ČASŤⅠ: Nové ochranné účinky extraktu Cistanche Tubulosa proti degeneratívnej retinopatii indukovanej modrým svetlom s nízkou svietivosťou
Mar 04, 2022
Kontakt: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com
Man-Ru Wu Cheng-Hui Lin Jau-Der Hob George Hsiao, Yu-Wen Cheng
Farmaceutická fakulta, College of Pharmacy, Taipei Medical University, Taipei, Katedra oftalmológie, Taipei Medical University, Taipei, Department of Farmakology, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, Taipei, Graduate Institute of Medical Sciences, College of Medicína, Taipei Medical University, Taipei, Ph.D. Program v biotechnologickom výskume a vývoji, College of Pharmacy, Taipei Medical University, Taipei, Taiwan
Abstraktné
Pozadie/ciele:Fototoxicita indukovaná modrým svetlom emitujúcim diódové svetlo (BLL) hrá dôležitú úlohu pri očných ochoreniach a spôsobuje degeneráciu sietnice a apoptózu v bunkách ľudského retinálneho pigmentového epitelu (RPE).Extrakt z Cistanche tubulosa (CTE)je tradičná čínska medicína s mnohými prospešnými ochrannými vlastnosťami; len málo štúdií však skúmalo očné ochranné úlohy CTE. V tejto štúdii sme skúmali mechanizmy, ktoré sú základom účinkov CTE na apoptózu indukovanú BLL in vitro a in vivo. Metódy: Bunky RPE boli aplikované v súčasnej štúdii in vitro a životaschopnosť buniek bola stanovená pomocou 3-(4,5-dimetyltiazol- 2-yl)-2,{{6} } test difenyltetrazóliumbromidu. Expresia proteínu súvisiaceho s apoptózou bola stanovená analýzou Western blot a imunofluorescenčným farbením. Na skúmanie expozície komerčne dostupnému BLL in vivo sa použili hnedé nórske potkany. Farbenie hematoxylínom a eozínom, terminálne značenie dUTP nick end deoxynukleotidyl transferázou (TUNEL) a testy western blot sa použili na skúmanie morfologickej deformácie sietnice. Výsledky: CTE významne inhibovalo poškodenie RPE vyvolané peroxidom vodíka, terc-butylhydroperoxidom, azidom sodným a BLL. CTE ďalej znížila expresiu apoptotických markerov, ako je štiepená kaspáza-3 a farbenie TUNEL po expozícii BLL inaktiváciou apoptotických dráh, ako je ukázané prostredníctvom imunofluorescenčného farbenia. Okrem toho CTE inhiboval BLL-indukovanú fosforyláciu c-Jun N-terminálnej kinázy, extra signálne súvisiace kinázy 1/2 a p38 v RPE bunkách. In vivo perorálne podávanie CTE zachránilo 60-dňové periodické úbytky hrúbky sietnice vyvolané expozíciou BLL a znížilo počet buniek pozitívnych na TUNEL v modeli potkana hnedého Nórska. Záver: CTE je potenciálne profylaktické činidlo proti fototoxicite vyvolanej BLL
Úvod
Štúdie vekom podmienenej makulárnej degenerácie (VPMD) uvádzajú, že týmto ochorením trpí 8,7 percenta svetovej populácie [1]. AMD je neurodegeneratívne ochorenie, ktoré spôsobuje deformáciu fotoreceptorov, atrofiu retinálneho pigmentového epitelu (RPE), apoptózu gangliových buniek a stratu centrálneho videnia u staršej populácie a stáva sa celosvetovou sociálnou záťažou. VPMD sa klasifikuje buď na suchú alebo vlhkú formu [2, 3]. Zlepšenia v technológii viedli k tomu, že ľudia trávia viac času používaním moderných digitálnych zariadení, a preto sú ľudia vystavení emisiám modrého svetla (BL) počas dlhého obdobia. Otázka fototoxicity vyvolanej BL v sietnici však nie je dobre preskúmaná. Nadmerná expozícia krátkovlnnej BL (450–495 nm) vedie k tvorbe