Časť 5: Mapovanie epigenomickej a transkriptomickej súhry počas formovania a vybavovania pamäti v súbore Hippocampal Engram Ensemble
Mar 22, 2022
ali.ma@wecistanche.com
Rozšírené údaje Obr. 2: Stabilné DAR sú prevažne obohatené o zosilňovacie značky
(a) Pracovný postup pre disekciu prietokovej cytometrie rôznych populácií neurónov z hipokampu počasPamäťformovanie a získavanie. Reprezentatívne grafy FACS ukazujúce expresiu celej populácie (ľavý panel). Ďalšia selekcia sa uskutočnila na jednotlivých jadrách a populácii NeuN plus/DAPI plus (stredný panel). Nakoniec sa výber uskutočnil na uzavretej subpopulácii; GFP plus (upravené na ~2,5 percenta zo všetkých buniek), ARC plus/GFP plus (~0,15 percent zo všetkých buniek) a jadrá sa roztriedili do 1,5 ml skúmaviek Eppendorf potiahnutých 200 ul 1 percenta PBS.
Kliknite naExtrakt z cistanche zlepšuje pamäť
(b) Vennov diagram (vľavo) a tabuľka (vpravo) ilustrujú prekrytie medzi DAR identifikovanými v rôznych párových porovnaniach počasPamäťformovanie a odvolanie.
(c) Vykonala sa štatistická analýza založená na prevzorkovaní, aby sa určilo, či obohatenie stavov chromatínu v porovnaní s emisiami ChromHMM (pozorované) je štatisticky významné. Očakávané obohatenie sa vypočítalo vykonaním 10,000 randomizovaných súborov prekrytí (permutácií) medzi lokusmi „všetky dostupné miesta“ a „všetky miesta s modifikáciou histónov (tj všetky emisie)“ a prezentovalo sa ako histogram v postava. Veľkosť vzorky každého randomizovaného súboru bola určená veľkosťou DAR z každého štátu. Vypočítal sa priemer a štandardná odchýlka vzorky (doplnková tabuľka 3). Vypočítal sa počet pozorovaných prekrytí medzi DAR a každou emisiou a prezentoval sa ako čiary. z-skóre sa vypočítalo ako úhor; Z=(pozorované hodnoty (X) – priemer vzorky (μ))/(štandardná odchýlka vzorky (σ)). z-skóre Bazálne vs. skoré; SE 10.5, ST 6.9. Stabilný; SE 16,9, WE 12,7, všetky p < 0,0001,="" z-skóre="" skoré="" vs.="" neskoré;="" sp="" 91,7,="" wp="" 38,7.="" oneskorené="" vs.="" reaktivované;="" sp="" 26.8,="" wp="" 28.9,="" všetky=""><0.0001. p-values="" (two-sided)="" were="" calculated="" from="" the="" z-table.="" a="" full="" analysis="" is="" reported="" in="" supplement="" table="">
(d) Koláčový graf ukazuje percento rôznych stavov zosilňovača pre všetky stabilné oblasti. Prekrytie každej stabilnej oblasti sa uskutočnilo s predtým publikovanými údajmi H3K4me1 a H3K27ac ChIP-seq, získanými 1 hodinu po FS21. Stavy zosilňovačov boli klasifikované ako „primované“ – prekrývajúce sa s oblasťami označenými len H3K4me1, „aktívne“ – s H3K4me1/H3K27ac alebo „latentné“ – bez prekrývania.
(e) Motifs identified from nucleosome-free regions (NFR) on the ATAC-seq tracks from each state (Basal, Activated -early, Activated -late, and Reactivated). Peaks were divided into positions that were annotated to promoters (5kb from TSS) and enhancers (>5 kb od TSS). Veľkosť kruhu označuje percento obohatenia (1–50 percent). Farba označuje –log(P-hodnota).
