Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Pls kliknite sem do časti 1

Cistanche bylina má veľmi dobrý neuroprotekčný účinok

2.6. Anti-apoptotické účinky cytokinínov stanovené meraním aktivity Caspázy-3/7

Ako ukazujú vyššie opísané testy farbenia PI, SAL vyvolala zvýšenie úmrtnosti buniek SH-SY5Y. Keďže SAL je spojená s apoptózou aj nekrózou [51], skúmali sme aj aktiváciu kaspázy-3 a 7 (casp-3/7) ako špecifického markera apoptózy (fáza vykonávania) [52] po vystavení buniek CK. Kaspádovo-3/7 aktivity zaznamenané po liečbe každou z testovacích zlúčenín boli normalizované vzhľadom na tie, ktoré boli zaznamenané po liečbe 500 uM SAL (stanovené ako 100%). Ako je znázornené na obrázku 4, známy inhibítor kaspázy Ac-DEVD-CHO (zahrnutý ako špecifická kontrola súvisiaca s apoptózou) silne inhiboval aktivitu kaspázy-3/7 pri submigrárnych koncentráciách (na 36,3 ± 2,66 a 25,2 ± 2,69% hladín v bunkách liečených samotným SAL pri 0,05 a 0,5 uM). Podobné úrovne inhibície boli predtým ob- podávané [53] v rôznych modeloch neurodegenerácie na báze buniek in vitro SH-SY5Y. Pozitívna kontrola NAC tiež výrazne znížila aktivitu kaspázy-3/7 na 88,7 ± 1,87% a 78,5 ± 2,56% hladín indukovaných SAL pri 100 uM a 1000 uM. Testované CK mali širokú škálu účinkov na aktivity caspázy-3/7. Zaujímavé je, že z ribosidov CK malo významné účinky na činnosti pri 0,1 uM iba cZR (ich zníženie na 83,3 ± 4,33% hladín indukovaných SAL), zatiaľ čo iPR pri 1 uM nedošlo k výraznému zníženiu casp-3,7. Nakoniec K3G znížila aktivitu kaspázy-3/7 s maximálnym účinkom pri 10 uM (na 81,7 ± 4,31% hladiny vyvolanej SAL). Celkovo SAL vyvolalo 1,6-násobné zvýšenie aktivity kaspázy-3/7 v porovnaní so zdravými kontrolnými bunkami (CTR, obrázok 4) v súlade s výsledkami skoršej štúdie, v ktorej sa použila podobná koncentrácia SAL (400 uM) a rovnaká bunková línia [54]. NAC je známe, že ovplyvňuje aktivitu kaspázy-3/7 v niekoľkých modelochNeuronálnesmrť [55– 58]. Výsledky, ktoré sú tu prezentované, však poskytujú prvú demonštráciu ich kaspázy-3/7 v modeli SH-SY5Y na báze SALNeuronálnesmrť. Pozitívna kontrola znížila aktivitu kaspázy-3/7 vyvolanú 500 uM SAL podobným spôsobom ako CK, ale cZR a K3G boli účinné aj pri sub-mikromolárnych alebo mikromolárnych koncentráciách. Iné štúdie so stresovými modelmi spojenými s PD (inhibítor proteazómu MG 132- alebo H2O2 indukovaná toxicita v bunkách SH-SY5Y [17] a fibroblastoch [15]) a Hunt- ingtonovou chorobou (model hladovania v sére v bunkách PC12 [19]) tiež ukázali, že CKs K a tZR môžu mať anti-apoptotické (kaspáda-3) aktivity [17], a že K aj tZR môžu mať antisenescenčné aktivity [17,19]. Okrem toho, asociácie medzi klesajúcou aktiváciou CASP-3,7 aneuroprotektívneaktivita bola hlásená v prípade modelov súvisiacich so SAL a SAL [54,59,60].

Obrázok 4. Aktivita Caspase-3/7 v modeli PD vyvolanom SAL za najmenej štyri nezávislé dni. * P v porovnaní s vozidlom s 500 uM SAL, # P v porovnaní s vozidlom bez 500 uM SAL.

