Prvá časť Rozdiely v močovom proteóme pri diabete psov s prítomnosťou mikroalbuminúrie a bez nej

Jednoduché zhrnutie

Cukrovka u psov je závažné ochorenie, ktoré môže viesť k mnohým komplikáciám. K dispozícii sú obmedzené údaje o proteomike moču u psov a žiadny vplyv diabetes mellitus na proteóm moču. V tejto štúdii sme sa zamerali na analýzu proteínového zloženia moču odobraného od zdravých zvierat a porovnali ho s dvoma skupinami diabetikov (normoalbuminurický a mikroalbuminurický). Medzi týmito tromi skupinami sú významné rozdiely a domnievame sa, že identifikované proteíny sú sľubné ako potenciálny diagnostický nástroj, ktorý možno neskôr použiť v klinickej praxi a na lepšie pochopenie ochorenia.

Abstraktné

V tejto štúdii sme sa zamerali na analýzu proteínového zloženia moču odobraného od zdravých zvierat a jeho porovnanie s dvomi diabetickými skupinami (DM I normoalbuminurické diabetické psy; DM II diabetické psy s mikroalbuminúriou). Snažili sme sa identifikovať potenciálne proteíny v moči, ktoré by mohli byť u diabetických pacientov regulované smerom nahor alebo nadol ešte pred objavením sa mikroalbuminúrie. Metódy: Po získaní moču sme vykonali dvojrozmernú elektroforézu, po ktorej nasledovala softvérová analýza Delta2D, ktorá umožnila selekciu a identifikáciu pomocou spektrometrie MALDI-TOF, štatisticky významných rozdielne exprimovaných proteínov. Naša štúdia odhalila 286 bežných proteínových škvŕn na 2D géloch od diabetickej a kontrolnej skupiny. Z týchto proteínov bolo päť pozitívne identifikovaných pomocou MALDI-TOF MS. Na ďalšie vyhodnotenie piatich diferencujúcich proteínov sa použil program Panther na ich priradenie k príslušným biologickým procesom. Záver: Značný počet identifikovaných proteínov hrá úlohu v intracelulárnej signalizácii – tvorbe vezikúl, väzbe a transporte cez membrány. To môže naznačovať, že prvé príznaky renálneho diabetického bunkového poškodenia možno pozorovať v zložení moču skôr, ako sa objavia akékoľvek klinické príznaky.

Kľúčové slová

poškodenie obličiek; diabetická nefropatia; diabetes mellitus u psov; markery moču; proteomický.

Kliknite sem a získajte výhody Cistanche

Úvod

Diabetes mellitus (DM) je pomerne častá endokrinopatia vyskytujúca sa väčšinou u psov stredného a staršieho veku [1,2]. Môže viesť k početným komplikáciám, ako je vaskulopatia, systémová hypertenzia a nefropatia [1]. Vzhľadom na ich krátku životnosť sa tieto komplikácie vyskytujú u malých zvierat zriedkavo, ale môžu spôsobiť závažné ochorenie [3,4]. Existuje tiež nedostatok informácií o koncentrácii albumínu v moči u psov so spontánnym DM. V predchádzajúcej štúdii sa zistilo, že 20 percent psov s cukrovkou má proteinúriu na základe pomeru proteínov ku kreatinínu v moči (UPC) > 1 a 46 percent bolo hypertenzných [5]. Mazzi a kol. hlásili zvýšenú koncentráciu albumínu u 55 percent diabetických psov, pričom viac ako polovica z nich mala súčasne zvýšenie pomeru bielkovín v moči ku kreatinínu (UPC) [6]. V inej štúdii bola prevalencia mikroalbuminúrie u diabetických pacientov na rovnakej úrovni, navyše sa u dvoch z troch psov s mikroalbuminúriou a normálnym UPC pri počiatočnom hodnotení vyvinul zvýšený UPC počas longitudinálnej štúdie [4].

