Časť 4: Mapovanie epigenomickej a transkriptomickej súhry počas formovania a vybavovania pamäti v súbore Hippocampal Engram Ensemble
Mar 22, 2022
ali.ma@wecistanche.com
RNA-sekv
ul vody bez nukleázy) počas 30 minút pri 37 °C s jemným kývaním. Augmentované fragmenty DNA boli amplifikované a označené čiarovým kódom pomocou PCR reakcie (1 cyklus; 5 min – 72 c, 30 s – 98 c, 10 cyklov; 15 s – 98 c, 30 s – 60 c, 3 min – 72 c). Podľa protokolu výrobcu bola amplifikovaná DNA vyčistená a purifikovaná pomocou 1,8x AMPure guľôčok (AmpureXP beads, Beckman Coulter, A63880). Po bioanalyzátore QC pre veľkosť a distribúciu knižnice boli knižnice sekvenované na platforme Illumina Nextseq 550 v MIT BioMicro Center.
Cistanche a Cistanches na zlepšenie pamäte
Analýza ATAC-seq – nespracované údaje fastq z 40-odčítaní párového sekvenovania bp boli zarovnané s referenčným genómom myši mm9 pomocou Bowtie 2.{5}} v režime párového konca50. Kolekcia Samtools51 sa použila na triedenie, odstránenie duplikátov PCR (rmdup), indexovanie súborov BAM (index) a výpočet štatistických údajov knižnice (flagstat, pozri doplnkovú tabuľku 13). Súbory BAM boli prevzorkované zo správne zarovnaných, spárovaných a jedinečných načítaní na 50 miliónov. Otvorené chromatínové píky sa analyzovali pomocou softvéru MACS252. Rozdielne dostupné oblasti (DAR) boli identifikované pomocou Diffbind v1.16.353 s predvolenými parametrami a nastaveniami na použitie DESeq2 (medzná hodnota; FDR < 0,01;="" násobné="" zmeny=""> 1,5). Úplná matica normalizovaných počtov (RPKM54) bola získaná balíkom DiffBind. Pre generáciu bigwigových stôp boli súbory signálu pileup (hromadenie fragmentov na milión prečítaní) v biografickom formáte skonštruované pomocou funkcie špičky hovoru MACS2 s príznakmi -B –SPMR. Potom sa pomocou funkcie bdgcmp MACS2 s nastavením - m FE vygenerovalo normalizované násobné obohatenie (FE) cez vstupné stopy lambda. Potom boli súbory bedGraph prevedené do formátu bigwig.
Na vizualizáciu veľkých súborov boli použité nástroje IGV55. ChromHMM56 sa použil na vytvorenie modelu chromatínového stavu z dvoch nezávislých štúdií, ktoré využívali objemové tkanivo hipokampu pred a po šoku nohy21, 22 a na určenie násobku obohatenia DAR oproti štátnemu modelu. Analýza obohatenia motívu57,58 a anotácia píkov bola vykonaná nástrojmi HOMER59. Všetky kódy sú dostupné v doplnkovom softvérovom súbore extrakcia RNA a príprava knižnice – Ihneď po fixácii a triedení (pozri prípravu tkaniva) sa pridali 4 ul proteázy do tlmivého roztoku na trávenie (RecoverAll™ Total Nucleic Acid Isolation Kit pre FFPE, Life Technologies, AM1975) . Vzorky sa inkubovali v tepelných blokoch 15 minút pri 50 stupňoch, potom 15 minút pri 80 stupňoch. Potom sa do každej vzorky pridalo 0,75 ml Trizol LS (TRIzol™ LS Reagent, Thermo Fisher Scientific, 10296028) a 0,2 ml roztoku fenol:chloroform (fenol:chloroform: izoamylalkohol, 1 fáza, VWR International, K169) a následne intenzívne trepanie počas 5 minút pri teplote miestnosti (RT). Suspenzia sa umiestnila do ťažkých skúmaviek s gélom Phase lock (PLG, 5 Prime, 2302830) a odstreďovala sa pri 13000 otáčkach za minútu počas 5 minút. Vodná fáza s nukleovými kyselinami bola extrahovaná zo skúmaviek do čerstvej Eppendorfovej skúmavky s rovnakým množstvom 100 percentného etanolu. Purifikácia RNA sa uskutočnila pomocou súpravy Direct-zol™ RNA MicroPrep (Zymo Research, R2060) na čistenie RNA podľa pokynov výrobcu. RNA sa eluovala (10 ul, DEPC) a potom sa skladovala pri -80 stupňoch. Na prípravu knižnice a amplifikáciu bola použitá súprava SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 – Pico Input Mammalian (Clontech, 635006). Na prípravu knižnice sa použili 3 biologické replikáty (N=3). Knižnice boli pripravené podľa pokynov výrobcu bez ďalšieho fragmentačného kroku (FFPE, možnosť 2, pozri manuál), s depléciou ribozomálnej cDNA a konečnou PCR amplifikáciou (15 cyklov). Knižnice boli sekvenované na platforme Illumina HiSeq 2000 v MIT BioMicro Center.
