Časť Ⅰ Vývoj laterálneho prietokového imunotestu nanočastíc európia na detekciu NGAL v moči a diagnostiku akútneho poškodenia obličiek
May 09, 2023
Abstraktné
1. Pozadie
AKI súvisí so závažnými nepriaznivými následkami a úmrtnosťou u pacientov s Coronavirus Disease 2019 (COVID-19), takže včasná diagnostika a intervencia sú nevyhnutné. Neutrofilný lipokalín spojený s gelatinázou (NGAL) je jedným z najsľubnejších biomarkerov na detekciu akútneho poškodenia obličiek (AKI), ale súčasné metódy detekcie sú nedostatočné, takže na detekciu NGAL na včasnú diagnostiku sú potrebné rýchlejšie, pohodlnejšie a presnejšie metódy. z AKI. V tomto dokumente sme zaviedli rýchly, spoľahlivý a presný laterálny prietokový imunotest (LFIA) založený na nanočasticiach európia (EU-NPS) na detekciu NGAL vo vzorkách ľudského moču.
2. Metódy
Použil sa sendvičový imunofluorescenčný test s dvojitou protilátkou s použitím nanočastíc dopovaných európiom a konjugát NGAL monoklonálnych protilátok (MAbs) ako značky sa generoval optimalizáciou parametrov elektrickej fúzie. Na vyhodnotenie účinnosti klinickej aplikácie tejto metódy sa použilo 83 vzoriek moču.
3. Výsledky
Kvantitatívny rozsah detekcie NGAL v AKI bol {{0}} ng/ml a senzibilizácia detekcie bola 0,36 ng/ml. Variačný koeficient (CV) v rámci testu a medzi testom bol 2.{6}},98 percent a 4.11-7,83 percent, v tomto poradí. Medzitým bol korelačný koeficient medzi laterálnymi fluorescenčnými imunotestmi založenými na nanočasticiach európia (EU-NPS-LFIA) a analyzátorom ARCHITECT významný (R2=0,9829, n=83, p < 0,01).
4. Závery
Bol teda zavedený rýchlejší a jednoduchší kvantitatívny test NGAL pre AKI, ktorý je veľmi dôležitý a zmysluplný pre diagnostiku včasného AKI, čo naznačuje, že test môže poskytnúť včasné varovanie pred výsledkom ochorenia.
Kľúčové slová
neutrofilný lipokalín spojený s gelatinázou (NGAL), monoklonálna protilátka, laterálny prietokový imunotest, akútne poškodenie obličiek (AKI),Účinky Cistanche.
Ak chcete vedieť, kliknite semaké sú výhody Cistanche
Úvod
Koronavírusová choroba 2019 (COVID-19) sa celosvetovo veľmi rozšírila s vážnymi katastrofami [1]. Akútne poškodenie obličiek (AKI) má vyššiu mieru morbidity a úmrtnosti na bežné komplikácie kritických ochorení a predstavuje asi 5-7 percent hospitalizovaných pacientov vo svete[2].- Niekoľko štúdií hodnotilo vývoj AKI ako viac silne súvisí s horšími výsledkami a mierou úmrtnosti na COVID-19, čo popisuje výskyt AKI, ktorý sa u pacientov s COVID{11}} pohybuje v širokom rozsahu od 0,5 do 36,6 %[3]. Včasná detekcia a presná liečba AKI môže implementovať lepšie preventívne stratégie a zabrániť zhoršeniu funkcie obličiek a zlyhaniu obličiek, čím sa účinne zabráni progresii hospitalizovaných pacientov s COVID{13}}[4]. Spomedzi nich bol lipokalín spojený s neutrofilnou gelatinázou (NGAL) uznaný ako jeden zo sľubných kandidátov biomarkerov na detekciu AKI. NGAL je 25 kDa glykoproteín spojený s želatinázou z neutrofilov a zvyčajne existuje na nižšej úrovni v ľudských tkanivách, ako je žalúdok, hrubé črevo a obličky, ale jeho expresia je dramaticky zvýšená v sére a moči, keď bola oblička s ischemickým alebo nefrotoxickým poškodením [5].
