Norwogonin zmierňuje hypoxiou indukovaný oxidačný stres a apoptózu v bunkách PC12

Pre viac informácií:ali.ma@wecistanche.com

Abstraktné

Pozadie: Norwogonin je prírodný flavón s tromi fenolickými hydroxylovými skupinami v štruktúre skeletu a má vynikajúceantioxidantčinnosť. Neuroprotektívny účinok norwogonínu však zostáva nejasný. Tu sme skúmali ochrannú kapacitu norwogonínu proti oxidačnému poškodeniu vyvolanému hypoxiou v bunkách PC12. Metódy: Životaschopnosť buniek a apoptóza boli skúmané testom MTT a farbením Annexin V-FITC/PI. Obsah reaktívnych foriem kyslíka (ROS) sa meral pomocou testu DCFH-DA. Laktátdehydrogenáza (LDH), malondialdehyd (MDA) aantioxidanthladiny enzýmov boli stanovené pomocou komerčných súprav. Expresia príbuzných génov a proteínov bola meraná kvantitatívnou PCR v reálnom čase a Western blottingom. Výsledky: Zistili sme, že norwogonín zmiernil poškodenie vyvolané hypoxiou v bunkách PC12 zvýšením životaschopnosti buniek, znížením uvoľňovania LDH a zlepšením zmien v morfológii buniek. Norwogonin tiež pôsobil ako anantioxidantvychytávaním ROS, znížením produkcie MDA, zachovaním aktivít superoxiddismutázy (SOD), katalázy (CAT) a glutatiónperoxidázy (GPx) a znížením hladín expresie HIF{0}} a VEGF. Okrem toho wogonín zabránil apoptóze buniek inhibíciou hladín expresie kaspázy-3, cytochrómu c a Bax, pričom zvýšil hladiny expresie Bcl-2 a pomer Bcl-2/Bax. Závery: Norwogonin zmierňuje poškodenie vyvolané hypoxiou v bunkách PC12 uhasením ROS, pričom zachováva aktivityantioxidantenzýmy a inhibíciu mitochondriálnej apoptózovej dráhy.

Kľúčové slová: Norwogonin,Antioxidačná aktivita, Hypoxia, Oxidačný stres, Apoptóza

Pozadie

Aeróbne organizmy potrebujú kyslík (O2) na výrobu energie. Hypoxia je definovaná ako nedostatočný prísun O2 na udržanie bunkovej funkcie v tkanive a často sa vyskytuje v niektorých fyziologických situáciách, ako je vysoká nadmorská výška [1], a v mnohých patologických situáciách, ako je mŕtvica [2]. Mozog je obzvlášť citlivý na poškodenie spôsobené hypoxiou kvôli vysokej spotrebe kyslíka, bohatému na nenasýtené mastné kyseliny a nízkejantioxidantkapacita [3]. Čoraz viac dôkazov naznačuje, že hypoxia môže vyvolať nepriaznivé účinky na mozog [4–6].

Linlin Jing, Rongmin Gao, Jie Zhang, Dongmei Zhang, Jin Shao, Zhengping Jia a Huiping Ma

Oddelenie farmácie, 940. nemocnica spoločnej logistickej podpory PLA, Lanzhou 730050, Gansu, Čína

Oxidačný stres a apoptóza sa považujú za dva faktory prispievajúce k poškodeniu vyvolanému hypoxiou [7, 8]. Bolo hlásené, že vystavenie hypoxii zvyšuje produkciu intracelulárnych reaktívnych foriem kyslíka (ROS), čo uľahčuje oxidačný stres. Nadmerné ROS, ako je superoxidový anión (O2−˙), peroxid vodíka (H2O2) a hydroxylový radikál (HO•), vedie k štrukturálnym a funkčným bunkovým zmenám napadnutím lipidov, membrán, proteínov a DNA a následne spôsobuje poškodenie buniek [ 9].