Urinary proteins are a promising target for detecting kidney injury. Only a minimal amount of proteins is present in normal urine, due to the mechanical barrier of the glomerulus, and the reabsorption in the proximal tubules. Urinary total protein (UTP) contains proteins originating from filtered plasma, lower urinary tract, and kidney-derived proteins. High urinary protein concentration can be a result of nephron dysfunction, as a healthy glomerular filtration barrier excludes proteins larger than 69 kDa, the molecular weight of albumin. Also, it is worth noticing that positively charged proteins pass the glomerular barrier easier than negatively charged ones. In conditions of disease, the glomerular barrier gradually collapses, allowing large amounts of proteins of high, or intermediate weight to pass into the ultrafiltrate. Proteins of small molecular weight (>69 kDa) sú voľne filtrované v glomerule, ale neskôr sú reabsorbované proximálnymi tubulmi obličiek, preto primárna aj sekundárna tubulárna dysfunkcia môže viesť k proteinúrii [7].

Pokroky v proteomickej a metabolomickej štúdii zvýšili našu schopnosť identifikovať tisíce proteínov a peptidov v moči v jedinej analýze – z ktorých niektoré môžu slúžiť ako nové markery. Táto rozsiahla štúdia proteínov sa nazýva proteomika, zatiaľ čo štúdium prirodzene sa vyskytujúcich peptidov generovaných endogénnou proteázovou aktivitou sa nazýva peptidomika. Proteomická analýza sa stala dôležitým nástrojom aj vo veterinárnom výskume [8–12]. Charakterizácia psieho močového proteómu u zdravých psov už bola skúmaná [13]. Proteomika moču a peptidomika pridávajú do skúmania základnej biológie rôzne dimenzie [14]. Ich aplikácia v moči má dôležité klinické dôsledky pre diabetické obličkové ochorenie, keďže moč sa dá relatívne ľahko odobrať neinvazívne a je priamo produkovaný obličkami. Zmeny v relatívnom zastúpení proteínov a peptidov v moči môžu odrážať zmeny v expresii, ukladaní alebo obrate proteínov v diabetickej obličke [15]. Napriek dobre rozvinutému výskumu veterinárnej medicíny týkajúceho sa psov s diabetom, správy o molekulárnych štúdiách moču zostávajú zriedkavé [11,13,14,16,17].

Cieľom tejto štúdie bolo identifikovať proteíny v moči zdravých zvierat a porovnať ich s dvomi skupinami diabetikov (normoalbuminurické psy a psy s mikroalbuminúriou). Snažili sme sa identifikovať potenciálne proteíny v moči, ktoré by mohli byť u diabetických pacientov regulované smerom nahor alebo nadol ešte pred objavením sa mikroalbuminúrie.

Doplnky Cistanche a extrakt z Cistanche

Materiály a metódy

Všetci psi z ambulantnej populácie boli počas dvoch rokov od 2018 do 2020 postupne zaradení do Inovatívneho centra pre patológiu a terapiu zvierat Fakulty veterinárneho lekárstva v Lubline. Všetky vzorky boli získané počas štandardných veterinárnych diagnostických postupov; preto podľa poľského práva nebolo potrebné schválenie Miestnou komisiou pre etiku pri pokusoch na zvieratách, pretože neexistovala žiadna liečba vrátane lekárskej, invazívnej diagnostiky alebo postupov, ktoré by účastníkom spôsobili psychické alebo sociálne nepohodlie. Experimenty boli vykonané na základe legislatívnej smernice Európskej únie 2010/63/EÚ. Štúdia bola vykonaná v súlade s usmerneniami ARRIVE. Majitelia psov boli informovaní o metódach a účele štúdie a dali svoj písomný informovaný súhlas. Štúdia sa uskutočnila na troch skupinách psov: DM I skupina pozostávajúca zo 7 normoalbuminurických diabetických psov (4 samci, 3 sučky, priemerný vek: 7); DM II skupina pozostávajúca zo 7 diabetických psov s mikroalbuminúriou (3 samci, 4 samice, priemerný vek: 8); Skupina H pozostáva zo 7 zdravých psov (4 psy, 3 sučky, priemerný vek: 7).