Rozšírené údaje Obr. 3: Koordinované priming epigenetického stavu počasPamäťkódovanie a
(a) Vlastnosti interakcií zistených v Chicagu v každej fáze (bazálna, aktivovaná - skorá, aktivovaná - neskoro a reaktivovaná). Predvolené nastavenia a prah skóre 5 sa použili pri významnom interakčnom volaní, ktoré sa uskutočnilo spoločne na všetkých replikátoch.
(b) Koláčový graf predstavuje percento všetkých interakcií zistených v Chicagu, ktoré sú ohraničené buď H3K27ac/H3K4me1 (67,5 percenta zosilňovačov), H3K4me3/H3K9ac (46,2 percenta promótorov) alebo H3K27me3 (1,1 percenta represívnych značiek).
(c) Obraz prehliadača WashU epigenómu, ktorý zahŕňa oblasť ~ 500 Kb okolo génov Eif4e2. Oblúky ukazujú významné spoločné (červený obdĺžnik) a jedinečné (šípka) zosilňovače, ktoré interagujú s promótormi (modrý obdĺžnik).
(d) Príklady interakcií vyvolaných Chicagom. Grafy zobrazujúce všetky počty prečítaní z bait-other-end (enhancer), do 500–700 kb (proti prúdu a po prúde) od Grink3 a Promotéri Wwc2. Významné interakcie zistené Chicagom (skóre väčšie alebo rovné 5) sú zobrazené červenou farbou a podprahové interakcie (3 menšie alebo rovné skóre < 5)="" sú="" znázornené="" modrou="" farbou.="" šedé="" čiary="" zobrazujú="" očakávané="" počty="" a="" prerušované="" čiary="" hornú="" hranicu="" 95-percentného="" intervalu="" spoľahlivosti.="" (e)="" analýza="" prekrývania="" obohatenia="" medzi="" interagujúcimi="" zosilňovačmi="" a="" dar="" pomocou="" permutačnej="" procedúry="" na="" 10,000="" randomizovaných="" skupinách="" prístupných="" stránok.="" histogram="" predstavuje="" náhodnú="" distribúciu="" vzoriek="" prístupných="" miest="" pre="" každý="" stav="" (bazálny="" vs.="" aktivovaný="" –="" skorý,="" aktivovaný="" –="" skorý="" vs.="" aktivovaný="" –="" neskorý,="" aktivovaný="" –="" neskorý="" vs.="" reaktivovaný,="" stabilný).="" počet="" prekrývajúcich="" sa="" lokusov="" je="" prezentovaný="" vo="" farebných="" čiarach="" z="" bazálnych,="" aktivovaných="" -="" skorých,="" aktivovaných="" -="" neskorých="" a="" reaktivovaných="" neurónov.="" dar="" bas="" vs.="" aktivované="" –="" skoré="" (z-skóre;="" 7,1,="" 7,7,="" 8,5,="" 10,9).="" dar="" aktivovaných="" -skoro="" vs.="" aktivovaných="" -neskoro="" (z-skóre;="" -0,1,="" -0,8,="" -2,4,="" -3,2).="" dar="" aktivovaných="" -neskoro="" vs.="" reaktivovaných="" (0,4,="" 1,8,="" 0,4,="" -0,2).="" dar="" stabilné="" (z-skóre;="" 1,7,="" 2,0,="" 6,5,="">
Rozšírené údaje Obr. 4: Zmeny chromatínu, ku ktorým dochádza počas počiatočnej fázy umožňujú
(a) Analýza prekrývania medzi názvami génov z párovej diferenciálnej analýzy a predtým publikovaných údajov i) aktivovaných granulových buniek DG 1 hodinu po novej expozícii32 ii) 24 hodín po FS20 a iii) po predĺženej stimulácii (6 hodín) kortikálnej kultúry u myší neuróny s KCl33. Analýza sa uskutočnila pomocou balíka GeneOverlap R.