2.7. Identifikácia cytokinínovej neuroprotektívnej aktivity v modeli cellDeath indukovanej glutamátom

Keďže bunky SH-SY5Y nevyjadrujú všetky podjednotky nmda receptorov [61], najpravdepodobnejším mechanizmom glutamátovej toxicity (Glu) je zablokovanie cystínu/glutamátu Xc-antiporteru s masívnou indukciou oxidačného stresu [62]. Predchádzajúci autori už preukázali súvislosť medzi bunkovou smrťou vyvolanou glutamátom a nekroptózou v bunkách SH-SY5Y [63] a dôležitosť aktivácie kaspázy-3 v toxicite vyvolanej glutamátom na ich oddelenie [62,64]. Niekoľko štúdií tiež preukázalo výskyt bunkovej smrti poháňanej železom (ferroptóza) po intoxikácii glutamátom [62,65,66] a naznačilo výskyt troch typov bunkovej smrti (nekroptóza, apoptóza a ferroptoza) po blokáde Xc-antiporterového systému. Na dokončenie komplexného hodnotenianeuroprotektívnePotenciál testovanýchcytokíny, systém bunkovej smrti vyvolaný glutamátom bol zaradený do analytického panelu so známymneuroprotektívnedeferoxamín železa chelator (DFO) a inhibítor nekroptózy nekrostatínu-1 (NEC-1) [67] ako pozitívne kontroly. Tu boli bunky SH-SY5Y diferencované na 48 hodín, potom ošetrené 160 mM Glu alebo v ich spoločnej úprave rôznymicytokinínkoncentrácie (0,1 – 10 uM) počas 24 hodín a zafarbené PI. V tomto modeli bol účinok Glu na bunkovú smrť 100% PI signál, takže sa vyhodnotilo zníženie bunkovej smrti testovanými zlúčeninami. Glu indukoval takmer 4-násobné zvýšenie bunkovej smrti v porovnaní so zdravými kontrolami SH-SY5Y (26,1 ± 0,42%). preverovanie pozitívnych kontrol acytokínyukázalo sa, že obe pozitívne kontroly NEC-1 (50 uM,76,6 ± 2,51%) a DFO (10 uM, 84,2 ± 4,54%) znížili bunkovú smrť vyvolanú glutamátom. Ako je znázornené na obrázku5A, z panelucytokíny, iba tricytokínyBoli schopní chrániťneurón-ako bunky SH-SY5Y podobným spôsobom ako pozitívne kontroly. Najaktívnejšícytokínyboli trans-zeatín (tZ) (0,1 uM, 79,5 ± 2,91 %; 1 uM, 81,3 ± 2,77 %) a cis-zeatín (CZ) (0,1 uM, 82,1 ± 3,29 %; 1 uM, 86,2 ± 2,89 %) a kinetín (K) (1 uM, 88,0 ± 3,76 %; 10 uM, 79,9 ± 3,44 %). Na potvrdenie ich sľubnej aktivity sa použil ortogonálny test na podrobnejšie objasnenie biologických účinkov CK v tomto modeli: test uvoľňovania laktátudhydrogenázy (LDH) [68], ktorý tiež preukázal dramatické (4-násobné) zvýšenie toxicity po liečbe Gluom. Zaujímavé je, že stanovenie uvoľnenia LDH nám umožnilo rozlišovať medzi činnosťou CK a pozitívnymi kontrolami (NEC-1 a DFO). CK mali miernu, ale významnú ochrannú činnosť (tZ znížila úmrtnosť na 91,9 ± 1,40% pri 0,1 uM; cZ ich znížila na 92,3 ± 1,15% pri 0,1 uM a 91,7% ± 1,56% pri 1 uM; K ich znížil na 92,2 ± 1,06% pri 1 uM). Pozitívne kontroly NEC-1 a DFO mali silnejšie ochranné účinky, ale boli účinné pri oveľa vyšších koncentráciách (zníženie sadzieb na 76,9 ± 2,94% a 81,6 ± 3,74% pri 50 a 10 uM) (obrázok 5B). Skúška LDH potvrdila indikácie získané pri farbení PI a pozorované účinky pozitívnych kontrol boli v súlade so zverejnenými údajmi [69,70]. Zistenia týkajúce sa účinkov K v modeli bunkovej smrti indukovanej glumdom v bunkách HT22 [18] a naše pozorovania účinkov reprezentatívnych CK, ako sú tZ, cZ a K, ukazujú, že CK sú sľubnými kandidátmi na liečbu neurodegeneratívnych ochorení spojených s oxidačným stresom [71]. Nakoniec boli uprednostňované tZ a cZ, pretože boli účinné v nižších koncentráciách a boli vybrané spolu s K na ďalšie štúdie ich účinkov na hladiny oxidačného stresu a aktivácie kaspázy- 3,7.