reaktívnych foriem kyslíka (ROS), ako sú superoxidové a hydroxylové radikály, ktoré spôsobujú zvýšenie spotreby kyslíka a indukujú poškodenie mitochondriálnej DNA. Akumulácia ROS má za následok oxidačný stres a rozsiahlu akumuláciu retinoidných aduktov, ktoré ďalej poškodzujú sietnicu [4]. Výskum ukázal, že oxidačný stres je hlavným faktorom v patogenéze suchej AMD [5]. Okrem toho ožarovanie BL znižuje expresiu retinálnych antioxidačných enzýmov, ako je superoxiddismutáza a kataláza, sprostredkovaním interakcií proteínov Bax/Bcl{13}} a podporou endogénnej produkcie ROS. Bunky RPE a mitochondrie vonkajšieho segmentu fotoreceptorov ako také trpia poškodením vyvolaným BL ožiarením [6, 7]. Okrem generovania ROS, ožarovanie BL aktivuje mitogénom aktivované proteínkinázy (MAPK), ktoré hrajú dôležitú úlohu pri prežití buniek a apoptóze. Proapoptotické proteíny súvisiace s apoptózou závislé od mitochondrií, ako sú Bax a kaspáza-3, sa aktivujú ožiarením diódovým svetlom vyžarujúcim BL (BLL) prostredníctvom c-Jun N-terminálnej kinázy (JNK) a p38 v RPE a gangliové bunky sietnice [8]. Okrem toho antioxidačné dráhy závislé od fosfatidylinozitol 3-kinázy (PI3K)/Akt a erytroidného 2-faktora súvisiaceho s jadrovým faktorom 2 (Nrf2) sú súčasťou obranného systému buniek RPE [{{34} }].
Extrakt z Cistanche tubulosa (CTE)obsahuje deriváty fenyletanoidových glykozidov a už desaťročia sa používa ako tradičná čínska medicína. Echinakozid, akteozid a izoakteozid sú tri hlavné aktívne zlúčeniny CTE, ktoré sú charakterizované tým, že majú neuroprotektívne vlastnosti, vlastnosti zlepšujúce pamäť, imunitnú reguláciu a vlastnosti proti fibróze pečene [13, 14]. Echinakozid je lapač ROS a chráni pred apoptózou vyvolanou 1-metyl-4-fenylpyridínium iónom (MPP plus ) na zvieracích modeloch Parkinsonovej choroby [15, 16]. Akteozid chráni pred amyloidom{10}}indukovanou neurotoxicitou a znižuje lipopolysacharidmi stimulovaný zápal, ktorý možno pripísať translokácii Nrf2 z cytoplazmy do jadra a väzbe na prvky antioxidačnej odozvy. Na inhibíciu nadmernej angiogenézy sa používajú súčasné dostupné terapie pre vlhkú AMD, ako je pegaptanib, ranibizumab, bevacizumab a aflibercept [17, 18]. V dôsledku mnohých patologických komplikácií tohto ochorenia však neexistuje žiadna účinná liečba suchej AMD.
V tejto štúdii demonštrujeme ochranné účinky CTE v bunkách RPE a potkanoch Brown Norway (BN). Okrem toho sme aplikovali dlhodobú expozíciu BLL s nízkym jasom na modely in vitro aj in vivo, aby sme vyhodnotili ochranné účinky CTE. Zistili sme, že CTE znížila expresiu proteínov súvisiacich s apoptózou po expozícii BLL. Okrem toho CTE znížil počet terminálnych deoxynukleotidyltransferázových buniek dUTP pozitívnych na značenie konca nick end labeling (TUNEL) v sietnici potkanov BN po dlhodobej expozícii BLL s nízkou svietivosťou. Táto štúdia poskytuje ďalšie poznatky o nových antiapoptotických účinkoch CTE a informácie týkajúce sa novej stratégie na liečbu degenerácie sietnice.
Extrakt z Cistanche tubulosa (CTE): fenyletanoidový glykozid
Materiály a metódy
Chemikálie a produkty
CTE veľkoryso poskytla spoločnosť Sinphar Pharmaceutical Company (Yilan, Taiwan). Súpravy na detekciu bunkovej smrti in situ (kat. č. 11-684-817-910) boli zakúpené od spoločnosti Roche (Mannheim, Nemecko).
