Časť Ⅱ Nedostatok Smad3 zlepšuje terapiu diabetu a diabetického poškodenia obličiek pomocou ostrovčekov podporovaním bunkovej proliferácie prostredníctvom mechanizmu závislého od E2F3-
May 25, 2023
Metódy
1. Zvieratá
Myši Smad3-null (Smad3KO) sú milým darom od prof. Chuxia Denga a sú chované v heterozygotoch (Smad3 plus /- ) na pozadí C57BL/6 [20]. Myši Smad3KO boli vytvorené krížením myší Smad3 plus /-. db/db myši s mutáciou Lepr (leptínový receptor) na pozadí C57BLKS boli zakúpené od Animal Experimental Center Čínskej univerzity v Hong Kongu (CUHK). Všetky zvieratá boli chované v zariadení bez špecifických patogénov (SPF) s voľným prístupom k potrave a vode v cykle deň/noc 12/12 hodín. Všetky manipulácie so zvieratami v tejto štúdii boli vykonané v súlade s predpismi a schválené Etickou komisiou pre pokusy na zvieratách CUHK s ref. Nie. 18-177-MIS.
2. Model diabetickej myši indukovaný streptozocínom (STZ).
Samcom myší C57BL/6 vo veku 8-10 týždňov sa intraperitoneálne podávalo 50 mg/kg/deň STZ denne počas 5 nepretržitých dní. 5 dní po poslednej injekcii STZ sa myši so stabilnou náhodnou glukózou v krvi vyššou ako 16 mM počas 2 po sebe nasledujúcich dní považovali za úspešný vznik diabetu a použili sa ako recipientné myši na transplantáciu ostrovčekov.
3. Izolácia ostrovčekov, transplantácia a hodnotenie diabetického fenotypu
Ostrovčeky boli izolované zo samcov alebo samíc myší s knockoutovaným Smad3 (KO) alebo myší divokého typu (WT) vo veku 8-10 týždňov, ako už bolo opísané [21]. Na vykonanie transplantácie ostrovčekov bolo indikovaných niekoľko ostrovčekov transplantovaných pod obličkové puzdro samcov db/db myší vo veku 4. týždeň alebo diabetických myší vyvolaných STZ v deň 7 po poslednej injekcii STZ podľa protokolu opísaného Szotom a kol. 22]. Stručne, myš príjemcu bola anestetizovaná anestéziou Combo (1,5 percenta ketamínu a 0,15 percent xylazínu, 6 ul/g telesnej hmotnosti). Po strate vedomia bol urobený rez 1 cm na koži pokrývajúcej ľavú obličku. Jemne vytiahnite obličku a počas operácie ju udržiavajte vlhkú sterilným fyziologickým roztokom. Ihlou 25G urobte malý škrabanec na kapsule, aby ste vytvorili zárez. Uvedené počty ostrovčekov boli dodané do obličkového puzdra hadičkou PE50. Koniec koncov, ostrovčeky boli transplantované, utesnite zárez kauterizáciou s nízkym teplom. Vymeňte obličku a zatvorte pobrušnicu stehmi. Utesnite kožu sponkami. Intraperitoneálne sa injikovalo 100 ul roztoku penicilín-streptomycín (Gibco, kat. č. 15140122, USA), aby sa zabránilo infekcii. Na zmiernenie bolesti bolo intramuskulárne podaných 100 μl Tegmicu. Zviera bolo umiestnené v teplom prostredí až do úplného zotavenia. Rovnaký operačný postup bol tiež uskutočnený na simulovaných kontrolných myšiach, ale bez ostrovčekovej infúzie. Náhodné aj 6-hodinové hladiny glukózy v krvi nalačno (RBG a FBG) v krvi z konca chvosta sa kontrolovali týždenne pomocou prenosného glukomeru (Roche, ACCU-CHEK® Performa). Test inzulínovej rezistencie (IPITT), glukózový tolerančný test (IPGTT), hladiny HbA1c a inzulín v sére boli merané tak, ako bolo opísané vyššie [9].
Pre získanie kliknite semvýhody Cistanche
4. Celková bielkovina v moči a sérový kreatinín
24-hodinový moč sa zbieral v metabolickej klietke. Celkový proteín v moči za 24 hodín sa vypočítal vynásobením objemu moču a koncentrácie proteínu v moči, ktoré sa kvantifikovali pomocou súpravy Quick Start Bradford Protein Assay Kit (Bio-Rad, kat. č. 5000201, USA). Kreatinín v sére bol stanovený pomocou súpravy na kvantifikáciu kreatinínu (Stanbio Laboratory, kat. č. 0430-120, USA).