cistancheHodnotenío účinkoch naneuroprotekcia

2.8. Účinky cytokinínov na oxidačný stres indukovaný glumom v bunkách SH-SY5Y

Na rozdiel od predchádzajúceho modelu môže Glu vyvolať oxidačný stres v bunkách SH-SY5Y rôznymi cestami. Jeden je založený na upchatí antiportéra Cystín/glutamát (Xc-), čo vedie k vyčerpaniu glutatiónu (GSH) a negatívnym účinkom na aktivitu superoxid dismutázy (SOD) [62]. Glum sprostredkovaná bunková smrť tiež domnele zahŕňa tvorbu ROS poháňanú Rac-NADPH oxidázou (najmä superoxidovým radikálom) v bunkách SH-SY5Y [72]. Tieto zistenia naznačujú, že primárnou príčinou bunkovej smrti v modeli indukovanom Gluom je OS. V rámci modelu,neurónbunky podobné boli spoluriešené gluom a testovanými zlúčeninami, zafarbené DHE a pozorované fluorescenčnou mikroskopiou. Ako je možné vidieť na obrázku 6A, dramatický nárast červenej fluorescencie DHE bol pozorovaný v bunkách ošetrených glumom, ktoré boli zmiernené pozitívnymi kontrolnými látkami a testovanými CK. Na základe pozorovania mikroskopie sa kvantifikácia hladín superoxidu vykonala v bunkách indukovaných glum podobným spôsobom, testom DHE, ako v bunkách indukovaných SAL. Výsledky boli normalizované vzhľadom na hladiny vyvolané samotným Gluom (nastavené ako 100%), čo spôsobilo dramatické, takmer 3-násobné zvýšenie hladín superoxidu v priebehu iba 4 hodín.neurón-ako bunky SH-SY5Y vo vzťahu k hladinám v zdravých kontrolných bunkách (CTR: 33,79 ± 1,45%). Ako je znázornené na obrázku 6B, CK ako tZ, cZ a K výrazne znížili hladinu superoxidu v bunkách intoxikovaných glumom: 0,1 uM tZ, 0,1 uM cZ, 1 uM a 10 uM K ju znížili na 81,0 ± 4,03, 80,6 ± 3,89, 81,8 ± 3,39 a 83,8 ± 2,32% hladín v bunkách ošetrených samotným Gluom. Tieto hladiny sú porovnateľné s hladinami získanými inhibítorom nekroptózy NEC-1 (80,5 ± 3,19% pri 5 uM a 80,4 ± 2,70% pri 50 uM) a železo-chelátorom DFO (80,2 ± 3,80% pri 10 uM). Výsledky získané s glu-indukovaným modelom bunkovej smrti, najmä účinky pozitívnych kontrol, sú v súlade s predchádzajúcimi správami [70,73]. Predchádzajúce dôkazy o tom, že CK majú účinky na zníženie operačného systému v glu-indukovaných alebo podobných modeloch, sa obmedzujú na preukázanie toho, že K je silným činidlom znižujúcim OS (pri približne 23 uM) v modeli smrti buniek indukovaných glumom na báze HT22 [18]. Zistili sme, že K mal účinok na zníženie operačného systému pri nižších koncentráciách (1 – 10 uM) v našich bunkách SH- SY5Y. Okrem toho sa pozorovali priaznivé dlhodobé účinky tZ na ľudské fibroblasty vrátane aktivity rozkladajúcej sa peroxidu vodíka [15], čo naznačuje, že tZ a cZ môžu mať nepriame účinky na zníženie OS v modeloch bunkovej smrti indukovaných glumom. Okrem toho sa v iných správach poukázalo na súvislosti medzi účinkami znižovania operačného systému sprostredkovaným CK a ochrannou činnosťou [22,74 – 76]. TZ, cZ a K spolu vykazovali prekvapivo silné účinky na zníženie operačného systému, porovnateľné s účinkami pozitívnych kontrol, napriek rôznym silným stránkam v celkovom meradle.neuroprotektívneúčinok.