DM bola diagnostikovaná nálezom pretrvávajúcej výraznej hyperglykémie (glukóza v plazme > 200 mg/dl; 11 mmol/l) a glukozúrie u psov s klinickými príznakmi zodpovedajúcimi tomuto ochoreniu (polyúria, polydipsia, strata hmotnosti).

Okrem toho majitelia vyplnili štandardizovaný dotazník na zdokumentovanie zmien v spotrebe vody a potravy, frekvencii močenia a aktivite v porovnaní s normálom pre ich domáce zvieratá.

Ako študijná skupina bolo 14 z celkového počtu 30 psov diabetických zmiešaných plemien prezentovaných majiteľom vhodných na zaradenie. Požiadavky na zaradenie boli: (1) predchádzajúca diagnóza diabetes mellitus; (2) inzulínová liečba podávaná aspoň tri mesiace; (3) klinicky stabilný diabetes. Kritériá vylúčenia boli: proteinúria (pomer bielkovín v moči ku kreatinínu > 0,5), aktívny močový sediment, pankreatitída, hyperaktivita nadobličiek, hnisavý zápal maternice a bakteriálne zápaly obličiek alebo močového mechúra. Ako kontrolná skupina bolo zaradených 7 zdravých psov rôznych plemien. Boli považovaní za zdravých na základe fyzikálneho vyšetrenia, celkového počtu krviniek, biochemického profilu plazmy a analýzy moču. Kontrolná skupina bola zvolená tak, aby vekovo zodpovedala študovanej skupine.

U každého psa sa vykonalo klinické vyšetrenie s meraním krvného tlaku, rutinné biochemické a hematologické krvné testy a analýza moču. Každá vzorka krvi sa odobrala pomocou uzavretého vákuového systému do skúmavky obsahujúcej EDTA a podrobila sa hematologickej analýze v analyzátore Exigo Vet (Boule, Spånga, Švédsko). Plazma získaná po centrifugácii pri 3000 ot./min počas 15 minút pri 4 °C sa analyzovala v BS-130 automatickom biochemickom analyzátore (Mindray, Shenzhen, Čína). Chemický panel zahŕňal alanín transferázu, aspartátaminotransferázu, celkový bilirubín, močovinu, kreatinín, alkalickú fosfatázu, glukózu, albumín, celkový proteín, amylázu, -glutamyltransferázu. Stanovila sa tiež koncentrácia sérového kortizolu pomocou enzýmovo amplifikovaného chemiluminiscenčného testu (analyzátor Immulite 1000). U diabetických psov sa glykemická kontrola odhadla pomocou koncentrácie fruktozamínu v sére. Vzorky vyprázdneného stredného prúdu moču sa odoberali ráno a každá vzorka sa v deň odberu centrifugovala pri 500 x g počas 10 minút pri 4 °C. Supernatanty sa odstránili a pridali sa inhibítory proteázy (Protease Inhibitor Cocktail, Sigma, P8340, Spruce Street, Saint Louis, MO, USA.) Celkové proteíny v moči a kreatinín sa stanovili pomocou komerčných súprav na automatizovanom chemickom analyzátore (Mindray BS{11 }}). UPC sa vypočítalo pomocou nasledujúceho vzorca: UPC=proteín v moči (mg/dl)/kreatinín v moči (mg/dl). Základná analýza moču s mikroskopickou analýzou sedimentu bola vykonaná na čerstvých vzorkách moču. Špecifická hmotnosť moču (USG) sa merala pomocou refraktometra. Mikroalbuminúria sa merala pomocou komerčne dostupnej testovacej súpravy ELISA (Canine Microalbuminúria Elisa Kit, My Biosource, San Diego, CA, USA). Test mikroalbuminúrie sa uskutočnil podľa pokynov výrobcu. Albuminúria bola hodnotená pomerom albumínu ku kreatinínu v moči (UACR) v čerstvej vzorke moču. Zvyšný moč bol zmrazený na -80 ◦C na ďalšiu analýzu.

Štandardizované Cistanche

Proteomická analýza moču

Na proteomickú analýzu sa odobralo 7 individuálnych vzoriek moču zo skupiny I (DM I), 7 individuálnych vzoriek moču zo skupiny II (DM II) a 7 individuálnych vzoriek moču zo zdravej skupiny (H).

