4d a doplnkový obrázok S4B). Šmykový stres pre 50% (SS1/2) EImax (obrázok 4e) a teda pomer SS1/2 EImax (obrázok 4f) bol významne zvýšený u myší 129S1/SvImJ s DIN, čo naznačuje tuhšie RBC. Pomer SS1/2 EImax mal tendenciu byť zvýšený u myší Nphs2Dipod v porovnaní so zdravými myšami C57BL/6; rozdiel však nedosiahol štatistickú významnosť (P 1/4 0,06) (doplnkový obrázok S4D).

Keďže vystavenie RBC hypertonickým extracelulárnym podmienkam in vitro napodobňuje osmotické prostredie, s ktorým sa stretávame v obličkovej medulle, vesmír sa môže vykonať na 30. deň a bolo stanovených niekoľko osmosenzitívnych parametrov, ako je opísané predtým.³³Omin predstavuje osmolalitu pri minimálnej deformovateľnosti RBC, za ktorou by RBC lyzovali s ďalším znížením osmolarity. Hodnoty Omin boli vyššie u myší 129S1/SvImJ s DIN a posunuli sa doprava (obrázok 5a a d). Podobná tendencia k vyššiemu Ominu bola pozorovaná u myší Nphs2Dipod (doplnkový obrázok S4E). Hodnoty Ohyperu, odrážajúce hydratačný stav buniek, boli významne vyššie u myší 129S1/SvImJ s DIN (obrázok 5b), ale boli podobné u myší Nphs2Dipod a ich príslušných kontrolných myší (doplnkový obrázok S4F). Maximálna deformovateľnosť (EImax) v izotonite je bod, v ktorom bunky dosiahli maximálnu eliptickosť. EImax pri izotonite bol významne znížený u myší 129S1/SvImJ s DIN (obrázok 5c), ale nevykazoval žiadne rozdiely u myší Nphs2Dipod v porovnaní so zdravými myšami C57BL/6 (doplnkový obrázok S4G). Celkovo tieto výsledky naznačujú zníženú integritu a elasticitu membrány, ale aj zmeny tvaru u myší 129S1/ SvImJ a Nphs2Dipod, ako aj vyššiu osmotickú krehkosť RBC z 129S1/SvImJ myší s DIN.

RBC sú metabolicky preprogramované počas proteinurického ochorenia obličiek u myší

Na lepšie pochopenie molekulárnych adaptácií spojených so zmenami v hojnosti RBC a morfológii ako funkcii poškodenia obličiek boli RBC z myší 129S1/SvImJ s myšami DIN a Nphs2Dipod analyzované metabolomikou založenou na hmotnostnej spektrometrii (obrázok 6a a doplnkový obrázok S5A). Použitím tohto prístupu sa stanovili relatívne hladiny 256 metabolitov pre myši 129S1/SvImJ a myši Nphs2Dipod. Na systematickú analýzu týchto údajov boli vykonané multivariateanalysy, vrátane čiastočnej najmenej štvorcov diskriminujúcej analýzy a hierarchickej analýzy zoskupení. Zaujímavé je, že čiastočná najmenej štvorcov diskriminujúca analýza metabolómov RBC z oboch modelov odhalila podobné vzory zoskupovania.

Konkrétne, hoci vzorky v čase modelovej indukcie boli zoskupené so zdravými vzorkami zo všetkých časových bodov, vzorky z nefrotických myší zoskupili nezávisle od zdravých kontrolných vzoriek spolu so zložkou 1 (obrázok 6b a doplňujúci obrázok S5B). V súlade so zoskupovacími vzormi zrejmými v 2 modeloch hierarchická zoskupovacia analýza metabolomických údajov pre každý model zdôraznila podobné trendy pre metabolity zapojené do riadenia oxidačného stresu, ako aj nukleo-príliv, aminokyseliny, acylkarnitíny a mastné kyseliny (obrázok 6c a doplnkové obrázky S5C, S6 a S7). Napríklad hladiny alantanoínu, purínového katabiolitu a marker oxidačného stresu v RBC,³⁴a znížený glutatión sa významne nahromadil v priebehu času v oboch modeloch nefrotických myší, čo naznačuje prebiehajúcu tvorbu reaktívnych druhov kyslíka a aktiváciu antioxidačného glutatiónového systému (obrázok 6d a doplnkový obrázok S5D). Podobne aj hladiny prekurzora koenzýmu A (CoA) pantoténu nahromadené v priebehu času (obrázok 6e a doplnkový obrázok S5E).