Kliknite na Cistanches pre antioxidant

Súčasne nadprodukovaná ROS tiež uľahčuje otvorenie mitochondriálneho permeabilného prechodového póru (mPTP) [10] a prenos proapoptóznych proteínov na vonkajšiu mitochondriálnu membránu, čo vyvoláva depolarizáciu mitochondriálnych membrán a uvoľňovanie cytochrómu c [11]. Tieto zmeny v konečnom dôsledku spôsobujú mitochondriálne závislú apoptózu [12]. Takže sa verí, žeantioxidantyso schopnosťou inhibovať alebo eliminovať nadmerné ROS môžu uplatniť svoj ochranný účinok prostredníctvom zmiernenia oxidačného stresu a apoptózy indukovanej hypoxiou. Dokázalo to množstvo štúdiíantioxidantdoplnky ako vitamín C [13], izoflavón [8] a nitroxidové radikály [14] môžu obmedziť poškodenie spôsobené hypoxiou in vitro a in vivo. Flavonoidy sú veľkou a rôznorodou triedou všadeprítomných rastlinných sekundárnych metabolitov. Vždy sú považované za vynikajúce prírodnéantioxidantso schopnosťou zachytávať voľné radikály a inhibovať peroxidáciu lipidov.

V súčasnosti sa tejto triede zlúčenín venuje čoraz väčšia pozornosť pre ich priaznivé účinky na ľudské zdravie. Ukázalo sa, že flavonoidy majú široké spektrum farmakologických účinkov, ako je protizápalová, antinociceptívna a neuroprotektívna aktivita atď., pričom všetky možno pripísať ich antioxidačným aktivitám [15]. Mnohé štúdie ukázali, že flavonoidy vykazujú vynikajúce ochranné účinky na zlyhanie spôsobené hypoxiou. Napríklad rutín má silný neuroprotektívny účinok proti smrti gangliových buniek sietnice vyvolanej hypoxiou [16]. Nedávna štúdia tiež ukazuje, že rutín môže zmierniť poškodenie hypoxiou vyvolané chloridom kobaltnatým inhibíciou oxidačného stresu a apoptózy v bunkách H9c2 [17]. Okrem toho Liu et al naznačujú, že nobiletín (3′,4′,5,6, 7,8-hexametoxyflavón) zmierňuje I/R poškodenie myokardu prostredníctvom aktivácie Akt/GSK-3 dráhy v bunke H9c2 [18]. Okrem toho môže akacetín chrániť potkanie kardiomyocyty a kardiomyoblasty H9C2 pred poškodením vyvolaným hypoxiou/reoxygenáciou prostredníctvom aktivácie signálnej dráhy Nrf2 sprostredkovanej AMPK [19].

Norwogonin (5,7,8-trihydroxyflavón, obr. 1) je farmakologicky aktívny flavón oddelený od koreňa Scutellaria baicalensis Georgi ("Huang Qin" v čínštine), tradičnej čínskej byliny používanej na liečbu chrípky a rakoviny [20, 21]. Boli však publikované obmedzené štúdie o biologických aktivitách norwogonínu v dôsledku jeho nízkych hladín v prírodných rastlinách. Na vyriešenie tohto problému sa uvádza niekoľko spôsobov syntézy norwogonínu [22, 23].

Naša predchádzajúca štúdia tiež stanovila jednoduchú metódu na získanie norwogonínu z chryzínu v štyroch krokoch [24]. Tieto výskumy pozitívne ovplyvnili ďalšie hodnotenie biologických aktivít norwogonínu. Štúdie ukázali, že norwogonín má antioxidačné [25], protirakovinové [26, 27], antivírusové [28] a antimikrobiálne účinky [29], ako aj inhibuje kyanidom stimulovanú produkciu ROS [30]. Avšak, či má norwogonín ochranné schopnosti proti poškodeniu spôsobenému hypoxiou, zostáva neznáme. Cieľom tejto štúdie bolo skúmať ochranné účinky norwogonínu proti hypoxiou indukovanému oxidačnému stresu a apoptóze v bunkách PC12.