5. Histopatológia
Renálne histopatologické zmeny sa skúmali na rezoch fixovaných v paraformaldehyde a zaliatych do parafínu (4 µm) s činidlom Periodic Acid-Schiff's (PAS), ako už bolo opísané [23]. Expanzia mezangiálnej matrice bola hodnotená pomocou kvantitatívneho zobrazovacieho programu (Image-Pro Plus 7.0, Media Cybernetics), ako už bolo opísané [23].
6. Imunohistochémia
Obličky alebo pankreas nesúce ostrovčeky boli fixované v 4 percentách paraformaldehydu, zaliate do parafínu a narezané na 4 μm. Po rehydratácii boli rezy ošetrené mikrovlnným získavaním antigénu v 0.01 M citrátu (pH 6.0) počas 10 minút a blokovaním v 5-percentnom BSA počas 1 hodiny . Primárna protilátková inkubácia sa uskutočňovala cez noc pri 4 stupňoch. Na fluorescenčné farbenie sa fluorescenčná sekundárna protilátka aplikovala pri teplote miestnosti (RT) počas 1 hodiny. Pre termogenézu sprostredkovanú DAB bol pred získaním antigénu zahrnutý ďalší krok 3-percentného blokovania H2O2 počas 15 minút. Po primárnej inkubácii protilátky sa pridal HRP-konjugovaný polymér (Envision plus System, Dako, USA). Na farbenie E2F3 sa vyhľadávanie antigénu uskutočnilo v roztoku EDTA-Tris (pH 9,0). Protilátky používané v imunohistochémii sú podrobne uvedené v tabuľke S2. Oblasť pozitívna na farbenie sa kvantifikovala pomocou softvéru Image J (v1.47, NIH, USA).
Extrakt z cistanche
7. Meranie hmoty transplantovaných buniek v obličke nesúcej ostrovčeky
Na semikvantitatívne kvantifikovanie bunkovej hmoty v ostrovčekovom štepe sa použil index priemernej plochy buniek na rez. Stručne povedané, oblička nesúca ostrovčeky (zaliata v parafíne) bola postupne narezaná na 4 μm pozdĺž sagitálnej osi. Kontinuálne rezy v 160 μm intervaloch boli fluorescenčne imunofarbené na inzulín. Aspoň 6 rezov s inzulín-pozitívnym farbením sa použilo na výpočet bunkovej plochy na rez u každej myši. Oblasť buniek pozitívnych na inzulín v každej sekcii bola kvantifikovaná pomocou softvéru Image J (v1.47, NIH, USA). Index priemernej plochy buniek na rez u každej myši sa vypočítal vydelením celkovej plochy s pozitívnym inzulínom na všetky rezy počtom rezov s pozitívnym inzulínom.
8. Primárna kultúra buniek ostrovčekov
Izolované ostrovčeky sa disociovali na jednotlivé bunky a naočkovali sa na 96-jamkovú platňu v 200 μl RPMI 1640 (Gibco, USA) plus 10 percent FBS (Gibco, USA) plus 1 percento penicilín-streptomycín (Gibco, USA) doplnená 20 mM glukózou. Bunky ostrovčekov sa kultivovali počas uvedenej doby v inkubátore nastavenom na 37 stupňov, 5 percent C02 a 100 percent vlhkosť. Na knockdown E2F3 sprostredkovaný adenovírusom sa disociované bunky ostrovčekov kultivovali v médiu obsahujúcom adenovírus nadmerne exprimujúci krátku vlásenkovú RNA (shRNA) zacielenú na myšací E2F3 (shE2F3) alebo kontrolnú nešpecifickú shRNA (zobrazené) pri titri 10 pfu na bunku počas 2 dní, po ktorých nasleduje výmena média. Kmeňová sekvencia duplexu shE2F3 bola 5'-CATCCATGCTCTATTCTGT-3'. Dispergované bunky z 50 ostrovčekov sa naočkovali na jamku na imunofarbenie a RT-PCR a 100 ostrovčekov na jamku na Western blot, ktoré sa uskutočňovali tak, ako bolo opísané vyššie [9].
9. In vivo a in vitro značenie BrdU
Na uskutočnenie in vivo značenia BrdU sa myšiam intraperitoneálne injikovalo 50 mg/kg/deň BrdU (v PBS) počas 7 dní od 2. dňa po transplantácii ostrovčekov a 2 hodiny po poslednej injekcii sa usmrtili. Na in vitro značenie BrdU sa dispergované bunky ostrovčekov kultivovali 48 hodín, potom sa nahradili čerstvým médiom obsahujúcim 10 uM BrdU a kultivovali sa ďalších 24 hodín. Fluorescenčné imunofarbenie proti BrdU v tkanive a kultivovaných bunkách sa uskutočnilo tak, ako bolo opísané vyššie [9].