Podobné vzory boli zrejmé v hladinách voľných mastných kyselín hexadecenovej kyseliny (C16:1), kyseliny octadecenovej (C18:1) a kyseliny docosapentaenovej (C22:5), hoci každý model mal jedinečné časové vzory (obrázok 6f a doplnkový obrázok S5F).

Okrem mastných kyselín, acylkarnitíny vrátane hydroxyoktanoyl-karnitínu (AC C8-OH), hydroxydecanoyl-karnitínu (AC C10-OH) a dodecanoyl-karnitínu (AC C12:1) tiež reagovali na indukciu proteinurovej nefropatie v oboch modeloch (obrázok 6g a doplnkový obrázok S5G).

Tieto zistenia spolu naznačujú, že pri indukcii proteinuríkochorenie obličiekv 2 podobných modeloch myší môže zvýšená hladina oxidačného stresu spôsobiť poškodenie acylových reťazcov na membránových lipidoch. Pretože RBC nemajú schopnosť syntetizovať nové lipidy, využívajú systém, ktorý závisí od odstránenia poškodených acylových reťazcov sprostredkovaného fosfolipázou a nahradenia nepoškodenými mastnými kyselinami. Tento systém sa označuje ako cyklus Lands,35 závisí od aktivácie acylového reťazca konjugáciou do CoA, ktorá vytvára rovnováhu s acylkarnitínom na výmenu membrán36 (obrázok 6h a doplnkový obrázok S5H).

Proteinurické CKD pacienti s anémiou vykazujú zvýšenú smrť RBC

Aby sme potvrdili, že RBC exponujúce PS sa vyskytujú aj u ľudskej CKD, ako už bolo popísané,37 sme analyzovali vzorky krvi od 25 pacientov liečených našou ambulanciou. Aby sme porovnali modely myší, ktoré predstavujú nefrotický syndróm so zachovaným GFR počas prvých 10 dní, a potom pokročilú CKD so zníženým GFR od 20. dňa (obrázok 1 a doplnkový obrázok S2), analyzovali sme 10 pacientov s primárnym nefrotickým syndrómom predstavujúcim proteinurickú CKD so zachovanou GFR (>60 ml/min na 1,73 m2) a 15 pacientov s CKD s nefrotickým proteínúriou a GFR.<60 ml/min="" per="" 1.73="">². Charakteristiky pacienta sú uvedené v tabuľke 1. Anémia spojená s ochorením obličiek, definovaná koncentráciou hemoglobínu<13.5 g/dl="" in="" men="" and=""><12 g/dl="" in="" women,="" was="" observed="" in="" 4="" of="" the="" 10="" primary="" nephrotic="" patients="" (red="" triangles="" in="" figure="" 7),="" whereas="" 14="" of="" 15="" ckd="" patients="" with="" nephrotic-range="" proteinuria="" and="" reduced="" gfr="" were="" anemic="" (figure="" 7a).="" in="" the="" latter="" group,="" plasma="" epo="" concentrations="" and="" reticulocyte="" production="" index="" were="" not="" increased="" (figure="" 7b="" and="" c),="" consistent="" with="" reduced="" erythropoiesis.="" in="" fluorescence-activated="" cell="" sorting="" analysis,="" primary="" nephrotic="" patients="" and="" patients="" with="" advanced="" ckd="" had="" a="" higher="" rate="" of="" ps-exposing="" cells="" (mean,="" 1.0%="" 0.3%="" and="" 1.4%="" 0.7%,="" respectively)="" compared="" with="" healthy="" subjects="" (mean,="" 0.6%="" 0.1%;="" figure="" 7d).="" rbc="" cell="" death="" in="" patients="" with="" primary="" nephrotic="" syndrome="" and="" advanced="" ckd="" was="" triggered="" by="" higher="" levels="" of="" reactive="" oxygen="" species="" (figure="" 7e)="" and="" increased="" ceramide="" levels="" (figure="" 7f).="" augmented="" intracellular="" calcium="" concentration="" was="" found="" in="" patients="" with="" advanced="" ckd="" (figure="">