Každá vzorka moču bola purifikovaná, odsolená a koncentrovaná pomocou Amicon Ultra-0.5 3 kDa odstredivých filtračných jednotiek (Merck KGaA, Darmstadt, Nemecko). Koncentrácie proteínov sa merali pomocou mikroobjemového spektrofotometra (MaestroNano, Maestrogen, Xinzhu, Taiwan) a potom sa pripravili vzorky moču a podrobili sa 2D elektroforéze. Po grafickej a štatistickej analýze boli proteíny, ktoré nás zaujímali, vyrezané z gélu na ďalšiu identifikáciu pomocou hmotnostnej spektrometrie pomocou techniky MALDI-TOF MS (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization – Time of Flight Mass Spectrometry).

1. 2D elektroforéza

Dvojrozmerná elektroforéza bola prvou fázou výskumu, ktorá vedie k separácii bielkovín v moči. Stručne povedané, 200 µg proteínu na 17 cm prúžok sa prijalo prostredníctvom zrážacej súpravy (Ready-Prep™ 2-D Cleanup Kit, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) . Proteínové pelety sa rozpustili v rehydratačnom pufri (ReadyPrep 2-D Rehydratation/Sample Buffer 1, BioRad, Hercules, CA, USA) a výsledné roztoky sa naniesli na rehydratačnú platňu pokrytú 17 cm imobilizovaným pH gradientom (IPG ) lineárne pásiky na izoelektrickú fokusáciu (ReadyStrip IPG Strips, pH 3–10, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) a minerálny olej (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Po 12 hodinách rehydratácie boli prúžky s nasiaknutými proteínmi prenesené do IEF-100 Hoeferovho prístroja (Hoefer IEF100, Hoefer, Inc., Holliston, MA, USA), aby sa uskutočnila elektroforéza v prvom rozmere (podmienky procesu: 250 V /30 min; 10,000 V/3 h; 60 kV/h, s limitom prúdu 50 µA/pásik). Potom sa prúžky postupne ekvilibrovali v roztokoch 1,4-ditiotreitolu a jódacetamidmočoviny/TRIS/SDS. Každý ekvilibračný krok trval 15 minút. Ekvilibrované prúžky sa potom podrobili druhej dimenzii elektroforézy, aby sa oddelili proteíny podľa ich molekulových hmotností v 12,5 % polyakrylamidových géloch s nasledujúcimi aktuálnymi parametrami: 600 V/30 mA/100 W v elektroforetickej komore (PROTEAN® II xi, Bio-Rad , Hercules, CA, USA). Získané gély sa podrobili štandardnému postupu farbenia striebrom s dusičnanom strieborným v prítomnosti formaldehydu. Po zafarbení boli gély naskenované pomocou Image Scanner III (GE Healthcare, Chicago, IL, USA) a spracované softvérom Delta2D (verzia 4.7, DECODON, Greifswald, Nemecko). Štatistická analýza sa uskutočnila po manuálnom vylúčení falošne pozitívnych a falošne negatívnych škvŕn. Naskenované obrázky boli zdeformované technológiou SmartVectors v softvéri Delta2D, čo znamená, že škvrny rovnakého proteínu mali rovnakú polohu vo všetkých géloch v projekte. Použitie deformácie gélových obrázkov umožnilo elimináciu rozdielov medzi gélovými obrázkami a ich zarovnanie. Ďalej sa na vytvorenie zlúčených obrázkov použili deformované obrázky. Fúzovaný obraz reaguje na mapu proteómu obsahujúcu každú proteínovú škvrnu získanú v celom experimente. Vygenerovali sa expresné pomery a urobili sa štatistiky pre normalizované objemy pomocou jednosmernej ANOVA (p-hodnota menšia alebo rovná 0,05) a post hoc Tukeyho porovnávacieho testu. Označené proteínové škvrny boli vyrezané z gélov, odfarbené, redukované a alkylované použitím roztokov ditiotreitolu a jódacetamidu. Kúsky gélu obsahujúce proteíny sa podrobili tryptickej digescii, aby sa získali peptidové fragmenty. Štiepenie trypsínom sa uskutočnilo v 50 mM tlmivom roztoku hydrogénuhličitanu amónneho pri 37 °C počas 12 hodín (Promega, Trypsin Gold, Mass Spectrometry Grade, Technical Bulletin). Peptidy sa následne eluovali z gélových kúskov roztokom voda/acetonitril/TFA (v:v 45:50:5) trojnásobnou extrakciou a získané extrakty sa koncentrovali vo vákuu (Labconco, Kansas City, MO, USA). Získané peptidové pelety sa rozpustili v 0,1 percentnej kyseline trifluóroctovej a vyčistili sa špičkami pipiet C18 Zip-TIP podľa pokynov výrobcu (Merck Chemicals, Billerica, MA, USA, PR 02358, technická poznámka) a pripravili sa na analýzu hmotnostnou spektrometriou.