(b) Exonické (červené) a intrónové (modré) hodnoty boli kvantifikované oddelene vo všetkých podmienkach a porovnané s transkripčnou aktivitou, ako sa meralo pomocou DEseq2. Čítania boli normalizované (RPKM) a zmeny log2FC sú uvedené pre každý stav. husľový graf označuje priemer,
medzikvartilový rozsah a minimálna a maximálna, jednosmerná ANOVA (parametrická, nepárová), bazálna vs. skorá; F (5, 248)=389.9. Skoré vs. Neskoré; F (5, 2374)=2183. Oneskorené vs. Reaktivované. F (5, 1357) {{10}}.5, všetky Ps < 0.0001.="" bonferroniho="" viacnásobné="" prirovnania.="" ns="nevýznamné," ***p=""><>
(c) Pomery exón/intrón sa merali v každom klastri za všetkých podmienok (škála Log2FC). husľový graf označuje priemer, medzikvartilový rozsah a minimálnu a maximálnu, jednosmernú ANOVA (parametrická, nepárová), F (5, 1143)=260.2, P<0.0001. bonferroni's="" multiple="" comparisons="" test.="" n.s="non-significant," ***p="" <="">
(d) Analýza prekrývania medzi DAR a DEG počas rôznychPamäťfázy. DAR na medzigénových a intrónových oblastiach boli mapované na ich príslušné gény pomocou interakčných máp pc-HiC. Analýza prekrývania sa uskutočnila pomocou balíka GeneOverlap R. P-hodnota (čísla) a pomer šancí (farba) z Fisherovho presného testu sú uvedené v tepelnej mape. ns – nevýznamné.
(e) Pearsonova korelácia medzi hodnotami log2FC DAR a log2FC DEG, ktoré boli anotované do tejto oblasti (intergénne oblasti boli mapované prostredníctvom súboru údajov pc-HiC). Zmeny dostupnosti chromatínu sa porovnávali s analyzovanými exonickými čítaniami (červená čiara), intrónovými čítaniami (modré čiary) a celkovými transkripčnými zmenami (intronické aj exonické čítania), ako bolo merané pomocou Desq2 (sivá čiara). Všetky hodnoty r a p sú uvedené v doplnkovej tabuľke 9.
Rozšírené údaje Obr. 5: Transkripčné zmeny v aktivovaných-neskorých neurónoch korelovali vyššie
( a ) Exonické (červené) a intronické (modré) čítania boli kvantifikované oddelene vo všetkých podmienkach pre každý z klastrov identifikovaných na obrázku 5B. Čítania boli normalizované (RPKM) a zmeny log2FC sú prezentované pre každý klaster.
(b) Pomery exón/intrón sa merali v každom klastri za všetkých podmienok. Husľový graf označuje priemer, medzikvartilový rozsah a minimum a maximum, n=3 biologicky nezávislých vzoriek jednosmerná ANOVA (parametrická, nepárová), Dw – neskorý klaster; F (3, 968)
652) = 93.97, P<0.0001. reactivation="" -cluster;="" f="" (3,="" 1600)="485.2,"><0.0001. bonferroni's="" multiple="" comparisons="" test="" to="" deseq2="" reads.="" ***p="" <="">
Rozšírené Údaje Obr. 6: Odlišný dočasne transkripčné programy sú bytie synchronizované do
závislým spôsobom v prítomnosti tamoxifénu. V pravom paneli reprezentatívne IHC snímky GR. Zelená – AAV-eYFP, Červená – endogénny Oblúk. Mierka predstavuje 50 μm.