Ľudské RBC od pacientov s primárnym nefrotickým syndrómom a pokročilou CKD vykazovali morfologické zmeny, ako sa pozorovalo v modeloch myší (obrázky 4c a 7j – l a doplnkový obrázok S4A). Hoci RBC morfológia bola normálna v kontrolách, anemickí pacienti s primárnym nefrotickým syndrómom a pokročilí pacienti s CKD mali zvýšený počet buniek slznej kvapky (čierne trojuholníky) a ekhinocytov (čierne kríže) (obrázok 7k a l). Okrem toho sa cieľové bunky vyskytli u primárnych nefrotických pacientov s anémiou a u pacientov s pokročilou CKD (Červené kríže; Obrázok 7k a l). Všetky skupiny pacientov, vrátane primárnych nefrotických pacientov bez anémie, mali zvýšený podiel sférocytov (modré šípky; Obrázok 7j–l). Na analýzu deformability ľudských RBC sa vykonala ektacytometria. V porovnaní so zdravými kontrolami sa u pacientov s pokročilou CKD znížila maximálna deformovateľnosť (EImax) (obrázok 7h); EImax mal tendenciu byť nižší u pacientov s primárnym nefrotickým syndrómom bez dosiahnutia štatistickej významnosti (obrázok 7h). Parametre SS1/2, Omin, Ohyper a EImax pri izotonicite sa výrazne nelíšili od zdravých kontrol, primárnych nefrotických pacientov a pacientov s pokročilým CKD (doplnkový obrázok S8A– D).

Cistanche výhodyobličky a pomoc s CKD.

DISKUSIA

Súčasná štúdia odhaľuje nové patofyziologické mechanizmy vedúce k anémii spojenej s ochorením obličiek v 2 murínových modeloch proteinuríkochorenie obličieks ťažkými poruchamifunkcia obličiek. Naša štúdia ukazuje, že v týchto modeloch je anémia výsledkom zníženej životnosti RBC vyvolanej expozíciou PS a zrýchleným fagocytárnym klírensom. Zaujímavé je, že anémia u týchto myší sa vyvinula napriek stimulovanej erytropoéze, čo naznačuje, že znížená životnosť RBC prostredníctvom zvýšenej bunkovej smrti RBC by mohla byť alternatívnym vysvetlením týchto zistení. Na rozdiel od pacientov s CKD s anémiou (obrázok 77), oba modely myší sa vyznačovali zvýšenou koncentráciou EPO v plazme. To možno predpokladať zachovaním schopnosti vylučovania EPO v týchto modeloch, ktoré pravdepodobne ušetria bunky vylučujúce EPO umiestnené v interstíciu obličiek. Zvýšená sekrécia EPO v týchto modeloch však nevylučuje záver, že smrť buniek RBC je hlavným hráčom v patogenéze anémie spojenej s ochorením obličiek. Naopak, stimulácia erytropoézy zvýšenou sekréciou EPO sa môže považovať za kompenzačný mechanizmus zvýšenej smrti RBC vyvolanejzlyhanie obličiekv týchto modeloch. V tomto zmysle sa nedávno pozoroval zvýšený extramedulárny erytropoéza so zvýšeným objemom sleziny v inom modeli proteinurickej myši s anémiou.³⁸

U pacientov s proteinurickou CKD a sprievodnou anémiou sme tiež pozorovali zvýšené percento RBC vystavených PS spolu s vyššími hladinami reaktívnych druhov kyslíka a ceramidu. To naznačuje, že zrýchlená smrť RBC sa môže podieľať na patogenéze anémie spojenej s ochorením obličiek v ľudskej CKD. Koncentrácie EPO v plazme a index produkcie retikulocytov sa nezvýšili u pacientov s anemickou CKD, čo poukazuje na zníženú erytropoézu, od ktorej sa v súlade so smrťou RBC očakáva zhoršenie anémie spojenej s ochorením obličiek. Dôvody straty EPO sekrécie obličiek v ľudskej CKD zostávajú nejasné. Je pozoruhodné, že hoci nie všetci pacienti s normálnym GFR mali anémiu, tí so zníženou GFR boli všetci anemickí, čo poukazuje na účinok dlhodobej a pokročilej CKD. Je pozoruhodné, že relatívny deficit EPO v CKD možno prekonať použitím novej triedy inhibítorov prolyl hydroxylázy,³⁹naznačujúce narušené snímanie kyslíka ako možnú príčinu hyposekrécie EPO.

Cistanchezlepšiťfunkcia obličieks a pomoc s CKD.