Metódy

Materiály a činidlá

Norwogonín (čistota väčšia alebo rovná 98 percent) bol syntetizovaný podľa našej predtým publikovanej metódy [24]. Rutín (čistota väčšia alebo rovná 96 percentám) bol zakúpený od Ci Yuan Biotechnology Co., Ltd. (Xian, Shannxi, Čína). Norwogonín a rutín sa rozpustili v sterilnom dimetylsulfoxide (DMSO), skladovali pri -20 stupňoch a bezprostredne pred použitím sa zriedili v médiu bunkovej kultúry. Dulbeccovo modifikované Eaglovo médium (DMEM), fetálne bovinné sérum (FBS), streptomycín a penicilín boli zakúpené od Solarbio co., Ltd. (Peking, Čína).

Súpravy malondialdehydu (MDA), laktátdehydrogenázy (LDH), superoxiddismutázy (SOD), katalázy (CAT) a glutatiónperoxidázy (GPx) boli získané od Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Jiangsu, Čína). 2',7'-dichlorid-hydrofluoresceín diacetát (DCFH-DA) a (3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5- difenyltetrazolium bromid) tetrazólium (MTT) bol získaný od Sigma-Aldrich Co (St. Louis, MO, USA). Primárne protilátky pre hypoxiou indukovateľný faktor-1 (HIF-1), vaskulárny endoteliálny rastový faktor (VEGF), B bunkový lymfóm-2 (Bcl-2), Bcl{{17 }} asociovaný proteín X (Bax), kaspáza-3, cytochróm C a -aktín boli zakúpené od spoločnosti Abcam (Cambridge, Spojené kráľovstvo). Sekundárne protilátky boli získané od ZsBio Company (Peking, Čína).

Súprava na analýzu apoptózy bola získaná od Beyotime Institute of Biotechnology (Jiangsu, Čína). Všetky chemikálie a rozpúšťadlá boli analytickej kvality a boli získané od komerčného dodávateľa v Číne. Bunková kultúra Bunky PC12 boli zakúpené od Cell Bank Čínskej akadémie vied (TCR 9, Shanghai, Čína) a udržiavané v DMEM s 10 percentami (objem/objem) FBS, 100 U/ml penicilínu a 100 U/ml streptomycínov. pri 37 stupňoch vo zvlhčenom inkubátore obsahujúcom 5 percent CO2. Na vyhodnotenie cytotoxicity norwogonínu sa bunky PC12 (pasáž 4 až 6) vopred inkubovali s rôznymi koncentráciami (10-8, 10-7, 10-6, 10-5, 10-4 mol/l) norwogonínu pre 1 h a potom kultivované počas 24 h. Vystavenie hypoxii Na vyvolanie modelu poškodenia bunkovej hypoxie boli bunky PC12 vystavené hypoxickému prostrediu (1 percento O2, 5 percent CO2 a 94 percent N2) pri 37 stupňoch počas 24 hodín vo zvlhčenej komore. Normoxické kontrolné bunky sa kultivovali pri 37 stupňoch v inkubátore s 5 % CO2 počas 24 hodín.

Na vyhodnotenie ochranného účinku norwogonínu proti poškodeniu spôsobenému hypoxiou sa bunky PC12 predinkubovali s rôznymi koncentráciami (10−8, 10−7, 10−6, 10−5 mol/ L) norwogonínu počas 1 hodiny pred liečbou hypoxie. Životaschopnosť buniek Životaschopnosť buniek sa merala testom MTT, ako už bolo opísané [31]. Stručne povedané, bunky PC12 (1 x 105 buniek/ml) sa naočkovali na 96-jamkové kultivačné platne. Potom sa do jamiek pridali rôzne koncentrácie norwogonínu. Do kontrolných jamiek sa pridal rovnaký objem DMSO. Konečná koncentrácia DMSO v médiu bunkovej kultúry je 0,1 percenta. Po inkubácii za normoxických alebo hypoxických podmienok sa do každej jamky pridalo 10 ul MTT (5, 0 mg / ml), nasledovala inkubácia pri 37 stupňoch počas 4 hodín. Potom sa supernatant s MTT odstránil a formazanový produkt sa rozpustil v 100 ul DMSO. Absorbancia sa merala na čítačke mikrodoštičiek SpectraMax i3 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) pri 570 nm. Výsledky boli vyjadrené ako relatívne percento kontrolnej skupiny. Bunky PC12 farbené hematoxylínom a eozínom (HE) nasadené na sklenené krycie sklíčka boli inkubované 24 hodín predtým, ako boli ošetrené norwogonínom rovnakým spôsobom, ako je opísané vyššie.