(b) Posúdenie morfológie tŕňov počas rôznychPamäťfázy. Pravý panel zobrazuje jeden eYFP plus dendritický driek s rôznymi typmi tŕňov (stubby, tenký, hubovitý, zväčšený hríb). Mierka predstavuje 5 μm. boxplot ukazuje priemer, medzikvartilový rozsah a minimum a maximum, Aktivované - skoré: n=4 myší /5 sekcií na zviera, Aktivované - neskoro: n=4 myší /4 sekcie na zviera, Reaktivované: n=4 myší /2 sekcie na zviera. jednosmerná ANOVA (parametrická, nepárová), Stubby; F (2, 36)=2.313, P=0.1135. Tenký; F (2, 36)=35.12, P<0.0001. mushroom;="" f="" (2,="" 36)="38.42," p="" <="" 0.0001.="" bonferroni's="" multiple="" comparisons="" test,="" ***p="" <="">
(c) Reprezentatívne snímky IHC a kvantifikácia hladín proteínov dvoch členov rodiny EIF; (vľavo) Eif2a a (vpravo) Eif3e. Mierka predstavuje 10 μm. Údaje pre dendritický driek sú prezentované ako pomer medzi počtom a dĺžkou (μM). n=4 myší /5 sekcií na zviera, box graf označuje priemer, medzikvartilový rozsah a minimálnu a maximálnu, jednosmernú ANOVA (parametrickú, nepárovú) s Bonferroniho testom viacnásobného porovnávania, ns - nevýznamné, Eif2a hriadeľ; F (2, 20)=4.484, P=0.0246. Soma; F (2, 21)=19,58, P < 0,0001.="" (aktivovaný="" -skorý="" vs.="" aktivovaný="" -neskoro="" *p="0.0142," aktivovaný="" -skorý="" vs.="" reaktivovaný="" *p="">< 0,0001,="" aktivovaný="" -neskoro="" vs.="" reaktivovaný="" *p="0.0303)." eif3e="" hriadeľ;="" f="" (2,="" 14)="1,983," p="0,1745." soma;="" f="" (2,="" 23)="8.309," p="0.0019," (aktivované="" –="" skoré="" vs.="" reaktivované="" *p="0.0057," aktivované="" –="" neskoro="" vs.="" reaktivované="" *p="" {{="">
(d) Koláčový graf predstavuje percento zväčšených hríbových tŕňov (Dh Väčšie alebo rovné 3Dn) a hríbových tŕňov z aktivovaných - neskorých a reaktivovaných neurónov.
(e) Reprezentatívne obrázky (ľavý panel) a kvantifikácia (pravý panel) hladín mRNA Gria1 počas rôznych fázPamäť. Údaje sú prezentované ako pomer medzi niekoľkými bodkami a dĺžkou dendritického drieku. Mierka predstavuje 10 μm. N=4 myší /5 sekcií na zviera, box graf označuje priemer, medzikvartilový rozsah a minimum a maximum, hriadeľ; jednosmerná ANOVA (parametrická, nepárová) F (2, 15)=10.41, P=0.0015. Bonferroniho test viacerých porovnaní, **P=0.0011. spodný panel - Soma; jednosmerná ANOVA F (2, 12)=0.13, P=0.88.
Rozšírené údaje Obr. 7: Interakcie s odlišnými kombinatorickými zosilňovačmi vedú k smerovému
(a) Vennove diagramy ukazujú percento prekrývania medzi dostupnosťou chromatínu (DAR) naprieč všetkýmiPamäťfázy (BAS vs. aktivované -skoré, svetlozelený kruh mriežky; aktivované -skoré vs. aktivované -neskoré, tmavozelený kruh mriežky; aktivované -neskoré vs. reaktivované, oranžový kruh mriežky) a celkové transkripčné zmeny zo všetkých identifikovaných zhlukov (Dw – neskoré, vyššie – neskoro, stabilné, reaktivácia, modrý kruh mriežky). Intergénne a intróny DAR boli mapované na ich príslušné gény pomocou interakčných máp pc-HiC. Percento prekrytia bolo vypočítané zo všetkých identifikovaných stupňov v zhlukoch (n=1095).
(b) Analýza prekrývania medzi DAR (po pároch) a DEG z každého klastra. Intergénne a intróny DAR boli mapované na ich príslušné gény pomocou interakčných máp pc-HiC.
Analýza prekrývania sa uskutočnila pomocou balíka GeneOverlap R. P-hodnoty a Jaccard hodnoty (farba) z Fisherovho presného testu sú prezentované na teplotnej mape (vľavo). Percento prekrytia sa vypočítalo zo všetkých identifikovaných stupňov v zhlukoch (vpravo).