Naše údaje demonštrujú zníženú deformabilitu RBC v oboch myších modeloch proteínovej nefropatie, čo môže priamo súvisieť so zvýšenými cytoplazmatickými hladinami Ca2þ.⁴⁰Spoločne by tieto mechanizmy mohli pôsobiť spoločne na uľahčenie indukcie RBC bunkovej smrti a odstránenia senescentných a poškodených RBC z krvného obehu.¹⁵Okrem toho sme pozorovali metabolické preprogramovanie v týchto bunkách, čo svedčí o oxidačnom strese a membránovom prerábaní lipidov. Hoci COA a acyl-CoA neboli priamo merané v týchto vzorkách, v RBC sa aktívne premieňajú na acylkarnitíny karnitín palmitoyl transferázou.³⁶Akumulačné hladiny druhej zloženej triedy naznačujú aktiváciu týchto mechanizmov pri nefropatii, pretože tieto metabolity nie sú ľahko transportované cez membrány RBC.⁴¹V ďalšej podpore sme pozorovali akumuláciu v oboch modeloch prekurzorov CoA, vrátane pantothenátu, ktorý sa užíva⁴²a metabolizované⁴³RBC súbežne so zvyšovaním voľných mastných kyselín a znižovaním voľného karnitínu. Zaujímavé je, že sme predtým zistili, že tieto zmeny sa vyskytujú v súvislosti s suprafyziologickými hladinami intracelulárneho Ca2þ.¹⁶Hoci tieto výsledky boli vygenerované ex vivo, uvádzame tu podobné odpovede in vivo. Okrem toho sú acylkarnitíny schopné priamo modulovať membránové vlastnosti.⁴⁴a korelovať s deformabilitou RBC^,45, ako aj osmotická a oxidačná hemolýza.⁴⁶Nekonjugovaný voľný karnitín podporuje deformabilitu membrány sprostredkovaním interakcií medzi membránovými proteínmi.⁴⁷Naše pozorovania výrazne znížených hladín karnitínu v RBC u myší s nefropatiou, pravdepodobne v dôsledku zvýšenej spotreby na tvorbu acylkarnitínov, môžu prispieť k zhoršeným reologickým parametrom, ktoré sme pozorovali paralelne.

Naše zistenia naznačujú spoločné mechanizmy vedúce k smrti RBC u myší s nedostatkom DIN aj podocínu, čo môže súvisieť s proteínúriou nefrotického rozsahu a čo je dôležitejšie, s rozvojom závažnostizlyhanie obličiekv modeloch myší pozorovaných od 20. dňa. U ľudí je pokročilá CKD so zníženým GFR silným prediktorom anémie,⁴⁸a stimulácia smrti RBC by mohla súvisieť s uremickým prostredím. Je potrebné uznať, že v pokročilom CKD môže vstúpiť do hry mnoho faktorov a nepríčetností a podporovať anémiu spojenú s ochorením obličiek. Príspevok ťažkej proteinúrie k stimulácii smrti RBC zostáva nejasný, ale aj keď nie je dokázaný, môže zahŕňať faktory, ktoré sa strácajú v moči, ako je transferín alebo iné regulujúce metabolizmus RBC.⁴⁹Súčasná liečba anémie spojenej s ochorením obličiek sa zatiaľ zameriava na zvýšenie erytropoézy substitúciou železa alebo EPO,⁵⁰aplikáciou stabilizátorov proteínu indukovateľného perorálnych hypoxií,⁵¹alebo perorálnym alebo i.v. podávaním železa.⁵²Tieto liečby však neberú do úvahy zvýšenú smrť RBC. V predchádzajúcej prierezovej štúdii u pacientov s hemodialýzou a peritoneálnou dialýzou sme zistili, že pacienti s vyšším percentom RBC vystavených PS boli liečení vyššími dávkami EPO.¹⁴Preto zlepšenie bunkovej smrti RBC sľubuje, že bude možným terapeutickým prístupom pri liečbe anémie spojenej s ochorením obličiek. V tejto súvislosti si inhibičný účinok rôznych farmakologických činidiel na bunkovú smrť RBC53 vyžaduje ďalšie štúdie na ľuďoch a zvieratách.

Na záver, zmenený bunkový metabolizmus prispieva k dysfunkcii RBC, zvýšenej smrti RBC, a teda anémii u myších modelov proteinurovej CKD, napriek zvýšeným hladinám EPO v sére. Zistenia tejto štúdie môžu čiastočne vysvetliť mechanizmy anémie spojené s CKD u ľudí.

Cistanche Výhodyfunkcie obličiek a pomoc s CKD.

PREZRADENIE

Aj keď to nesúvisí s obsahom článkov, ADA a TN sú zakladateľmi spoločnosti Omix Technologies, Inc. Všetci ostatní autori deklarovali žiadne konkurenčné záujmy.

VYHLÁSENIE O ÚDAJOCH

Údaje budú sprístupnené na základe odôvodnenej žiadosti.