Imunoanalýzy s laterálnym prietokom (LFIA) sa považujú za požadované skríningové testy z dôvodu ich jednoduchosti, analýzy in situ a jednoduchosti práce [6]. LFIA s fluorescenčnými mikročasticami sa už používa na detekciu rôznych mikrobiálnych patogénov a niekoľkých zápalových markerov [7, 8]. Na zlepšenie citlivosti LFIA sa vo všeobecnosti použilo niekoľko nových nanočastíc vrátane uhlíkových nanočastíc, kvantových bodov, fluorescenčných farbív, magnetických nanoznačiek a nanočastíc európia (EU-NPS)[9]. EU-NPS ako nosiče môžu zlepšiť 100-násobok kontrastu citlivosti s nanočasticami koloidného zlata označenými v LFIA[10]. EU-NPS má dlhú životnosť fluorescencie a je k dispozícii aj s priemernou veľkosťou častíc v rozsahu 75–100 nm, pričom veľký Stokesov posun, ktorý je zvyčajne nad 200 nm, vedie k tomu, že zabraňuje interferencii rozptýleného svetla spôsobenej meraním excitačného svetla. EU-NPS majú široké excitačné pásmo, takže je výhodné zvýšiť excitačnú energiu, ostrý emisný vrchol, nízke pozadie a vysoké rozlíšenie, ktoré sa v poslednej dobe používa v sendvičových imunotestoch lekárskej diagnostiky[11].
Tu sme vytvorili novú metódu s EU-NPS ako značkami LFIA na rýchle, citlivé a skoré meranie NGAL v moči na základe dvoch monoklonálnych protilátok (MAbs) 1G1 a 2F4, ktoré objavilo naše laboratórium. Spôsob je sendvičový imunofluorescenčný test s dvojitou protilátkou s použitím konjugátu EU-NPS a MAbs ako značiek. mAb 1G1 bola konjugovaná s EU-NPS a mAb 2F4 bola použitá na zachytenie EU-NPS-1G1-antigénového komplexu v T-línii. Naše výsledky ukázali, že EU-NPS-LFIA by sa mohla použiť na včasnú detekciu NGAL v moči a umožnila by zlepšenie liečby pacientov s AKI.
Cistanche tubulosa
Metódy
1. Expresia a purifikácia NGAL
Sekvenciu ľudského NGAL génu z Genbank (NP{0}}.2) syntetizoval Pekinský inštitút genomiky (BGI) a na oba konce boli pridané reštrikčné enzýmy HindIII a Xhol. Plazmidy boli štiepené HindIII a Xhol a potom klonované do vektora pSecTag2A. Skonštruované plazmidy boli sekvenované na potvrdenie bez mutácie a potom transformované do buniek vaječníkov čínskeho škrečka (CHO) pomocou LipofectamineTM2000. Po 8 dňoch sa bunkový supernatant zhromaždil po prefiltrovaní 0,45 μm filtrom. Exprimovaný NGAL-6xHis proteín sa purifikoval pomocou kolóny s kyselinou nikelnitriltrioctovou (Ni-NTA) a rôzne frakcie sa zhromaždili a vyhodnotili elektroforézou na dodecylsulfátovom polyakrylamidovom géli (SDS-PAGE). Súprava na kvantifikáciu bielkovín kyseliny bicinchonovej (BCA) merala koncentráciu bielkovín.
Purifikovaný rekombinantný proteín sa podrobil 12-percentnej SDS-PAGE, potom sa adsorboval na polyvinylidénfluoridovú (PVDF) membránu. Potom, čo bola membrána blokovaná v tris pufri s 1 percentným roztokom Tween-20 (TBST) obsahujúcim 5 percent odstredeného mlieka pri izbovej teplote (RT) počas 2 hodín, inkubovaná s HRP-konjugovaným anti-6×His tagom protilátka (1:5000) v tme počas 1 hodiny pri teplote miestnosti, vizualizovaná benzidínom po premytí TBST a vizualizovaná detekčným systémom Bio-Rad Western blotting (DNR Bio-Imaging Systems Ltd., Izrael).