Obrázok 5. a) Úmrtnosť naneurón-ako bunky SH-SY5Y v glutamátovom (Glu)indukovanom modeli bunkovej smrti; B) Toxicita vyvolaná glumom (uvoľňovanie LDH)neurón-ako bunky SH-SY5Y. Triplicates za najmenej tri nezávislé dni.* P v porovnaní s vozidlom so 160 uM Glu, # P v porovnaní s vozidlom bez 160 uM Glu.

Obrázok 6. A) Oxidačný stres vyvolaný glumom (OS) a aktivita indikovaných zlúčenín u ľudí znižujúca OSneurón-ako bunky SH-SY5Y vizualizované fluorescenčnou mikroskopiou po označení dihydroetion (DHE). Bary = 50 um. Obrázky ukazujúneurón-ako bunky SH-SY5Y ošetrené samotným DMSO (Control), 160 mM glutamátom (Glu) a spolu s: 10 uM deferoxamínom (+DFO), 50 uM nekrostatín-1 (+NEC-1), 0,1 uM tZ (+tZ) a 0,1uM cZ (+cZ) po dobu 4 h, potom zafarbené DHE. (B) Tvorba superoxidových radikálov indukovaných glumom vneurón-ako bunky SH-SY5Y po 4 hodinách. Graf zobrazuje kvantifikáciu dhe zafarbených buniek pomocou čítačky mikroplatňov Infinite M200 Pro (Tecan, Rakúsko). Trilicates za päť nezávislých dní.

* P v porovnaní s vozidlom so 160 uM Glu, # P v porovnaní s vozidlom bez 160 uM Glu.

2.9. Účinky cytokinínov na aktivitu Kaspázy-3/7 v modeli bunkovej smrti indukovanej glumom

Glu má podobné toxické účinky na bunky SH-SY5Y ako predtým hlásené účinky na bunky HT22 spojené s upchatím Xc-antiporterov. V oboch prípadoch sa teda podieľajú mechanizmy smrti neparoptotických buniek (ferroptoza, nekroptóza atď.) [62], hoci expresia kaspázy-3 a do určitej miery sa v bunkách SH-SY5Y môže výraznejšie vyskytnúť podjednotka NMDA NR1 [61]. Preto sa konečné štádiá bunkovej smrti v dvoch bunkových líniách môžu líšiť. Prispievajúca úloha aktivity kaspázy-3 bola pozorovaná v mnohých štúdiách v glu-indukovanom modeli bunkovej smrti buniek SH-SY5Y [62,77-79]. V tomto teste,neurón-ako SH-SY5Y bunky tu boli ošetrené 160 mM Glu, čo vedie k zvýšeniu aktivity kaspázy-3/7. V snahe objasniť úlohu apoptózy pri glu-indukovanej smrti buniek SH-SY5Y bol aplikovaný špecifický inhibítor kaspázy-3/7, Ac-DEVD-CHO, a zistilo sa, že má silný inhibičný účinok: Pri 50 nM znížil aktivitu kaspázy-3,7 na 23,70 ± 1,01% hladiny v liečených bunkách

so samotným Gluom a pri 0,5 uM takmer úplne zablokoval aktivitu (znížil ju na normalizovanú úroveň len 7,22 ± 1,05%; porovnateľnú s hladinou pozorovanou v zdravých bunkách:

7,8 ± 0,39 %), ako je znázornené na obrázku7. Aplikácia pozitívnych kontrol viedla k postupnému zníženiu aktivity kaspázy- 3,7 závislého od dávky. Zaujímavé je, že NEC-1 mal mierny účinok s maximálnym účinkom pri 50 uM a DFO mal robustnejšiu inhibičnú aktivitu pri 10 uM (zníženie aktivity na 80,5 ± 1,85 a 75,8 ± 3,00%). Na druhej strane len mierne, ale významné účinky na casp-3,7 dosiahli tZ pri 1 uM (89,5 ± 2,50 %), cZ pri 0,1 uM (87,4 ± 1,62 %) a K pri 1 uM (91,0 ± 2,06 %). Celkovo výsledky ukazujú, že obe pozitívne kontroly mali silnejšiu aktivitu znižujúcu aktivitu kaspázy-3/7 ako testované CC, ale CK mali účinky v oveľa nižších koncentráciách. Celkovo výsledky naznačujú, že modulácia aktivity caspázy-3/7 hrá kľúčovú úlohu v silnomneuroprotektívneaktivita činidiel, ako je DFO [58] v glu-indukovanom modeli bunkovej smrti [79,80]. Ako je však uvedené v tejto časti, NEC-1 mal tiežneuroprotektívneaktivita, čo naznačuje, že iné typy bunkovej smrti môžu byť zapojené do glu-indukovanej smrti buniek SH-SY5Y podobných neurónom [63,67,81]. Indikácie, že na bunkovej smrti indukovanej glumázou sú zapojené aj mechanizmy nezávislé od kaspázy, sa získali aj pri analýzach účinkov NEC-1 [70], DFO [69] a K [18] na bunky HT22.

Obrázok 7. Aktivita kaspázy-3/7 v glu-modeli oxidačného poškodenianeurón-ako bunky SH-SY5Y. Triplices za najmenej štyri nezávislé dni. * P v porovnaní s vozidlom so 160 uM Glu, # P v porovnaní s vozidlom bez 160 uM Glu.

3. Závery

Stručne povedané, naša štúdia odhalila, že CK a ich metabolity majúneuroprotektívnečinnosti v modeli vyvolanom SALParkinsonova chorobaa oxidačné poškodenie vyvolané glumom u človeka diferencovaného SH-SY5YNeuronálnebunky. Zistilo sa, že K3G, cZR a iPR majú biologicky významnéneuroprotektívneČinnosti. Okrem toho aktívne CK boli účinné pri nižších (submimolárnych a mikromolárnych) koncentráciách ako pozitívna kontrolná látka NAC. K3G, cZR a iPR mali tiež pozitívne účinky na životaschopnosť, cytotoxicitu, oxidačný stres a aktivitu kaspázy-3,7 (okrem iPR). Ortogonálne demonštrácie silne naznačujú, že antioxidačná stresová aktivita hrá kľúčovú úlohu v ochranných účinkoch CK v modeli bunkovej smrti indukovanej SAL. Iba tri metabolity v testovanom paneli CK (tZ, cZ a K) chránenéneurón-ako bunky SH-SY5Y v glu-indukovanom modeli oxidačného poškodenia podobným spôsobom ako chelátor železa NEC1 a inhibítor nekroptózy DFO. Aby sme potvrdili ich sľubnú aktivitu, testovali sme ich účinky v teste uvoľňovania ortogonálnej laktátu dehydrogenázy (LDH). CK mali miernu, ale významnú ochrannú aktivitu. To bolo slabšie ako zodpovedajúce činnosti kontrolných látok, ale napriek rozdielom v moduláciiNeuronálnezdravie, všetky tri testované CK stimulovali silné zníženie tvorby superoxidových radikálov, podobne ako pozitívne kontrolné látky. CK mali tiež porovnateľné účinky na oxidačný stres indukovaný glumom v bunkách SH-SY5Y ako NEC1 a DFO, ale tieto zlúčeniny mali silnejšie inhibičné účinky na aktivitu kaspázy-3/7 ako CC. Keďže bunková smrť indukovaná glumom sa nespolieha na dráhu závislú od kaspázy, ako sa ukázalo v štúdiách účinkov DFO a NEC-1 na bunky HT-22 [70], CK môžu zjavne modulovať kaskádovú závislú a nezávislú bunkovú smrť znížením oxidačného stresu [18,82]. V prebiehajúcich štúdiách podrobný mechanizmus účinku CC a/alebo ich mitochondriálnych účinkov naNeuronálnealebo sa vyšetria astrocytové bunky.