RPE bunková kultúra
RPE bunky (ARPE{0}} a ATCC® CRL-2302™) boli zakúpené od American Type Culture Collection (Manassas, VA) a kultivované v Dulbeccovom modifikovanom Eagleovom médiu (Gibco, Grand Island, NY) doplnené 10 percentným fetálnym hovädzím sérom vo vlhkej atmosfére s 5 percentami CO2 pri 37 stupňoch . Bunky ARPE-19 v pasáži 19–30 sa udržiavali na miskách na kultiváciu buniek 10-cm (Orange Scientific, Braine-l'Alleud, Belgicko). Po pasážovaní s 0,05 percentami kyseliny trypsín-etyléndiamíntetraoctovej (Gibco) boli bunky znovu nanesené v pomere 1:4. Pred testovaním boli bunky ARPE{16}} nasadené na 48-jamkové platne (Orange Scientific) na analýzu životaschopnosti buniek v hustote 1,0 × 105 buniek/ml a na 6-cm misky (Orange Scientific ) pre analýzy westernovým prenosom pri hustote 2,0 x 105 buniek/ml počas 24 hodín. Keď bunky ARPE-19 dosiahli 80 percent konfluencie, uskutočnili sa nasledujúce experimenty.
Liečba liekom a test životaschopnosti buniek
Bunky RPE v pasáži 19 – 30 sa naočkovali na 48-jamkové platne a spoločne ošetrili 24 hodín rôznymi koncentráciami CTE, peroxidu vodíka (H2O2), terc-butylhydroperoxidu (t-BHP) a azidu sodného ( NaN3). Bunky sa potom kultivovali s 3-(4, 5-dimetyltiazol-2-yl)-2, 5-difenyltetrazólium bromidom (MTT) v konečnej koncentrácii 1 mg /ml a inkubovali sa 30 min. Potom sa do každej jamky pridal dimetylsulfoxid (200 ul), aby sa bunky rozpustili. Absorbancia sa merala pri 570 nm s použitím Sunrise™ spektrofotometra s enzýmovým imunosorbentovým testom (MRX-TC; Dynex Technologies, Chantilly, VA). Hodnoty boli korigované na absorbanciu pozadia odčítaním príslušných slepých hodnôt. Údaje pochádzajú z piatich nezávislých testov.
Protokol expozície BL in vitro
Svetelný zdroj a bunkové platne boli umiestnené 25 cm od seba, ako je opísané v našej predchádzajúcej štúdii [19]. Svietivosť bola meraná expozimetrom (LM-81LX; Lutron Electronic Enterprise, Taipei, Taiwan). BLL dosiahol vrchol pri 460 nm (60 lux) počas uvedeného času (0–48 h), v závislosti od experimentálneho dizajnu.
Western blotting
Po 0–48- hodinách spoločnej liečby s expozíciou CTE a BLL sa bunky dvakrát premyli ľadovo studeným fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom (PBS) a resuspendovali sa v lyzovacom pufri pre rádioimunoprecipitačný test (1 % Nonidet P-40, 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM Na3V04, 1 mM etylénglykol-bis(-aminoetyléter)-N,N,N',N'-tetraoctová kyselina, 1 mM NaF a kokteil inhibítorov proteázy/fosfatázy). Bunkový lyzát sa získal centrifugáciou pri 12, 000 x g počas 35 minút a supernatant sa zhromaždil na stanovenie koncentrácií proteínov pomocou Bradfordovho činidla (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Rovnaké množstvá proteínových vzoriek sa oddelili elektroforézou na 10 až 12 percentách dodecylsulfátu sodného a polyakrylamidového gélu a potom sa preniesli na polyvinylidéndifluoridovú membránu. Potom, čo bola membrána blokovaná 5 percentným odtučneným mliekom a inkubovaná v Tris-pufrovanom fyziologickom roztoku s Tween 20 (TBST) počas 1 hodiny, bolo uskutočnené imunoblotovanie s primárnymi protilátkami špecifickými pre štiepenú kaspázu-3, fosfo-JNK, JNK , fosfo-p38, p38, fosfo-extracelulárna kináza súvisiaca so signálom (ERK), ERK, Bcl-2, Bax, Fas-asociovaný proteín s doménou smrti (FADD), kaspáza-8 (GeneTex, Irvine , CA), Fas-ligand (Abcam, Cambridge, UK) a b-aktín (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Bloty sa potom inkubovali so sekundárnymi protilátkami konjugovanými s chrenovou peroxidázou (1:6000 v TBST; Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) počas 1 hodiny pri teplote miestnosti. Pomocou vylepšenej chemiluminiscenčnej súpravy (Millipore, Billerica, MA) sa intenzita pásov na každom blote analyzovala pomocou softvéru Image J po normalizácii na b-aktín.