Analýza RNA-seq – nespracované údaje fastq boli zarovnané s myšou mm9 referenciou
genóm pomocou motýlika 2.0. Mapované čítania z génových tiel (vrátane čítania exónov a intrónov) boli spracované pomocou Cufflinks 2.260 a DEseq261 s anotáciou referenčného génu UCSC mm9 na odhadnutie množstva transkriptov. Diferenciálna génová expresia a následné analýzy sa uskutočnili pomocou DEseq2 a vlastných R skriptov. Relatívna hojnosť transkriptov sa merala pomocou fragmentov na kilobázu exónu na milión mapovaných fragmentov (FPKM).
Na analýzu transkripčných programov sa expresia každého génu hodnotila inakPamäťfázy (Aktivované -skoro, Aktivované -neskoro, Reaktivované) ich log2-násobnou zmenou (log2FC) od bazálneho stavu. 1095 rozdielne exprimovaných génov (DEG) prešlo medznými kritériami, v ktorých sme pozorovali aspoň pri jednom porovnaní P-hodnoty< 0.01="" and="" log2(fc)="" >="" 1.="" then,="" genes="" were="" unbiasedly="" clustered="" by="" k-mean="">
Cistanche môže zlepšiť pamäť
Zachytenie konformácie chromozómov (Hi-C)
Jadrá z fixovaných buniek (pozri tkanivový prípravok) sa roztriedili do 1,5 ml skúmaviek Eppendorf obsahujúcich 500 ul čerstvého ľadovo studeného lyzačného pufra (10mM Tris pH=8, 10mM NaCl, 0,2% Igepal CA{{ 9}}, Pi a voda v kvalite PCR) a zmrazené na suchom ľade a skladované pri -80 °C, kým sa nepoužili. Hi-C knižnice boli pripravené zo 100,{13}} buniek/skupina (odobraných od dvoch zvierat) v dvoch biologických replikátoch, s použitím Dovetail™ Hi-C kit manual (v.1.03, Dovetail Genomics, Chicago, USA). Šesť Hi-C knižníc bolo sekvenovaných (párový koniec) na platforme Illumina Nextseq 500. Potrubie HOMER Hi-C sa použilo na filtrovanie experimentálnych artefaktov, ako je cirkularizácia, samoligácie a duplikáty PCR. Filtrované hodnoty boli zarovnané s referenčným myším genómom (mm9) a ďalej spracované s použitím potrubia HOMER HI-C.
Nástroje Hi-C spoločnosti HOMER sa použili na vykonanie analýzy hlavných komponentov (PCA) na údajoch Hi-C na identifikáciu subjadrových kompartmentov (A a B) s rozlíšením 50 Kb (pozri doplnkový softvér). Pre analýzu prepínania kompartmentov sme najprv odpočítali hodnoty PC1 medzi skupinami. Ďalej sme identifikovali najvyššie prechody BtoA ako oblasti so zmenou PC1 nad 90. percentilom a najvyššie prechody AtoB ako oblasti so zmenou PC1 pod 10. percentilom. Keďže subjadrové kompartmenty sú regulované ako jednotky niekoľkých stoviek kilobáz, konsolidovali sme po sebe idúce 50 Kb AtoB alebo BtoA segmenty, ktoré boli vo vzdialenosti 100 Kb od seba. Konsolidované domény s celkovou veľkosťou menšou ako 200 kb sme vyradili. Výmena priehradky sa zvažovala len vtedy, ak sa záporná hodnota transformovala na kladnú hodnotu (a naopak). Nakoniec boli porovnané pozitívne a negatívne hodnoty prvej zložky medzi všetkými tromi populáciami neurónov (Basal, Activated – early a Activated – late).