Médium sa odstránilo a sklenené krycie sklíčka sa premyli studeným PBS, nasledovala fixácia metanolom počas 10 minút pri teplote miestnosti a potom sa trikrát premyli studeným PBS počas 5 minút. Nakoniec boli bunky zafarbené podľa protokolu farbenia HE [32]. Analýzy bunky sa uskutočňovali pomocou mikroskopu OLYMPUS IX73 (100x), aby sa overili morfologické zmeny buniek. Digitálne obrázky boli získané pomocou digitálneho fotoaparátu DXM 1200 C (Nikon) spojeného s mikroskopom. Obsah ROS Intracelulárna hladina ROS v bunkách PC12 bola stanovená pomocou testu DCFH-DA [33]. V stručnosti, bunky PC12 (1 x 105 buniek/ml) sa naočkovali na 6-jamkové platne. Po ošetrení hypoxiou sa bunky PC12 premyli PBS a potom sa inkubovali v kultivačnom médiu obsahujúcom 10 uM DCFH-DA počas 30 minút v tme pri 37 stupňoch. Bunky sa pozorovali invertovaným fluorescenčným mikroskopom Olympus (Tokio, Japonsko) a analyzovali sa prietokovým cytometrom Bec ton Dickinson FACScan (BD Biosciences, CA, USA) s vlnovou dĺžkou excitácie 488 nm a vlnovou dĺžkou emisie 525 nm. Hladina ROS bola vyjadrená ako relatívne percento kontroly. Únik LDH, obsah MDA a antioxidačná enzýmová aktivita Bunky PC12 (1 x 105 buniek/ml) sa naočkovali do misky s priemerom 90 mm. Po ošetrení hypoxie, ako je opísané vyššie, sa zhromaždilo 50 ul supernatantu kultúry z každej misky a aktivita LDH v médiu sa detegovala pomocou komerčných testovacích súprav (Jiancheng Institute of Biotechnology, Nanjing, Čína) a vyjadrila sa ako U / ml. Bunky PC12 boli zozbierané a homogenizované po dvojnásobnom premytí studeným PBS. Koncentrácia celkového proteínu sa merala pomocou súpravy na testovanie proteínov BCA. Obsah MDA a antioxidačná enzýmová aktivita boli stanovené pomocou komerčných testovacích súprav (Jiancheng Institute of Biotechnology, Nanjing, Čína).

Obsah MDA bol prezentovaný ako nmol/mg proteínu. Aktivity SOD, CAT a GPx boli prezentované ako U/mg proteínu. Apoptóza buniek (farbenie Annexin-V/PI) Po ošetrení hypoxiou sa bunky PC12 zozbierali, premyli sa dvakrát studeným PBS a potom sa suspendovali vo väzbovom pufri. Bunky boli ošetrené roztokom Annexinu V-FITC a PI podľa protokolu výrobcu (Beyotime, Shanghai, Čína). Zber údajov sa uskutočnil pomocou prietokového cytometra Becton Dickinson FACScan (BD Biosciences, CA, USA). Kvantitatívna PCR analýza v reálnom čase Celková RNA buniek PC12 bola extrahovaná pomocou činidla Trizol (Takara, Dalian, Čína) a konvertovaná na cDNA pomocou súpravy reagentov PrimeScript TM RT (AK4301,