Imunofluorescencia
Bunky RPE boli fixované 4 percentami paraformaldehydu v PBS počas 15 minút. Potom sa k bunkám pridal Triton X-100 v PBS (0,2 percenta) na 15 minút a potom 5 percent fetálneho bovinného séra v PBS na 30 minút; bunky sa potom inkubovali s protilátkou proti štiepeniu kaspázy-3 v pomere 1:250 počas 24 hodín (Cell Signaling Technology, Danvers, MA). Použila sa kozia anti-králičia IgG sekundárna protilátka (Dylight 594) v pomere 1:200 (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Bunkové jadrá boli zafarbené 4'-6-diamidino-2-fenylindolom (DAPI; AAT Bioquest, Sunnyvale, CA). Zmeny vo fluorescencii boli pozorované pomocou laserového zobrazovacieho systému konfokálneho spektrálneho mikroskopu CS SP5 (Leica, Teban Gardens, Singapur).
Farbenie TUNEL
Fragmenty DNA, ktoré možno detegovať testom TUNEL, sú významným znakom apoptózy. Použili sme súpravu na detekciu bunkovej smrti in situ (kat. č. 11-684-817-910; Roche) na meranie apoptotickej programovanej bunkovej smrti RPE podľa protokolu výrobcu. Stručne, bunky RPE sme fixovali 4 percentami paraformaldehydu a označili zlomy reťazca DNA v enzymatickej reakcii na detekciu buniek pozitívnych na TUNEL, ktoré sa vyznačovali zelenou fluorescenčnou škvrnou. Zafarbené bunky sa potom skenovali a analyzovali pomocou Tissue FAXS-plus Imaging System (TissueGnostics, Viedeň, Rakúsko). Desaťtisíc udalostí sa spočítalo v hradlovej oblasti RPE a obrázky sme analyzovali na počet buniek pozitívnych na TUNEL pomocou softvéru TissueQuest/HistoQuest (TissueGnostics).
Pokusy na zvieratách
Samce potkanov BN (300–350 g telesnej hmotnosti) boli zakúpené od National Laboratory Animal Center (Taipei, Taiwan) a držané 2–3 mesiace. Potkany boli udržiavané v cykle 12-h/12-h svetlo/tma pri 26 ± 1 stupni, pomere relatívnej vlhkosti 35–47 percent a ad libitnom prístupe k vode a potrave. Neošetrené potkany sa udržiavali v tme, aby slúžili ako kontroly. Protokoly štúdie boli schválené Institutional Animal Care Use Committee of Taipei Medical University (číslo schválenia: LAC-2016-0442). Všetky experimentálne postupy zahŕňajúce použitie zvierat boli v súlade s vyhláseniami Asociácie pre výskum zraku a oftalmológie pre použitie zvierat v očnom a zrakovom experimentálnom výskume.
BLL-indukovaný potkaní model degenerácie sietnice
Použili sme periodický model degenerácie sietnice vyvolaný dlhodobou expozíciou BLL s nízkou svietivosťou, ako je opísané v našej predchádzajúcej štúdii [19]. V stručnosti, BN potkany boli rozdelené do troch skupín: kontrolná skupina, ktorá bola držaná v tmavých podmienkach; skupina vystavená BLL, ktorá bola vystavená periodickej BLL v tme bez rozšírenia zrenice (460 nm, 150 lux) počas 3 hodín denne počas 60 dní; a skupina liečená CTE plus vystavená BLL, ktorá bola vopred liečená CTE (100 mg/kg telesnej hmotnosti) počas 14 dní a potom súbežne liečená periodickou expozíciou BLL počas 3 hodín denne počas 60 dní. Všetky potkany sa vrátili do zvieracích kolónií a na konci experimentálneho obdobia sa obnovil normálny cyklus svetlo/tma (250 lux, 12 h/12 h).
Štatistická analýza
Významné rozdiely sa vypočítali pomocou jednosmernej analýzy rozptylu, po ktorej nasledoval Tukeyho post hoc test a test viacnásobného porovnávania. Štatistická významnosť bola určená p-hodnotami<>
Produkty Cistanche tubulosa
Výsledky
CTE chráni bunky RPE pred poškodením oxidačným stresom
Na vyhodnotenie cytotoxicity CTE prostredníctvom testu MTT sa na bunky RPE aplikovalo niekoľko koncentrácií CTE ({{{{20}}}}–500 ug/ml). Liečba CTE nemala žiadne zjavné toxické účinky na životaschopnosť buniek RPE v žiadnej z testovaných koncentrácií (obr. 1A). Preto sa v nasledujúcich experimentoch použilo 50 a 100 ug/ml CTE. Na skúmanie antiapoptotických účinkov CTE sa rôzne oxidačné induktory (H2O2, t-BHP a NaN3) podávali spolu s CTE do buniek RPE počas 24 hodín. H202, NaN3 a t-BHP znížili životaschopnosť buniek a poškodili bunky RPE spôsobom závislým od dávky (prerezané stĺpce, obr. 1B, 1C a 1D); životaschopnosť buniek bola významne nižšia v bunkách ošetrených 0,03 mM H202, 0,3 mM NaN3 a 0,3 mM t-BHP ako v kontrolnej skupine.