2. Generovanie a čistenie MAbs
Pri prvej imunizácii boli samice myší BALB/c (vek 6 týždňov, celkovo 10) imunizované 50 ug NGAL-6×His rekombinantného proteínu emulgovaného v rovnakej dávke kompletného Freundovho adjuvans a prídavná imunizácia sa uskutočnili s proteínom emulgovaným v neúplnom Freundovom adjuvans. Dve hypodermické injekcie na chrbát myší a následné intraperitoneálne injekcie s odstupom 21 dní. Vzorky séra sa odobrali jeden týždeň po tretej injekcii a titer antiséra sa určil pomocou nepriameho imunoanalýzy s enzýmom viazaným na imunosorbent (ELISA)[12]. Tri dni pred fúziou myši vykonali posilňovaciu imunizáciu s 50 ug NGAL-6xHis zriedeného 0,9 percentami NaCl.
Izolované imunitné myšacie slezinové bunky a SP2/0 myelómové bunky zmiešané v pomere 3:1, aby sa spojili vo fúznej komore LF498-3 platinovej elektródy (BEX Co., Ltd, Japonsko), ako je opísané v literatúre[13]. Stručne, zmiešaná bunka sa dvakrát premyla 1 0 ml elektrofúzneho pufra (0,3 M manitol, 0,1 mM CaCl2, 0,1 mM MgCl2, pH 7.2) a resuspendované v koncentrácii 2 x 107 buniek/ml. Fúzia bola dokončená s použitím striedavého napätia 50 V pri 0,8 MHz počas 20 s, jednosmerného impulzného napätia 450 V s 2 opakovaniami počas 0,5 s a postfúzia bola 50 V pri 0,8 MHz po dobu 7 s. Nakoniec sa elektricky spracovaná bunková suspenzia premiestnila z fúznej komory do 4,5 ml predhriateho RPMI 1640 (20 percent fetálne hovädzie sérum) na 30 minút pri 37 stupňoch, potom sa kultivovala v 96-jamkových doštičkách a inkubovala s 5 percentami CO2 pri 37 stupňoch. Po 24 hodinách sa do každej jamky pridal hypoxantín-aminopterín-tymidín (HAT). Supernatanty bunkových kultúr sa skrínovali pomocou ELISA po 9 dňoch fúzie a vypočítal sa počet hybridómových klonov. Myši BALB/c, ktorým bol vopred podaný parafínový olej, sa naočkovali 1 x 106 buniek hybridómu NGAL, ascites sa čistil pomocou kolóny s proteínom A.
3. Identifikácia MAbs
Imunoglobulínové podtriedy protilátok boli analyzované s použitím súpravy na identifikáciu podtriedy protilátok. Nepriama ELISA testovala špecifické MAbs s použitím purifikovaného rekombinantného NGAL{{0}}×His proteínu a PCT- 6×His proteínu. Interakcia medzi antigénom a protilátkami bola stanovená systémom BIAcore T200 (GE Healthcare, Štokholm, Švédsko) v pufri HBS-EP (0,005 percent povrchovo aktívnej látky P20, 10 mM Hepes, pH 7,4, 3 mM EDTA, 150 mM NaCI). Antigén NGAL bol adsorbovaný na biosenzorových čipoch CM5 a dosahoval 400–480 jednotiek odozvy (RU) pomocou súpravy na spojenie amínov. Protilátky (2F4 a 1G1) boli nariedené v pufri HBS-EP, pomaly prechádzali cez čip s 50 ul/min počas 5 minút a následne sa cez čip injikoval pufor HBS-EP, aby sa monitorovala fáza disociácie počas 4 minút. . Senzorové čipy sa po disociačnej fáze regenerovali roztokom glycínu (pH 3,0). Pre každý analyt, ktorý prešiel cez čip, mohli špecifické reakcie z kanála toku antigénu odpočítať nešpecifické reakcie z kanála toku kontroly. Preložené saturačné väzbové krivky boli vynesené na základe koncentrácií analytu pre rovnovážne väzbové odozvy na výpočet KD.