cistancheskúsenosťprePDapamäť

4. Materiály a metódy

4.1. Chemikálie a činidlá

Cytokinínštandardy boli získané od OlChemIm (Olomouc, Česká republika). Calcein AM (1 mg / ml roztok) a súprava na uvoľňovanie LDH a súprava na rast Neurite boli zakúpené od spoločnosti ThermoFisher. Propidium jodide, dihydroethidium, zložky kaspázy- 3/7 testovací tlmivý roztok, DMEM/F12 1:1 stredný, sérum hovädzieho dobytka plodu, trypsín, ATRA, salsolinol hydrobromid, glutamátová monosodná soľ, deferoxamín, N-acetylcysteín, Ac-DEVD-CHO a DMSO pre bunkové kultúry boli zakúpené od Sigma Aldrich (Merck). Substrát Ac-DEVD-AMC dodala spoločnosť Enzo Life Science.

4.2. Testy radikálnej aktivity ORAC Radical Scavenging Activity

Schopnosť zlúčenín zachytávať voľné radikály in vitro bola určená testom absorbančnej kapacity kyslíkových radikálov (ORAC). Stručne povedané, fluoresceín (100 uL, 500 mM) a 25 uL testovaného zloženého roztoku boli pridané do 96-jamkovej mikroplatne predinkubovanej pri teplote 37oC. Ďalej 25 uL o výmere 250 mM 2,2<-azobis(2-amidino-propane)dihydrochloride (aaph)="" was="" quickly="" added,="" the="" microplate="" was="" shaken="" for="" 5="" s="" and="" red="" fluorescence="" (with="" 485="" and="" 510="" nm="" excitation="" and="" emission="" wavelengths,="" respectively)="" was="" measured="" every="" 3="" min="" over="" 90="" min="" using="" an="" infinite="" 200="" microplate="" reader="" (tecan,="" männedorf,="" switzerland).="" nauc="" (net="" area="" under="" curve)="" values="" were="" used="" to="" express="" antioxidant="" activities="" relative="" to="" that="" of="" trolox="" (a="" synthetic="" hydrophilic="" analog="" of="" α-tocopherol,="" vitamin="" e).="" substances="" with="" orac="" values="" greater="" than="" zero="" are="" deemed="" to="" actively="" trap="" free="">

4.3.SH-SY5Y bunková kultúra

Ľudská neuroblastómová bunková línia SH-SY5Y zakúpená od SPOLOČNOSTI ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) bola pestovaná v upravenej zmesi živín Ea-gle a Ham's Medium and Ham's F12 (DMEM: F-12, 1:1), doplnená o 10% sérum hovädzieho dobytka plodu (FBS) a 1% penicilínu a streptomycínu pri teplote 37 oC vo zvlhčenej atmosfére CO2 5%. Bunky boli priechodné až 20-krát a médiá sa menili dvakrát alebo trikrát týždenne. Hustota buniek bola stanovená podľa potreby pre plánovanú skúšku (5000, 7000, 10 000 alebo 20 000 buniek na studňu) v 96-viacvláknových doskách v 100 uL celkových objemoch média pre každý experiment. Deň po výseve sa do buniek pridala ATRA v 1% médiu FBS DMEM/F12 do konečnej koncentrácie 10 uM a inkubácia pokračovala ďalších 48 hodín, aby sa indukovala diferenciácia, umožnila tvorba dlhších neuritov a znížila proliferácia.