POĎAKOVANIE

Autori oceňujú odbornú technickú pomoc Andrey Janessovej. Tieto štúdie boli podporené grantom Nemeckej výskumnej nadácie pre RB (BI 2149/2-1) a FA (AR 1092/2-2). LS bola podporená grantom Interdisziplinäres Zentrum für Klinische Forschung (IZKF) lekárskou fakultou Tübingenskej univerzity. SMQ bola podporená zo zdrojov kanadských transfúznych služieb. Ako podmienku financovania kanadskej vlády musí táto správa obsahovať vyhlásenie "Názory vyjadrené tu nemusia nevyhnutne predstavovať názor federálnej vlády Kanady."

AUTORSKÉ PRÍSPEVKY

RB a FA navrhli štúdiu. Zber údajov vykonávali RB, TN, MG, TD, DE, MW, LS, MX, JMB, MZK, KO, LK, IG-M a BF.

Štatistické analýzy vykonali RB, TN, MG, TD, LS, JMB, LK, IG-M a ADh; a údaje boli generované RB, TN, MZK, IG-M, LQ- M, BF a ADh. RB, TN, ADA, MG, BNB, LS, AS, TB, MS, ALB, FG, SMQ,

a FA interpretovala údaje. Rukopis bol napísaný, recenzovaný a editovaný spoločnosťami RB, TN, ADA, MG, BNB, TB, ALB, FG, SMQ a FA.

DOPLNKOVÝ MATERIÁL

Doplnkový súbor (PDF)

Doplňujúce materiály a metódy.

Obrázok S1. Experimentálny návrh štúdií na myšiach 129S1/SvImJ a Nphs2Dipod.

Obrázok S2. Odstránenie podocínového výrazu a charakteristických znakov nefrotického syndrómu u myší Nphs2Dipod.

Obrázok S3. Znížená miera prežitia červených krviniek pri experimentálnom nefrotickom syndróme u myší Nphs2Dipod.

Obrázok S4. Zmenená morfológia a znížená deformovateľnosť červených krviniek u myší Nphs2Dipod.

Obrázok S5. Metabolomika indikuje akumuláciu oxidačného stresu a aktiváciu premeny membránových lipidov v červených krvinkách u myší Nphs2Dipod.

Obrázok S6. Metabolomika indikuje zmenený metabolizmus v červených krvinkách získaných z myší 129S1/SvImJ.

Obrázok S7. Metabolomika indikuje zmenený metabolizmus v červených krvinkách prijatých z myší Nphs2Dipod.

Obrázok S8. Šmykový stres pri jednej polovici maximálnej deformovateľnosti červených krviniek (RBC) a osmotickej citlivosti RBC sa výrazne nelíšia u primárneho nefrotického syndrómu a pokročilých pacientov s chronickým ochorením obličiek (CKD).

REFERENCIE

1. Finkelstein FO, Príbeh K, Firanek C a kol. Kvalita života súvisiaca so zdravím a hladiny hemoglobínu u pacientov s chronickým ochorením obličiek. Clin J Am Soc Nephrol. 2009;4:33–38.

2. Efstratiadis G, Konstantinou D, Chytas I, et al. Syndróm kardio-renálnej anémie. Hippokratia. 2008;12:11–16.

3. Staples AO, Wong CS, Smith JM a kol. Anémia a riziko hospitalizácie pri detskom chronickom ochorení obličiek. Clin J Am Soc Nephrol. 2009;4: 48–56.

4. Kurella Tamura M, Vittinghoff E, Yang J, et al. Anémia a riziko kognitívneho poklesu chronického ochorenia obličiek. BMC Nefrol. 2016;17:13.

5. Toft G, Heide-Jørgensen U, van Haalen H, et al. Anémia a klinické výsledky u pacientov s nedialyzickým závislým alebo dialýzou závislým od závažného chronického ochorenia obličiek: dánska štúdia založená na populácii. J. Nefrol. 2020;33:147–156.

6. Geddes CC. Patofyziológia renálnej anémie. Transplantácia nefrolového číselníka. 2018;34:921–922.

7. Artunc F, Risler T. Koncentrácie erytropoetínu v sére a reakcie na anémiu u pacientov s chronickým ochorením obličiek alebo bez neho. Transplantácia nefrolového číselníka. 2007;22:2900–2908.

8. Erslev AJ, Besarab A. Erytropoetín v patogenéze a liečbe anémie chronického zlyhania obličiek. Obličkový int. 1997;51:622–630.

9. Wish JB, Aronoff GR, Bacon BR a kol. Pozitívna rovnováha železa pri chronickom ochorení obličiek: koľko je príliš veľa a ako povedať? Am J. Nefrol. 2018;47:72–83.

Howard RL, Buddington B, Alfrey AC. Močový albumín, transferín a vylučovanie železa u diabetických pacientov. Obličkový int. 1991;40:923–926.

A pod.