Purifikované anti-NGAL MAbs sa analyzovali na 12 percent SDS-PAGE za neredukujúcich podmienok a redukujúcich podmienok. Stručne, vzorka bola zmiešaná s 5 x neredukujúcim pufrom alebo 5 x proteínovým nanášacím pufrom a nanesená na 12 percent SDS-PAGE. Špecifickosť anti-NGAL MAb bola stanovená pomocou Western Blot. Proteíny NGAL sa upravili na 12 percent SDS-PAGE, potom sa adsorbovali na PVDF membránu, ktorá sa aktivovala namáčaním v metanole počas 15 sekúnd, a potom sa podrobili podmienkam elektroforézy pri 100 V počas 2 hodín. Po blokovaní v Tris-HCl pufri s 1 percentným roztokom Tween-20 (TBST) obsahujúcim 5 percent odstredeného mlieka pri teplote miestnosti počas 2 hodín sa membrána inkubovala s myšou anti-NGAL MAbs ako primárnymi protilátkami pri 4 stupňoch. Nasledujúci deň bola membrána premytá TBST a inkubovaná s anti-myším HRP IgG konjugovaným v tme počas 1,5 hodiny pri teplote miestnosti. Nakoniec bola membrána vizualizovaná detekčným systémom Western blot zosilnenej chemiluminiscencie (ECL).
4. Kompetitívne enzýmovo viazané imunosorbentové testy (ELISA)
Dve MAb boli testované na schopnosť rozpoznať jedinečné epitopy na NGAL pomocou cELISA. MAb bola konjugovaná s HRP pomocou súpravy na značenie protilátok HRP (Shanghai YSRIBIO industrial co., LTD), ktorej pracovná koncentrácia bola testovaná priamou ELISA. {{0}}jamka Mikrotitračné doštičky boli potiahnuté 2 µg/ml NGAL antigénu cez noc pri 4 stupňoch, potom bola neznačená MAb (0,2 µg/jamka, 2 µg/jamka) kompetitívne naviazaná s optimálnym pomerom riedenia HRP značená MAb a inkubovaná počas 1 hodiny pri 37 stupňoch. Enzymatická reakcia sa objavila s peroxidom vodíka substrátom 3,3',5,5'-tetrametylbenzidínom (TMB) a zastavila sa 2 M kyselinou sírovou do všetkých jamiek. Absorbancia (OD450 nm) bola stanovená čítačkou mikrodoštičiek Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Blokujúce účinky MAb sa vypočítali pomocou nasledujúcej rovnice: 100×[1-OD450 nm(HRP-MAb plus MAb)/OD450 nm HRP-MAb]. Dve MAb rozpoznali rôzne epitopy, ak boli blokujúce účinky pozorované u viac ako 40 percent.
Extrakt z cistanche
5. Konjugácia EU-NPS
Anti-NGAL monoklonálne protilátky 1G1 a 2F4 boli kovalentne konjugované s EU-NPS štandardným postupom Bangs Laboratories. Stručne povedané, 100 µL EUNPS sa pridalo k 900 µL 0.05 M MES (pH 7.{{{101} 32}}) a dispergované ultrazvukom, vibrované 15 minút pri teplote miestnosti v prítomnosti {{40}},08 M N-hydroxysulfosukcínimidu (NHS) a 0,05 M 1- ({{19 }}dimetylaminopropyl)-3-etylkarbodiimid hydrochlorid (EDC). Aktivovaný EUNPS sa premyl kopulačným pufrom (0,05 mM H3B03, 0,04 mM Na2B407, pH 7,5) a reagoval s 0,3 mg protilátky počas 2,5 hodiny pri teplote miestnosti. Zlúčenina konjugovaná s európiom sa inkubovala v 1000 ul blokovacieho pufra (10 percent BSA, 20 percent tween-20, 0,05 M Tris-HCl) počas 1 hodiny, pridala sa k 1000 ul zásobných roztokov (10 percent BSA, 20 percent trehalózy, 20 percent percento doplnenia-20, 0,05 M Tris-HCl) na uskladnenie pri 4 stupňoch .