Avšak spoločná liečba s 50 a 100 ug/ml CTE zoslabila poškodenie buniek RPE indukované H2O2-, NaN3- a t-BHP a zvrátilo zníženie životaschopnosti buniek (čierne stĺpce, obr. 1B, 1C a 1D). Vyššie uvedené údaje naznačujú, že CTE zachraňuje bunky RPE pred poškodením oxidačným stresom.
CTE inhibuje BLL-indukovanú RPE bunkovú smrť
V našej predchádzajúcej štúdii sme zistili, že BLL je cytotoxický pre bunky RPE, čo možno pripísať zmenám v expresii Bcl{0}} a Bax. V tejto štúdii sme ďalej skúmali ochranné účinky CTE na poškodenie buniek RPE indukované BLL. Dve modré elektrické LED platne sme umiestnili do inkubátora bunkovej kultúry. Vzdialenosť medzi zdrojom svetla a bunkovými doskami bola 25 cm a intenzita BLL bola 60 luxov, ako bolo merané meračom svetla (obr. 2A). Test MTT preukázal, že expozícia BLL počas rôznych časových období (6-48 hodín) spôsobila smrť buniek RPE v časovom závislosti (obr. 2B). BLL-indukované zníženie životaschopnosti buniek po 24 a 48 hodinách bolo významne zoslabené, keď boli bunky súčasne ošetrené CTE (100 ug/ml) (obr. 2C). Tieto údaje naznačujú, že CTE chráni bunky RPE pred fototoxicitou vyvolanou BLL.
CTE inhibuje apoptózu indukovanú BLL v bunkách RPE reguláciou dráh Bcl-2/Bax a Fas/FasL
Na základe potenciálnych ochranných účinkov CTE v bunkách RPE sme ďalej skúmali možné zapojenie CTE do tohto procesu. Boli skúmané dve apoptotické signálne dráhy, tj Bax/Bcl{{0}} a Fas/Fas ligand (FasL) a súvisiace proteíny (napr. pro-kaspáza-8 a pro-kaspáza -3, obr. 3A a 3B). Zistilo sa, že expozícia BILL (6–48 hodín) zvyšuje expresiu proteínov Bax/Bcl-2, FasL a FADD v časovom závislosti (obr. 3A). Okrem toho BLL znížila reguláciu proteínovej expresie prokaspázy-3 a prokaspázy-8, čo malo za následok viac štiepnych foriem kaspázy-3 a kaspázy-8 po expozícii BLL, čo je v súlade s našimi predchádzajúca štúdia [19]. Na ďalšie vyhodnotenie ochranných účinkov CTE sa na bunky RPE vystavené BLL aplikovali rôzne koncentrácie CTE (obr. 3B). Po 48-h BLL expozícii CTE (50 µg/ml) znížil pomer Bax/Bcl-2. Ďalej CTE (100 µg/ml) znížila proteínovú expresiu FasL a FADD, ale významne zvýšila hladiny prokaspázy-8 a prokaspázy-3 (obr. 3C a 3D). Štúdie ukázali, že aktivácia kaspázy{27}} je markerom apoptózy v bunkách RPE [20]. Na ďalšie potvrdenie ochranných účinkov CTE sme vykonali imunofluorescenčné farbenie štiepenej kaspázy-3. Zistilo sa, že expozícia BILL počas 48 hodín indukuje štiepenie kaspázy-3 a translokáciu do jadra, čo vedie k apoptóze buniek RPE (žlté šípky, obr. 4A). Keď sa však bunky exponované BLL spoločne ošetrili s CTE (100 ug/ml), expresia štiepenej kaspázy-3 indukovaná BLL bola inhibovaná. Aby sme lepšie pochopili antiapoptotické účinky CTE, použili sme farbenie TUNEL na detekciu fragmentov DNA v bunkách RPE. Po 48-h expozícii BLL sa TUNEL-pozitívne bunky zvýšili z 1,78 ± 0,36 percenta na 23,82 ± 0,33 percenta; tento účinok bol oslabený spoločnou liečbou s CTE (23,82 ± 0,33 percenta až 2,22 ± 0,11 percenta; obr. 4B, 4C a 4D). Tieto výsledky naznačujú, že liečba CTE silne chráni bunky RPE pred apoptózou indukovanou BLL sprostredkovaním dráh Bax/Bcl-2 a FasL/FADD.