Cistanche prášok
10. RNA-Sekv
Ostrovčeky boli izolované z myší Smad3WT-db/db, Smad3KO-db/db, Smad3WT-db/m a Smad3KO-db/m. Pre každý genotyp sa spojili ostrovčeky od viac ako 5 myší na izoláciu RNA. RNA bola pripravená pomocou miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Nemecko). RNA-seq a následná analýza údajov boli opísané skôr [9]. Úroveň expresie daného génu bola prezentovaná ako fragmenty na kilobázu transkriptu na milión mapovaných čítaní (FPKM). Rozdielne exprimovaný gén (DEG) bol definovaný ako väčší alebo rovný 2-násobku rozptylu FPKM medzi dvoma skupinami. Upregulované a downregulované DEG sa skombinovali a použili na analýzu obohatenia dráhy génovej ontológie (GO) a Kjótskej encyklopédie génov a genómov (KEGG) s online zdrojmi bioinformatiky DAVID (v6.8) s predvolenými nastaveniami. Na analýzu GO bola použitá podkategória GOTERM_BP_DIRECT.
11. Imunoprecipitácia
Na uskutočnenie imunoprecipitácie v myších ostrovčekoch sa asi 500 čerstvo izolovaných ostrovčekov lyžovalo v 500 ml RIPA pufra. Pridala sa králičia anti-Smad3 protilátka (2 ug) alebo králičí IgG izotyp a inkubovalo sa pri 4 stupňoch cez noc s jemným otáčaním. Potom sa pridalo 20 ul agarózových guľôčok s proteínom A (Beyotime, kat. č. P2051, Čína) a inkubovalo sa 2 hodiny pri 4 stupňoch. Po dôkladnom premytí čerstvým pufrom RIPA sa viazaný proteín uvoľnil denaturáciou v nanášacom pufri 1xSDS a podrobil sa analýze Western blot. Aby sa predišlo vplyvu ťažkého reťazca IgG, na rozpoznanie vyzrážaného proteínu Smad3 sa použil špecifický myší anti-králičí IgG IgG (HRP konjugovaný, Abmart, kat. č. M21006, Čína).
12. Imunoprecipitácia chromatínu - ChIP
Na uskutočnenie ChIP v myších ostrovčekoch sa zozbieralo približne 2 000 ostrovčekov od 8-10 týždňov starých myší C57BL/6 a použili sa ako jeden prípravok ChIP. Čerstvo izolované ostrovčeky boli stimulované 10 ng/ml TGF- 1 (Gibco, USA) počas 15 minút v RPMI 1640 plus 1 percento FBS plus 1 percento penicilín-streptomycín. ChIP sa uskutočnil pomocou súpravy SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (CST, USA) podľa odporúčaných pokynov. Protilátky a priméry použité v ChIP teste sú podrobne uvedené v tabuľke S1 a S2.
Štandardizované Cistanche
13. Duálny luciferázový reportérový test
Myší E2F3 promótor (-1000 až plus 451 bp) bol klonovaný do pGL3-základného vektora (pGL3-E2F3.Pro). Súčasne sa uskutočnila bodová mutácia väzbového miesta Smad3, aby sa vytvoril pGL3- E2F3.Pro. Mut. Na uskutočnenie duálneho luciferázového reportérového testu boli bunky HEK293T nasadené do 24-jamkovej platne v hustote 5 x 104 buniek/jamku. Nasledujúci deň boli bunky transfekované 500 ng pGL3-Basic alebo pGL3-E2F3.pro alebo pGL3-E2F3.pro.mut v kombinácii s pcDNA3.1-Smad3, ktorý nadmerne exprimuje myšací Smad3 alebo nie (ako je uvedené na obrázku 10F) metódou fosforečnanu vápenatého. Vektor pEGFP-C1 bol doplnený na vyváženie transfekčnej dávky pri každom ošetrení. Do každého ošetrenia bolo zahrnutých 10 ng vektora pGL4.73.huc/SV40 exprimujúceho renilovú luciferázu, aby sa normalizovala účinnosť transfekcie. 6 hodín po transfekcii sa médium vymenilo a nasledovala inkubácia počas ďalších 48 hodín. Bunky sa lýzovali a luciferázová aktivita sa stanovila pomocou Dual-Luciferase® Reporter Assay System (Promega, USA) a kvantifikovala sa v luminometri (VICTORTM X{40}} Multilabel Reader, PerkinElmer, USA). Transkripčná aktivita klonovaného promótora E2F3 bola prezentovaná ako pomer hodnôt luciferázy svetlušiek k luciferáze renilla. Každé ošetrenie sa uskutočnilo v troch opakovaniach.