4.4. Mikroskopia

Mikrografyneurón-ako bunky SH-SY5Y boli získané pomocou fluorescenčného mikroskopu DM IL LED (Leica Microsystems, Mannheim, Nemecko) s vhodným excitačným filtrom pre test alebo nastavením brightfieldu s vysokovýkonným digitálnym fotoaparátom DP73 (Olympus, Tokio, Japonsko). Keďže pomer signálu k šumu pre farbenie bol mierny, kontrast bol mierne upravený v softvéri ImageJ (Fidži) bez toho, aby to ovplyvnilo výsledné pozorovanie. Originálne obrázky sú zahrnuté v doplnkových materiáloch.

4.5. Zafarbenie bunkovej membrány (súprava neuritového výrastku, Invitrogen™)

Neurón-ako SH-SY5Y bunky (5000 buniek na vrt) získané diferenciačným postupom 48 hodín boli zafarbené súpravou na rast Neurite (Invitrogen™) podľa odporúčaní výrobcu s menšími úpravami. Bunky boli premyté PBS, označené roztokom membránového farbiva zafarbenia dodaného so súpravou (podľa protokolu pre 96 viacvláknových dosiek) v PBS počas 20 minút pri teplote 37 oC, znovu sa umyli PBS a pozreli sa pod fluorescenčným mikroskopom (s excitačnými a emisnými vlnovými dĺžkami 533 a 585 nm).

4.6. Bunková liečba

Po diferenciačnom postupe sa diferenciačné médium zmenilo na 1% DMEM/F12 medium doplnené testovanými zlúčeninami v koncentráciách 0,1, 1 a 10 uM (so 7000 bunkami na jamku na testy cytotoxicity) alebo spolu s toxínom SAL pri 500 uM (so 7000 – 10 000 bunkami na jamku) alebo 160 mM Glu (s 20 000 bunkami na jamku) počas primeraného trvania pre typ testu (životaschopnosť, životaschopnosť, bunková smrť atď.). Kontrolné bunky boli ošetrené médiom obsahujúcim 。 0,1% z DMSO.

4.7. Životaschopnosť buniek a bunková smrť

Životaschopnosťneurón-ako bunky SH-SY5Y rastúce v mikroplatniach s 96 jamkami (s cca 7000 bunkami na vrt) po 24 hodinách liečby boli hodnotené testom Calcein AM s malou modifikáciou [31]. Roztok Calcein AM v použitej PBS mal koncentráciu 0,75 uM a inkubačný čas bol stanovený na 50 minút. Počet živých buniek v každej studni bol stanovený pomocou čítačky mikroplatňov Infinite M200 Pro (Tecan, Rakúsko) s excitačnými a emisnými vlnovými dĺžkami 495 a 517 nm.

Bunková smrťneurón-bunky podobné bunkám (model SAL: 10 000 buniek na jamku; Glu-model: 20 000 buniek na vrt) bol určený pi testom, ako uvádza Stone et al. 2003 s malou modifikátou katiónom [83]. Stručne povedané, médium modelu vyvolaného SAL bolo nasávané a zmenené na 1 ug/ml roztok PI v PBS, ale bunky vystavené gluindukcii majú slabšiu adherenciu, takže sa pridal 1 mg/ml roztoku PI v PBS, aby sa dosiahla konečná koncentrácia 1 ug/ml. V oboch prípadoch boli bunky inkubované ďalších 15 až 25 minút pri izbovej teplote, potom bola PI fluorescencia meraná čítačkou Infinite M200 Pro (Tecan, Grödig, Rakúsko) s 535 a 617 excitačnými a emisnými vlnovými dĺžkami. Výsledná fluorescencia PI získaná samotnými toxínmi bola stanovená ako 100% bunková smrť.