CTE inhibuje BLL-indukovanú fosforyláciu proteínov stresovej reakcie v RPE bunkách
Predchádzajúce štúdie ukázali, že dráhy MAPK, ako sú ERK, JNK a p38 MAP, sú aktivované v bunkách RPE a v sietnici po vystavení ultrafialovému svetlu alebo BL [21, 22]. Preto, aby sa preskúmali regulačné účinky CTE na dráhu stresovej reakcie MAPK po expozícii BLL, aplikovalo sa 100 ug/ml CTE na bunky RPE pri rôznych časoch expozície BLL (obr. 5A). Analýza Western blot ukázala, že fosforylované ERK, JNK a p38 boli aktivované po expozícii BLL, ale významne inhibované po spoločnej liečbe s CTE v bunkách RPE (obr. 5B). Vyššie uvedené výsledky naznačujú, že CTE inhibuje poškodenie buniek RPE indukované BLL, ktoré môže byť spojené s inhibíciou MAPK v bunkách RPE.
CTE zachraňuje poškodenie sietnice vyvolané BLL po dlhodobej periodickej expozícii na modeli potkanov
Na vyhodnotenie ochranných účinkov CTE sme vystavili potkany BN dlhodobej expozícii BLL počas 60 dní a vyhodnotili sme účinky CTE. Ako je znázornené na schéme znázornenej na obr. 6A, potkany BN boli rozdelené do troch skupín: kontrolná skupina, skupina vystavená BLL a skupina CTE plus BLL (obr. 6A). V skupine CTE plus BLL boli potkany BN kontinuálne suplementované CTE (100 mg/kg telesnej hmotnosti) perorálnou sondou raz denne počas 14 dní pred expozíciou BLL. V deň 0 boli potkany BN spoločne liečené CTE (100 mg / kg telesnej hmotnosti) a vystavené BLL počas 3 hodín denne počas 60 dní. Po 60 dňoch expozície BLL sa zvieratá usmrtili na analýzu Western blot a imunohistochemické farbenie. V skupine CTE plus BLL bola expresia proteínu prokaspázy-3 v homogenátoch oka potkana vyššia po liečbe CTE ako v skupine BLL (obr. 6B a 6C). Tieto údaje ilustrujú, že CTE zabraňuje dlhodobej fototoxicite a apoptóze sietnice indukovanej BLL s nízkou svietivosťou inhibíciou aktivácie štiepenej kaspázy-3. Imunohistochemické farbenie poskytlo viac dôkazov o ochranných účinkoch CTE na štruktúru a fyziologické dráhy sietnice (obr. 7). Ďalej, po expozícii BLL sme zistili, že vnútorná neurónová vrstva sa zmenšila a pozorovali sa morfologické deformácie na vonkajšej neurónovej vrstve (ONL), vrátane vnútorného segmentu/vonkajšieho segmentu v centrálnej aj periférnej sietnici, čo je v súlade s našou predchádzajúcou štúdiou ( Obr. 7B). Dôležité je, že CTE zabránila deformácii RPE buniek, poškodeniu neurónových buniek a celkovému stenčeniu sietnice v skupine CTE plus BLL (obr. 7C). Ďalej sme nepozorovali TUNEL-pozitívne bunky v centrálnej a periférnej sietnici normálnych potkanov (obr. 8Ab a 8Bb). Naopak, po expozícii BLL počas 60 dní boli TUNEL-pozitívne bunky často detegované v ONL centrálnej a periférnej sietnice (obr. 8Ae a 8Be). Farbenie DAPI ONL centrálnej sietnice bolo výrazne znížené v skupine BLL (obr. 8 Ad). Prítomnosť TUNEL-pozitívnych buniek však bola oslabená a DAPI farbenie ONL centrálnej a periférnej sietnice sa zvýšilo v skupine CTE plus BLL (obr. 8Ai a 8Bi).
Produkty Cistanche tubulosa