Takara, Dalian, Čína). cDNA kódujúca HIF{0}}, VEGF, Bcl{1}}, Bax, kaspázu-3, cytochróm C a gén glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázy (GAPDH) sa amplifikoval kvantitatívnym reálnym time PCR s použitím 7300 detekčného systému v reálnom čase (Applied Biosystems, CA, USA). Použité priméry sú uvedené v tabuľke 1. Podmienky cyklovania PCR boli 95 stupňov počas 30 sekúnd, po ktorých nasledovalo 40 cyklov 95 stupňov počas 5 sekúnd a 60 stupňov počas 31 sekúnd. Hladiny mRNA boli vypočítané pomocou 2-ΔACt metódy a normalizované na GAPDH, čo je referenčný gén. Western blot PC12 bunky boli zozbierané a homogenizované v RIPA činidlách. Koncentrácia celkových proteínov sa kvantifikovala pomocou súpravy na testovanie proteínov BCA. 30 ug vzoriek sa rozdelilo na 12-percentnú SDS-PAGE elektroforézu a potom sa prenieslo na polyvinylidénfluoridové (PVDF) membrány (Millipore, Billerica, MA, USA).

Membrány boli blokované 5 percentným odtučneným sušeným mliekom v TBST pufri počas 1 hodiny pri izbovej teplote a inkubované s primárnymi protilátkami: anti-HIF-1 (1:300, ab179483, Abcam, Spojené kráľovstvo), anti-VEGF (1:1000, ab46154, Abcam, Spojené kráľovstvo), anti-Bcl-2 (1:1000, ab59348, Abcam, Spojené kráľovstvo), anti-Bax (1:500, ab32503, Abcam, Spojené kráľovstvo), anti kaspáza{21}} (1:300, ab44976, Abcam, Spojené kráľovstvo), anti cytochróm C (1:1000, ab13575, Abcam, Spojené kráľovstvo) a anti{28}}aktín (1:2000, ab8227 , Abcam, UK) pri 4 stupňoch cez noc. Potom sa membrány premyli a inkubovali so sekundárnymi protilátkami (1:2000, ZsBio, Peking, Čína;) počas 1 hodiny pri teplote miestnosti. Imunoreaktívne pásy sa vizualizovali pomocou činidiel zosilnenej chemiluminiscencie (ECL). Relatívne intenzity pásov boli normalizované na vnútornú kontrolu -aktín a analyzované pomocou Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD, USA).

Štatistická analýza

Výsledky boli vyjadrené ako priemer ± SD odvodený z aspoň troch nezávislých experimentov. Rozdiel medzi skupinami bol analyzovaný pomocou jednosmernej analýzy rozptylu (ANOVA), po ktorej nasledoval Student-Newman-Keuls post hoc test. P-hodnota < 0,05="" bola="" považovaná="" za="" štatisticky="">

Výsledky

Norwogonínové ochranné bunky PC12 proti poškodeniu vyvolanému hypoxiou

Po prvé, aby sa zabránilo proliferatívnej aktivite norwogonínu, jeho cytotoxicita na normálne bunky PC12 sa stanovila pomocou testu MTT. Ako je vidieť na obr. 2a, bunková proliferácia sa významne nezmenila po liečbe norwogonínom v koncentráciách 1 × 10- 8 -1 × 10-5 mol/l (P > 0,05 ). Životaschopnosť buniek sa však výrazne znížila, keď sa koncentrácia norwogonínu zvýšila na 1 × 10-4 mol/l (P < 0,05).="" výsledky="" ukázali,="" že="" norwogonín="" nevykazoval="" toxicitu="" ani="" proliferatívnu="" aktivitu="" na="" bunky="" pc12="" v="" koncentráciách="" 1="" ×="" 10-="" 8="" -1="" ×="" 10-5="">