Cistanche pilulky

2. Hmotnostná spektrometria

Jeden ul pripravených peptidových roztokov bol nanesený na doštičku Anchor Chip MALDI (Bruker, Bremen, Nemecko). Keď boli vzorky proteínov vysušené, ich povrchy boli pokryté 1 ul matrice kyseliny -kyano-4-hydroxyškoricovej (HCCA, Bruker, Brémy, Nemecko). Roztok štandardu peptidov (Peptide Calibration Standard II, Bruker, Bremen, Nemecko) bol tiež nanesený a pokrytý matricou na kalibračných bodoch. Hmotnostné spektrá boli zaznamenané v režime aktívneho pozitívneho reflektora v rozsahu 700–4{20}}00 m/z pomocou spektrometra Ultraflextreme MALDI TOF/TOF (Bruker, Brémy, Nemecko) a softvér flexControl 3.3 (Bruker, Brémy, Nemecko). Zozbierané spektrá boli vyhladené a korigované na základnú líniu. Vygenerovaný v softvéri flexAnalysis 3.0 (Bruker, Bremen, Nemecko), zoznam vrcholov pre pomer signálu k šumu > 3 bol prenesený do BioTools 3.2 (Bruker, Bremen, Nemecko) a porovnaný so softvérom Mascot 2.2 (Matrix Science, Boston, MA, USA) pomocou databázy Swiss-Prot obmedzenej na taxonómiu „cicavcov“ s maximálnou chybou 0,3 Da a karbamidometyláciou cysteínu ako povinnou modifikáciou. Výsledky so skóre maskota nad 61 sa považovali za štatisticky významné (p menšie alebo rovné 0,05); inak boli fragmentové iónové spektrá vybraných peptidov získané použitím LIFT módu a kombinované s cieľom identifikácie MALDI TOF/TOF.

Referencie

1. Hoenig, M. Porovnávacie aspekty diabetes mellitus u psov a mačiek. Mol. Bunka. Endocrinol. 2002, 197, 221-229.

2. Davison, LJ; Herrtage, ME; Catchpole, B. Štúdia 253 psov v Spojenom kráľovstve s Diabetes Mellitus. Vet. Rec. 2005, 156, 467–471.

3. Sleď, IP; Panciera, DL; Werre, SR Pozdĺžna prevalencia hypertenzie, proteinúrie a retinopatie u psov so spontánnym diabetom mellitus. J. Vet. Stážista. Med. 2014, 28, 488–495.

4. Muñana, KR Dlhodobé komplikácie diabetu mellitu, I. časť: Retinopatia, nefropatia, neuropatia. Vet. Clin. N. Am. Malé zviera. Prax. 1995, 25, 715-730.

5. Struble, AL; Feldman, EC; Nelson, RW; Kass, PH systémová hypertenzia a proteinúria u psov s diabetes mellitus. J. Am. Vet. Med. Doc. 1998, 213, 822-825.

6. Mazzi, A.; Fracassi, F.; Dondi, F.; Gentilini, F.; Famigli Bergamini, P. Pomer bielkovín v moči ku kreatinínu a albumínu ku kreatinínu u psov s diabetom mellitus a hyperadrenokorticizmom. Vet. Res. komun. 2008, 32 (Suppl. S1), S299–S301.