6. Vývoj LFIA
Prúžky LFIA pozostávali z nitrocelulózovej membrány, konjugátovej podložky, vzorkovej podložky a absorbujúcej podložky. Membrány zo sklenených vlákien boli namočené v blokovacom pufri (20 percentá trehalózy, 10 percent BSA, 20 percent tween{3}}, 0,05 M Tris, 3,2 mM EDTA.Na2, pH 8,6) počas 1,5 hodiny. Koncentrácia 1 mg/ml MAbs (2F4 alebo 1G1) bola nanesená na testovaciu čiaru (TL) nitrocelulózovej membrány a kozí anti-myší IgG 1 mg/ml bol potiahnutý na rovnakú NC membránu vo vzdialenosti 4 mm od z línie kontroly kvality (CL), bol objem spreja dávkovacieho zariadenia nastavený na 1 ul/cm. Membrána a rohož zo sklenených vlákien sa pred testovaním sušili 48 hodín pri 45 stupňoch. Rôzne častice konjugátu EU-NPS-1G1 a EU-NPS-2F4 boli potiahnuté na podložku konjugátu a fluorescenčný signál sa meral imunofluorescenčným analyzátorom (Guangzhou Labsim Biotech Co., Ltd).
7. Odber vzoriek moču a pacientov
Celkovo 83 vzoriek ľudského moču od pacientov s AKI bolo odobraných z pridruženej nemocnice Jilin Medical University. Etické pokyny boli v experimente prísne dodržané a poskytla ich pridružená nemocnica lekárskej univerzity Jilin (č.2018-LW029). Všetky subjekty dostali ústny a písomný informovaný súhlas v čínštine na štúdium vzoriek moču. Všetky experimenty sa uskutočňovali podľa Helsinskej deklarácie etických princípov. Priemerný vek pacientov 62 rokov sa pohyboval od 20 do 80 rokov, ktorí neboli infikovaní COVID-19, a štádium AKI 1–3 boli klasifikované podľa kritérií AKI zlepšujúcich globálne výsledky ochorenia obličiek[14]. Vzorky moču sa odoberali na analýzu NGAL až 12 hodín pred diagnostikovaním AKI a v častých intervaloch po operácii v rôznych časových bodoch (12, 24, 48 hodín). Aby sa minimalizovali potenciálne mätúce faktory, vzorky moču sa rýchlo analyzovali v laboratóriu klinickej chémie vrátane biochémie moču (celkové koncentrácie bielkovín < 1 g/dl, močovina < 12 g/dl, glukóza < 1 g/dl, kreatinín v moči < 1 g/dl , albumín < 2,5 g/dl, pH 4.{21}},0) a uskutočnené v duplikátoch. Do 30 minút od odberu vzoriek boli centrifugované pri 3000 ot./min. pri 4 stupňoch počas 15 minút. Minimálne 100 ul supernatantu sa rozdelilo do sterilných nádob a skladovalo sa pri -80 stupni na ďalšie analýzy, aby sa predišlo opakovaným cyklom zmrazovania a rozmrazovania.
Meranie hladín NGAL sa uskutočňovalo pomocou súpravy ARCHITECT moči NGAL reagent Kit (Lisnamuck, Longford, Co. Longford, Írsko) s použitím nekonkurenčného sendvičového formátu s detekciou chemiluminiscenčného signálu. Močový NGAL bol rozpoznaný antifungálnou protilátkou, ktorá bola kovalentne pripojená k paramagnetickým časticiam v mikročasticovom činidle, a konjugátom druhej anti-NGAL protilátky spojenej s akridíniom. Podľa pokynov výrobcu sa uskutočnil kalibračný test v rozsahu 0- 1500 ng/ml a merala sa koncentrácia NGAL.
8. Testovanie a analýza klinických vzoriek
Sériové koncentrácie štandardného antigénu NGAL (10, 50, 100, 200, 400, 800, 1500, 2000 a 3000 ng/ml) sa pripravili s použitím FBS na posilnenie špecifických reakcií biokonjugátu, každá koncentrácia sa opakovala trikrát. Po pridaní klinických vzoriek na vzorkové podložky boli výsledky fluorescenčnej intenzity na T línii (HT) a C línii (HC) zaznamenané čítačkou. Kvantitatívna detekcia bola doplnená pomerom HT/HC, aby sa účinne eliminovali rozdiely v prúžkoch (T a C) a efekty štandardnej matrice matematických vzoriek[15]. Štandardná krivka bola vynesená proti každej koncentrácii NGAL a pomeru HT/HC.
9. Štatistická analýza
Regresná analýza Passing-Bablok a graf BlandAltman boli vykonané analýzou rozptylu (ANOVA) softvéru MedCalc a SPSS 17.0. Všetky údaje boli uvedené ako priemerné hodnoty so štandardnou odchýlkou (priemer ± SD).