Promótor zachytáva Hi-C
Po fixácii a triedení (pozri prípravu tkaniva) sa bunky roztriedili do 1,5 ml skúmaviek Eppendorf obsahujúcich 500 ul čerstvého ľadovo studeného lyzačného pufra (10mM Tris pH=8, 10mM NaCl, 0,2% Igepal CA{ {9}}, Pi a voda v kvalite PCR), zmrazené na suchom ľade a skladované pri -80 °C, kým sa nepoužili. Hi-C knižnice boli pripravené z 10,000 buniek/na skupinu (N=3-4), ako už bolo opísané62, s určitou modifikáciou. Vzorky sa odstredili (4 stupne, 1 600 g počas 20 minút) a peleta sa resuspendovala v 400 ul 1,2x pufra Cutsmart (New England Biolabs,
USA). Prvé reštrikčné štiepenie sa uskutočnilo tak, ako je opísané v pôvodnom protokole s 1500 U HindIII (R3104L, New England Biolabs, USA), ako 6-základného rezača (namiesto BglII v pôvodnom protokole). Po označení biotínom a ligácii cez noc (podrobnosti nájdete v pôvodnom protokole) sa vzorky odstredili (4 stupne, 1 600 x g počas 15 minút) a peleta sa resuspendovala v 25 ul PBS. Suspenzia sa inkubovala pri 65 c s 3 ul proteinázy K počas 12 až 16 hodín. Purifikácia Hi-C DNA sa uskutočnila tak, ako je opísané v pôvodnom protokole so 100 ul streptavidínových guľôčok (Dynabeads M-280-streptavidín, Life Technologies, 11205D). Pre druhý reštrikčný enzým sme použili 4-základnú rezačku Hpych4V (10 U /na vzorku, R0620S, New England Biolabs, USA). Po reakcii A-tailing (podrobnosti pozri pôvodný protokol) sa vzorky amplifikovali pomocou PCR (17 cyklov) a purifikovali pomocou guľôčok AMPure XP. Hi-C knižnice sa eluovali v 20 ul 10 mM Tris-HCl (pH 8,5). Návrh systému zachytávania návnad pre Promoter Capture Hi-C – Zoznam 5000 promótorov myšacích génov bol získaný z predtým publikovaného protokolu v Schoenfelder. Et al.29. Zoznam obsahuje iba transkripty s biotypom oblastí kódujúcich proteín s miestami reštrikčných fragmentov HindIII. Boli navrhnuté dve 120 bp zachytávacie sondy, jedna na každý koniec fragmentu. Sondy boli syntetizované spoločnosťou Agilent Technologies podľa systému na obohatenie cieľa SureSelect (Agilent Technologies).
Príprava a sekvenovanie knižnice Hi-C zachytenia promótora – Na zachytenie produktov ligácie Hi-C obsahujúcich sekvencie promótora sme použili predtým publikovaný protokol29. V stručnosti, do Hi-C DNA knižníc boli pridané blokátory hybridizácie (Agilent Technologies). Hybridizačný pufor a RNA záchytnej návnady boli pripravené podľa pokynov výrobcu (SureSelect Target Enrichment, Agilent Technologies). Ďalej sa blokátory DNA/hybridizácie Hi-C knižnice zahrievali 5 minút pri 95 stupňoch a potom sa teplota znížila na 65 stupňov. DNA knižnice Hi-C sa zmiešala s hybridizačným pufrom (predhriatym na 5 minút na 65 stupňov) a následne s na mieru navrhnutým systémom zachytávania návnad (predhriatím na 3 minúty na 65 stupňov), ktorý pozostával z 10,000 biotinylovaných RNA zacielené na konce HindIII reštrikčných fragmentov 5000 myších génových promótorov (Agilent Technologies, pozri doplnkový materiál pre návrh zachytávacej návnady). Po 24 hodinách pri 65 stupňoch v zariadení PCR sa uskutočnilo stiahnutie biotínu (MyOne Streptavidin T1 Dynabeads; Life Technologies) a premytie podľa protokolu obohatenia SureSelect Target (Agilent Technologies). Po poslednom premytí boli guľôčky resuspendované v 30 ul NEBuffer 2 bez predchádzajúcej elúcie DNA a na DNA naviazanej na guľôčky prostredníctvom biotinylovanej RNA sa uskutočnila post-capture PCR (štyri amplifikačné cykly s použitím illuminových univerzálnych primerov). Knižnice Capture Hi-C boli sekvenované na konci párov (Nextseq 500, Illumina).
Analýza Hi-C zachytávania promótora – na spracovanie nespracovaných rýchlostí sekvenovania sa použilo potrubie HiCUP63. Toto potrubie sa použilo na mapovanie čítacích párov proti myšaciemu (mm9) genómu, na filtrovanie experimentálnych artefaktov (ako sú cirkulárne čítania a opätovné ligácie) a na odstránenie duplicitných čítaní. Pre údaje pc-HiC boli výsledné súbory BAM prevzorkované a spracované pomocou CHiCAGO verzie 1.2.064 podľa predvolených nastavení na volanie významných interakcií. Úplné podrobnosti o tomto potrubí sú k dispozícii od Babraham Bioinformatics
Cistanche môže zlepšiť pamäť
Stereotaxická injekcia adeno-asociovaného vírusu
Myši ArcCreERT2 boli anestetizované avertínom a infúziou vírusu AAV9-EF1a-DIO-hChR2-EYFP (sérotyp 5, získaný z vírusového jadra UNC). Najprv sa v lebke nad dorzálnym hipokampom (v porovnaní s Bregmou: predno-zadný −2.0 a mediolaterálne ± 1,5) vytvorila malá diera a spustila sa injekčná striekačka Hamilton s 33-ihlou do -1,8 DV a 500 ηl vírusu sa infundovalo s prietokovou rýchlosťou 50 ηl za minútu do oboch hipokampov. Po 10 minútach po injekcii sa ihla vytiahla a myši sa nechali zotaviť 4 dni.