( c ) Reprezentatívny obraz chromatínu a transkripčných zmien lokusu Gabrb3 z klastra Dw-late. Zatiaľ čo interakcie skorého stavu boli medzi promótorom a zosilňovačmi s transkripčnými aktivátormi (Ap1), interakcie neskorého stavu boli s transkripčnými represormi (Slug). Horné stopy prehliadača genómu IGV (fialová - bazálna, svetlozelená - aktivovaná - skorá, tmavozelená - aktivovaná - neskorá a oranžová - reaktivovaná) predstavujú transkripčné zmeny (ncRNA-seq), stredné stopy ukazujú dynamiku dostupnosti chromatínu (ATAC-seq) na promótor (červený obdĺžnik) a zosilňovače (sivý obdĺžnik). Významné interakcie medzi promótorom a zosilňovačom sú znázornené ako oblúky (stopy prehliadača WashU). Spodná stopa predstavuje motívy, ktoré boli identifikované pomocou nástrojov HOMER (Slug, Ap1 a Rest).
(d) Agregačné grafy pre jednotlivé motívy. Hodnoty obohatenia (motívy na bp/ na vrchol) šiestich vybraných motívov (dva represory, dva aktivátory a dva bivalentné) sa hodnotili okolo stredu píkov (-/ plus 4000 bp) z každého klastra.
Rozšírené údaje Obr. 8: Navrhovaný model dostupnosti chromatínu, interakcie promótor-enhancer a dynamiky transkripcie neurónov hipokampálneho pamäťového engramu
oblasti, ktoré nesú motívy transkripčného aktivátora. Toto preprogramovanie promótor-enhancer má za následok zvýšenú génovú expresiu, ktorá pravdepodobne umožňuje stabilizáciuPamäť. Recall - reaktivované engramové neuróny využívali podskupinu primárnych interakcií promótor-enhancer, ktorá je spojená s transkripčnými zmenami zapojenými do transportu mRNA do synaptických kompartmentov a translácie proteínov. Transkripčný faktor – TF, E(1–3) – rôzne zosilňovače, ktoré interagujú s rovnakým promótorom, Červená – transkripčné represory, Modrá – transkripčné aktivátory.
Doplnkový materiál
Doplnkový materiál nájdete vo webovej verzii na PubMed Central.
Poďakovanie
Ďakujeme E. Niederst, J. Penney, S. Barker, RT Stott, M. Victor, A. Watson, N. Dedic, E. Lockshin a členom L.HT Lab za užitočnú diskusiu a návrhy. Ďakujeme manažérom laboratória Y. Zhou, E. McNamara za údržbu kolónií myší. Ďakujeme P. Autissierovi (Whitehead Institute) za pomoc s FACS. Financovanie: Tieto práce boli podporené grantmi NIH RF1AG062377, AF1AG054012, RO1NS102730, RF1AG064321, The JPB Foundation, The Alana Down Syndrome Research Foundation, The LuMind Down Syndrome Research Foundation, Cure Alzheimer's Fund CIRCUITS a E Robertne and Consortium, CIRCUITS Belfer Family Foundation LH.T. Táto práca bola tiež čiastočne podporená grantmi NIH R01AG058002, U01NS110453, R01AG062335, UG3NS115064 pre MK a LH.T a R01AG067151, R01MH109978, U09, R044Azdruženie pre Alzheimer's podporované U09, R0KV05 grantom R0KV05{0KV04AR0KV5{0KV04HAR0 . HSM podporuje Burroughs Wellcome Fund a postdoktorandské štipendium UNCF-Merck. C. A podporuje Nadácia JPB. RMR je podporované grantom NIH T32 5T32HD09806. Súprava na prípravu Hi-C libraries bola obdržaná ako štedrý dar od DovetailTM (v.1.03, Dovetail Genomics, Chicago, USA). Ďakujeme tímu Dovetail za užitočnú diskusiu a návrhy.