7. D'Amico, G.; Bazzi, C. Patofyziológia proteinúrie. Kidney Int. 2003, 63, 809-825.

8. Banach, T.; Adaszek, Ł.; Wyłupek, D.; Winiarczyk, M.; Winiarczyk, S. Použiteľnosť 2D gélovej elektroforézy a kvapalinovej chromatografie v proteomickej analýze moču pomocou hmotnostnej spektrometrie MALDI-TOF. Pol. J. Vet. Sci. 2013, 16, 587–592.

9. de Freitas Campos, C.; Cole, N.; Dyk, DV; Walsh, BJ; Diakoš, P.; Almeida, D.; Torrecilhas, A.; Laus, JL; Willcox, MDP Proteomická analýza psích sĺz pre potenciálne markery rakoviny. Res. Vet. Sci. 2008, 85, 349–352.

10. Winiarczyk, D.; Winiarczyk, M.; Winiarczyk, S.; Michalák, K.; Adaszek, Ł. Proteomická analýza slzného filmu získaného od diabetických psov. Zvieratá 2020, 10, 2416.

11. Winiarczyk, D.; Michalák, K.; Adaszek, L.; Winiarczyk, M.; Winiarczyk, S. Močový proteóm psov s poškodením obličiek počas babeziózy. BMC Vet. Res. 2019, 15, 439.

12. Franco-Martínez, L.; Gelemanovič, A.; Horvatič, A.; Contreras-Aguilar, MD; Mrljak, V.; Cerón, JJ; Martínez-Subiela, S.; Tvarijonaviciute, A. Proteóm séra a slín psov s diabetes mellitus. Anim. Otvorený prístup J. MDPI 2020, 10, 2261.

13. Brandt, LE; Ehrhart, EJ; Scherman, H.; Olver, CS; Bohn, AA; Prenni, JE Charakterizácia psieho močového proteómu. Vet. Clin. Pathol. 2014, 43, 193–205. [CrossRef] [PubMed]

14. Ferlizza, E.; Isani, G.; Dondi, F.; Andreani, G.; Vasylyeva, K.; Bellei, E.; Almeida, AM; Matzapetakis, M. Močový proteóm a metabolóm u psov (Canis Lupus Familiaris): Účinok chronického ochorenia obličiek. J. Proteom. 2020, 222, 103795.

15. Van, JAD; Scholey, JW; Konvalinka, A. Náhľady do diabetickej obličkovej choroby pomocou močovej proteomiky a bioinformatiky. J. Am. Soc. Nephrol. 2017, 28, 1050–1061.

16. Nabity, MB; Lees, GE; Dangott, LJ; Cianciolo, R.; Suchodolski, JS; Steiner, JM Proteomická analýza moču samcov psov počas skorých štádií tubulointersticiálneho poranenia v modeli progresívnej glomerulárnej choroby psov. Vet. Clin. Pathol. 2011, 40, 222–236.

17. Pelander, L.; Brunchault, V.; Buffin-Meyer, B.; Klein, J.; Breuil, B.; Zürbig, P.; Magalhães, P.; Mullen, W.; Elliott, J.; Syme, H.; a kol. Peptidómové analýzy moču na diagnostiku chronického ochorenia obličiek u psov. Vet. J. 2019, 249, 73–79.

Dagmara Winiarczyk 1, Mateusz Winiarczyk 2 , Katarzyna Michalak 3 , Stanisław Winiarczyk 3 a Łukasz Adaszek 3

1 Oddelenie vnútorných chorôb malých zvierat, University of Life Sciences of Lublin, 20-400 Lublin, Poľsko

2 Department of Vitreoretinal Surgery, Medical University of Lublin, 20-059 Lublin, Poland; winiarm86@gmail.com

3 Katedra epizootológie, Univerzita prírodných vied v Lubline, 20-400 Lublin, Poľsko; artica@wp.pl (KM); genp53@interia.pl (SW); ukaszek0@wp.pl (Ł.A.)