14. Štatistika
Údaje boli prezentované ako priemer ± SD a analyzované pomocou softvéru SPSS (16.0). Normálnosť údajov bola kontrolovaná testom Kolmogorov-Smirnov s jednou vzorkou. Homogenita rozptylov medzi skupinami bola testovaná štatistikou Levene. Na porovnanie medzi oboma skupinami bol použitý Studentov t-test. Na porovnanie medzi viacerými skupinami sa použila jednosmerná ANOVA s testom LSD, ak sa predpokladal rovnaký rozptyl. Pre rovnaký rozptyl, ktorý sa nepredpokladal, sa použila alternatívna štatistika Welchovho testu, po ktorej nasledovalo viacnásobné porovnanie s Tamhaneovým T2 testom. P < 0,05 sa považovalo za štatisticky významné.
Doplnky Cistanche
Závery
Nedostatok Smad3 do značnej miery zlepšuje substitučnú terapiu ostrovčekov pre T1DM aj T2DM a chráni pred diabetickým poškodením obličiek. Zvýšená proliferácia buniek závislá od E2F{4}} môže byť kľúčovým mechanizmom liečby ostrovčekmi Smad3KO u T1DM aj T2DM. Bunková substitučná terapia Smad3KO teda môže byť klinicky lepšou terapeutickou stratégiou pre diabetes.
Referencie
1 Shapiro AM, Pokrywczynska M, Ricordi C. Klinická transplantácia ostrovčekov pankreasu. Nat Rev Endocrinol. 2017; 13: 268-77.
2. Jacobson EF, Tzanakakis ES. Diferenciácia ľudských pluripotentných kmeňových buniek na funkčné pankreatické bunky na liečbu cukrovky: Inovácie, výzvy a budúce smery. J Biol Eng. 2017; 11:21.
3. Toso C, Isse K, Demetris AJ, Dinyari P, Koh A, Imes S, a kol. Histologické hodnotenie štepu po klinickej transplantácii ostrovčekov. Transplantácia. 2009; 88: 1286-93.
4. Lan HY. Rôzne úlohy TGF-beta/Smads pri renálnej fibróze a zápale. Int J Biol Sci. 2011; 7: 1056-67.
5. Meng XM, Tang PM, Li J, Lan HY. Signalizácia TGF-beta/Smad pri renálnej fibróze. Predný Physiol. 2015; 6:82.
6. El-Gohary Y, Tulachan S, Wiersch J, Guo P, Welsh C, Prasadan K a kol. Smad signalizačná sieť reguluje proliferáciu buniek ostrovčekov. Diabetes. 2014; 63: 224-36.
7. Dhawan S, Dirice E, Kulkarni RN, Bhushan A. Inhibícia signalizácie TGF-beta podporuje replikáciu ľudských pankreatických beta-buniek. Diabetes. 2016; 65: 1208-18.
8. Wang P, Karakose E, Liu H, Swartz E, Ackeifi C, Zlatanic V a kol. Kombinovaná inhibícia dráh DYRK1A, SMAD a trithoraxu synergizuje na vyvolanie robustnej replikácie v dospelých ľudských beta bunkách. Cell Metab. 2019; 29: 638-52 e5.
9. Sheng JY, Wang L, Tang PM-K, Wang HL, Li JC, Xu BH a kol. Nedostatok Smad3 podporuje proliferáciu a funkciu beta buniek u db/db myší prostredníctvom obnovenia expresie Pax6. Teranostika. 2021; 11: 2845-59.
10. Zmuda EJ, Powell CA, Hai T. Spôsob izolácie myších ostrovčekov a subkapsulárnej transplantácie obličky. J Vis Exp. 2011.
11. Choi MY, Lim SJ, Kim MJ, Wee YM, Kwon H, Jung CH a kol. Transplantácia izoštepu ostrovčekov zlepšuje citlivosť na inzulín v myšom modeli diabetu 2. typu. Endokrinné. 2021; 72: 660-71.
12. Vijayachandra K, Higgins W, Lee J, Glick A. Indukcia p16ink4a a p19ARF pomocou TGFbeta1 prispieva k zastaveniu rastu a reakcii starnutia v myších keratinocytoch. Mol Carcinog. 2009; 48: 181-6.