Cistanche pilulky
Referencie
1. Zheng X, Zhao Y, Yang L: Akútne poškodenie obličiek pri COVID-19: Čínska skúsenosť. Semináre z nefrológie 2020, 40(5):430–442.
2. Mandelbaum T, Scott D, Lee J, Mark R, Malhotra A, Waikar S, Howell M, Talmor D: Výsledok kriticky chorých pacientov s akútnym poškodením obličiek pomocou kritérií siete pre akútne poškodenie obličiek. Kritická medicína 2011, 39 (12): 2659–2664.
3. Al-Hwiesh A, Mohammed A, Elnokeety M, Al-Hwiesh A, Al-Audah N, Esam S, Abdul-Rahman I: Úspešná liečba troch pacientov s akútnym poškodením obličiek sekundárnym po COVID-19 peritoneálnou dialýzou : Kazuistika a prehľad literatúry. Peritoneálna dialýza International 2020, 40(5):496–498.
4. Shabaka A, Rovirosa-Bigot S, Guerrero Márquez C, Alonso Riaño M, Fernández-Juárez G: Akútne poškodenie obličiek a nefrotický syndróm sekundárne k fokálnej segmentálnej glomeruloskleróze spojenej s COVID-19-. Nefrológia 2021.
5. Gabbard W, Milbrandt E, Kellum J: NGAL: vznikajúci nástroj na predpovedanie závažnosti AKI je ľahko detekovateľný klinickým testom. Kritická starostlivosť 2010, 14 (4): 318.
6. Zuk R, Ginsberg V, Houts T, Rabbie J, Merrick H, Ullman E, Fischer M, Sizto C, Stiso S, Litman D: Enzýmová imunochromatografia – kvantitatívna imunoanalýza nevyžadujúca žiadne prístrojové vybavenie. Klinická chémia 1985, 31 (7): 1144–1150.
7. Juntunen E, Myyryläinen T, Salminen T, Soukka T, Pettersson K: Výkon fluorescenčných nanočastíc európia (III) a reportérov koloidného zlata v teste bioafinity s laterálnym tokom. Analytická biochémia 2012, 428 (1): 31–38.
8. Swanson C, D'Andrea A: Test laterálneho toku s farbivom v blízkej infračervenej oblasti na multiplexnú detekciu. Klinická chémia 2013, 59(4):641–648.
9. Chen Y, Fu Q, Xie J, Wang H, Tang Y: Vývoj vysoko citlivého testu laterálneho prietoku na báze kvantovej bodky na zhášanie fluorescencie na detekciu zearalenónu. Analytická bioanalytická chémia 2019, 411 (10): 2169–2175.
10. Zhang F, Zou M, Chen Y, Li J, Wang Y, Qi X, Xue Q: Imunochromatografické prúžky značené lantanoidom na rýchlu detekciu Pantoea stewartii subsp. Stewart. Biosensors bioelektronika 2014, 51:29–35.
11. Nankoberanyi S, Mbogo G, LeClair N, Conrad M, Tumwebaze P, Tukwasibwe S, Kamya M, Tappero J, Nsobya S, Rosenthal P: Validácia reakcie na detekciu ligázy fluorescenčným mikrosférickým testom na detekciu polymorfizmov sprostredkujúcich rezistenciu na Plasmodium falciparum v Ugande. Malaria Journal 2014, 13:95.
12. Xu H, Dong Y, Guo J, Jiang X, Liu J, Xu S, Wang H: Produkcia monoklonálnych protilátok a vývoj nepriameho kompetitívneho enzýmového imunosorbentného testu na skríning T-2 toxínu v mlieku. Toxicon 2018, 156:1–6.
Moli Yin1 , Yuanwang Nie2 , Hao Liu2 , Lei Liu1 , Lu Tang1 , Yuan Dong2 , Chuanmin Hu1 a Huiyan Wang1
1 Jilin Collaborative Innovation Center for Antibody Engineering, Jilin Medical University, 132013 Jilin, PR Čína.
2 Laboratórna akadémia, Jilin Medical University, 132013 Jilin, PR Čína.