4.8. Meranie oxidačného stresu testom dihydroethidia (DHE)

Bunky boli diferencované a ošetrené tak, ako je opísané v predchádzajúcej časti pre SAL- indukciu (10 000 buniek na jamku, 24 h alebo Glu-indukciu (20 000 buniek na vrt, 4 h). Po ošetrení boli bunky odstredené na 500 x g po dobu 330 s, potom boli kultivačné médiá nahradené (po aspirácii) roztokom 10 uM DHE v PBS. 96-viacvrstvové platne s bunkami boli inkubované v tme po dobu 30 minút pri izbovej teplote, potom bola FLUORESCENCIA DHE meraná mikroplatničkou Infinite M200 Pro (Tecan, Grödig, Rakúsko) s excitačnými a emisnými vlnovými dĺžkami 500 a 580 nm. Výsledná fluorescencia DHE získaná samotným SAL alebo Gluom bola nastavená ako 100% tvorba superoxidových radikálov. Ilustračné fluorescenčné mikrofotografy dhe-zafarbených buniek boli získané po meraní DHE pomocou čítačky mikroplatňov.

Cistanche rastlina má veľmi dobrý neuroprotektívny účinok

4.9. Meranie činnosti Caspázy-3/7

Jednostupňové testy kaskády-3/7 sa vykonali podľa predtým zverejneného postupu [84]. V prípade kultúr vystavených SAL-indukcii a gluindukcii boli reakčné zmesi (tlmivý roztok caspázy - 3,7 a zložky s bunkami v 96-viacvrstvových platniach) inkubované počas 2 h a 3 h pri teplote 37 oC. Aktivita Caspase-3/7 bola potom meraná mikroplatňovou čítačkou Infinite M200 Pro (Tecan, Rakúsko) s excitačnými a emisnými vlnovými dĺžkami 346 a 438 nm.

4.10. Štatistická analýza

Experimenty boli vykonané v troch až piatich (n = 3-5) nezávislých dňoch. Všetky údaje sú vyjadrené ako stredná hodnota ± SEM. Hodnoty pre všetky namerané premenné sú vyjadrené ako prostriedky ± SEM, ktoré boli vypočítané pomocou Hranolu 8.4.3 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA), ktorý bol tiež použitý na generovanie čísel. Štatistická analýza bola vykonaná softvérovým balíkom PAST (ver. 1.97) [85]. Pre diferenciačný experiment bol použitý študentský t-test. Zvyšok experimentov bol vyhodnotený ne parametrickým Kruskal-Wallisovým testom s Mann-Whitney post hoc testom so sekvenčnou Bonferroniho korekciou. Hodnota p< 0.05="" was="" considered="">

Doplňujúce materiály: Originálne obrázky sú k dispozícii online.

Príspevky autora: Príspevky autorov boli nasledovné: Vyšetrovanie, metodika, validácia, analýza údajov, G.G., C.W.D. a J.G.; písanie – pôvodný návrh prípravy G.G., C.W.D. a M.S.; kurátorstvo údajov, získavanie finančných prostriedkov, dohľad, písanie – recenzia a úprava, C.W.D., M.S., a P.K. Všetci autori si prečítali a súhlasili s publikovanou verziou rukopisu.

Financovanie: Táto práca bola čiastočne finančne podporená z grantov Internej grantovej agentúry Univerzity Palackého v Olomouci v Českej republike (IGA_PrF_2020_021), Českej grantovej agentúry (20 – 15621S) a Európskeho fondu regionálneho rozvoja – projektu ENOCH (č. CZ.02.1.01/0.0/0.0/ 16_019/0000868) a študentský grant z Nadačného fondu Univerzity Palackého.

Vyhlásenie inštitucionálnej revíznej komisie: Neuplatňuje sa.

Vyhlásenie o informovanom súhlase: Neuplatňuje sa.

Vyhlásenie o dostupnosti údajov: Údaje sú obsiahnuté v článku alebo doplnkovom materiáli.

Uznania: Autori ďakujú Dita Jordovd, Jana Hrubešovd a Lucie Koplikovd za vynikajúcu technickú pomoc. Okrem toho autori ďakujú Sees-editing Ltd., Spojené kráľovstvo za anglickú úpravu rukopisu.

Konflikt záujmov: Autori nevyhlásia žiadny konflikt záujmov.

Dostupnosť vzorky: Vzorky zlúčenín nie sú k dispozícii od autorov.