13. Farbiar MA, Cepko CL. Regulácia proliferácie počas vývoja sietnice. Nat Rev Neurosci. 2001; 2: 333-42.
14. Dyson N. Regulácia E2F proteínmi rodiny pRB. Genes Dev. 1998; 12: 2245-62.
15. Xiao X, Fischbach S, Song Z, Gaffar I, Zimmerman R, Wiersch J a kol. Prechodné potlačenie signalizácie receptora TGFbeta uľahčuje transplantáciu ľudských ostrovčekov. Endokrinológia. 2016; 157: 1348-56.
16. Nomura M, Zhu HL, Wang L, Morinaga H, Takayanagi R, Teramoto N. Narušenie SMAD2 v myších pankreatických beta bunkách vedie k hyperplázii ostrovčekov a zhoršenej sekrécii inzulínu v dôsledku zoslabenia aktivity K plus kanála citlivého na ATP. Diabetológia. 2014; 57: 157-66.
17. Rady B, Chen Y, Vaca P, Wang Q, Wang Y, Salmon P a kol. Nadmerná expresia E2F3 podporuje proliferáciu funkčných ľudských beta buniek bez indukcie apoptózy. Bunkový cyklus. 2013; 12: 2691-702.
18. Zhang Y, Alexander PB, Wang XF. Signalizácia rodiny TGF-beta pri kontrole bunkovej proliferácie a prežitia. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2017; 9.
19. Wang P, Fiaschi-Taesch NM, Vasavada RC, Scott DK, Garcia-Ocana A, Stewart AF. Diabetes mellitus--Pokroky a výzvy v proliferácii ľudských beta-buniek. Nat Rev Endocrinol. 2015; 11: 201-12.
20. Yang X, Letterio JJ, Lechleider RJ, Chen L, Hayman R, Gu H a kol. Cielené narušenie SMAD3 má za následok zhoršenú slizničnú imunitu a zníženú schopnosť T-buniek reagovať na TGF-beta. EMBO J. 1999; 18: 1280-91.
21. Li DS, Yuan YH, Tu HJ, Liang QL, Dai LJ. Protokol na izoláciu ostrovčekov z pankreasu myší. Nat Protoc. 2009; 4: 1649-52.
22. Szot GL, Koudria P, Bluestone JA. Transplantácia pankreatických ostrovčekov do kapsuly obličiek diabetických myší. J Vis Exp. 2007: 404.
23. Xu BH, Sheng J, You YK, Huang XR, Ma RCW, Wang Q a kol. Delécia Smad3 zabraňuje renálnej fibróze a zápalu pri diabetickej nefropatii 2. typu. Metabolizmus. 2020; 103: 154013.
Hong-Lian Wang1,2, Biao Wei2, Hui-Jun He2, Xiao-Ru Huang2,3, Jing-Yi Sheng2,4, Xiao-Cui Chen2,5, Li Wang1, Rui-Zhi Tan1, Jian-Chun Li1, Jian Liu1, Si-Jin Yang6, Ronald CW Ma2 a Hui-Yao Lan2,7
1 Výskumné centrum integrovanej medicíny a oddelenie nefrológie, Nemocnica tradičnej čínskej medicíny Juhozápadnej lekárskej univerzity, Luzhou, Sichuan, 646000, Čína.
2. Department of Medicine and Therapeutics, a Li Ka Shing Institute of Health Sciences, Čínska univerzita v Hong Kongu, Hong Kong, 999077, Čína.
3. Guangdong-Hong Kong Spoločné laboratórium pre imunologické a genetické ochorenia obličiek, Guangdong Provincial People's Hospital, Guangdong Academy of Medical Sciences, Guangzhou, Guangdong, 510080, Čína.
4. Štátne kľúčové laboratórium bioelektroniky, Kľúčové laboratórium pre biomateriály a zariadenia Jiangsu, Škola biologických vied a lekárskeho inžinierstva, Juhovýchodná univerzita, Nanjing, Čína.
5. Kľúčové laboratórium prevencie a manažmentu chronického ochorenia obličiek v meste Zhanjiang, Inštitút nefrológie, pridružená nemocnica lekárskej univerzity Guangdong, Zhanjiang, Guangdong, 524001, Čína.
6. Národná klinická výskumná základňa tradičnej čínskej medicíny, pridružená nemocnica tradičnej čínskej medicíny Juhozápadnej lekárskej univerzity, Luzhou, Sichuan, 646000, Čína.
7. Spoločné výskumné laboratórium imunologických a genetických ochorení obličiek Provinčnej ľudovej nemocnice CUHK-Guangdong, Čínska univerzita v Hong Kongu, Hong Kong, 999077, Čína.