Potom sme skúmali ochranný účinok norwogonínu proti poškodeniu buniek PC12 vyvolanému hypoxiou. Ako je znázornené na obr. 2b, v porovnaní s kontrolnou skupinou bola životaschopnosť buniek v skupine s hypoxiou znížená na 58,71 percent (P < 0.01).="" v="" porovnaní="" s="" liečbou="" hypoxie,="" vopred="" ošetrené="" 1="" ×="" 10−8,="" 1×10−7="" a="" 1×10−6="" mol/l="" norwogonínu="" chráneného="" pc12="" v="" závislosti="" od="" dávky="" buniek="" proti="" poškodeniu="" vyvolanému="" hypoxiou,="" čím="" sa="" obnovila="" životaschopnosť="" buniek="" z="" 58,71="" na="" 62,79="" percent="" (p="">< 0,05),="" 66,68="" percent="" (p="">< 0,01)="" a="" 69,88="" percent="" (p="">< 0,01).="" predošetrenie="" 1="" ×="" 10-6="" mol/l="" rutínu="" tiež="" vykazovalo="" ochranný="" účinok,="" významne="" zvýšilo="" životaschopnosť="" buniek="" na="" 63,="" 78="" percent="" v="" porovnaní="" s="" liečbou="" hypoxiou.="" životaschopnosť="" vopred="" ošetrená="" 1="" ×="" 10-5="" mol/l="" norwogonínu="" sa="" znížila="" na="" 63,43="" percenta,="" čo="" je="" stále="" výrazne="" vyššie="" ako="" v="" skupine="" s="" hypoxiou="" (p="">< 0,05).="" tieto="" výsledky="" ukázali,="" že="" norwogonín="" vykazoval="" významnú="" cytoprotekciu="" pri="" koncentráciách="" 1="" ×="" 10-="" 8="" -1="" ×="" 10-5="" mol/l="" a="" najúčinnejšia="" koncentrácia="" je="" 1="" ×="" 10-6="" mol/l.="" potom="" sa="" táto="" dávka="" použila="" ako="" optimálna="" dávka="" v="" nasledujúcich="">

Ochranná kapacita norwogonínu bola overená aj morfologickými zmenami. Ako je znázornené na obr. 2c, bunky PC12 bez ošetrenia hypoxiou dobre rástli s pravidelnými tvarmi (vretenovitými), jednotnými veľkosťami. Po vystavení hypoxii bunky PC12 vykazovali zmrštenie, zaoblený tvar, deskvamáciu a zníženú hustotu buniek. Bunky vopred ošetrené norwogonínom alebo rutínom pred vystavením hypoxii rástli lepšie, počet deskvamačných buniek sa znížil a tvar buniek sa normálne obnovil. Okrem toho bola ochranná schopnosť norwogonínu potvrdená únikom LDH, ktorý je spojený so stratou integrity bunkovej membrány. Ako je znázornené na obr. 2d, aktivita LDH v kultivačnom médiu sa výrazne zvýšila po vystavení hypoxii (P <>

Predbežné ošetrenie norwogonínom alebo rutínom dramaticky znížilo únik LDH, čo naznačuje, že norwogonín a rutín obnovili integritu bunkovej membrány. Norwogonin inhibuje oxidačný stres vyvolaný hypoxiou v bunkách PC12 ROS a MDA sú dva dôležité indikátory bunkového oxidačného stresu vyvolaného hypoxiou. Ako je znázornené na obr. 3a a 3b, po vystavení hypoxii bol v bunkách PC12 pozorovaný výrazne zvýšený obsah ROS a MDA. Predbežná liečba norwogonínom alebo rutínom významne inhibovala produkciu ROS a MDA.

Antioxidačné enzýmy, ako sú SOD, CAT a GPx, sú považované za hlavný obranný systém proti oxidačnému stresu v bunkách. Ako je znázornené na obr. 3c-e, vystavenie hypoxii významne inhibovalo aktivity SOD, CAT a GPx v bunkách PC12. Liečba norwogonínom alebo rutínom tieto zmeny zvrátila a obnovila činnosť antioxidačných enzýmov. Všetky tieto výsledky ukázali, že norwogonín chránil bunky PC12 pred oxidačným stresom vyvolaným hypoxiou.