Časť Ⅱ: Nadmerná expresia PKD1 spôsobuje polycystické ochorenie obličiek

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Caroline Thivierge, Almira Kurbegovic, Martin Couillard, Richard Guillaume, Olivier Coté a Marie Trudel

Základné patogenetické mechanizmyautozomálne dominantné polycystické ochorenie obličiek(ADPKD) je potrebné ešte objasniť. Hoci existujú dôkazy, že PKD1 (polycystická choroba obličiek 1) génová haploinsuficiencia a strata heterozygotnosti môže spôsobiť tvorbu cýst u myší, paradoxne vysoké hladiny PKD1 (polycystická choroba obličiek 1) expresia bola detegovaná v obličkách pacientov s ADPKD (autozomálne dominantné polycystické ochorenie obličiek). Ak chcete zistiť, či PKD1 (polycystická choroba obličiek 1) získanie funkcie môže byť patogenetický proces, PKD1 (polycystická choroba obličiek 1) bakteriálny umelý chromozóm PKD1 (polycystická choroba obličiek 1)-BAC) bol modifikovaný homológnou rekombináciou, aby sa zameral výlučne na predĺženú PKD1 (polycystická choroba obličiek 1) expresiu prednostne do dospelých obličiek. Vytvorilo sa niekoľko transgénnych línií, ktoré špecificky nadmerne exprimovali PKD1 (polycystická choroba obličiek 1) transgén v obličkách 2- až 15-násobne vyšší ako PKD1 (polycystické ochorenie obličiek1) endogénne hladiny. U všetkých transgénnych myší sa reprodukovateľne vyvinuli tubulárne a glomerulárne cysty a renálna insuficiencia a zomreli na zlyhanie obličiek. Tento model demonštruje, že nadmerná expresia PKD1 divokého typu (polycystická choroba obličiek 1) samotný postačuje na spustenie cystogenézy pripomínajúcej ľudskú ADPKD (autozomálne dominantnépolycystické ochorenie obličiek). Naše výsledky tiež odhalili nápadne zvýšenú renálnu expresiu c-Myc u myší zo všetkých transgénnych línií, čo naznačuje, že c-Myc je kritickým in vivo downstream efektorom PKD1 (polycystická choroba obličiek 1) molekulárna dráha. Táto štúdia priniesla nielen neoceniteľnú a prvú PKD（polycystické ochorenie obličiek）model na vyhodnotenie molekulárnej patogenézy a terapií, ale tiež poskytuje dôkaz, že zisk funkcie by mohol byť patogenetickým mechanizmom pri ADPKD (autozomálne dominantné polycystické ochorenie obličiek).

Cistanche lieči ochorenie obličiek

KLIKNITE SEM PRE PARTNERSTVO Ⅰ

VÝSLEDKY

Výroba PKD1 (polycystická choroba obličiek 1)-Ac-BAC homológnou rekombináciou. Ak chcete zistiť, či PKD1 (polycystická choroba obličiek 1) samotný zisk funkcie je dostatočný na produkciu fenotypu ADPKD (autozomálne dominantné polycystické ochorenie obličiek), najprv sme izolovali genómový klon obsahujúci celý PKD1 (polycystická choroba obličiek 1) gén v knižnici BAC vektora 129/Sv. Táto knižnica bola skrínovaná pomocou PCR s dvoma sadami primérov pre PKD1 (polycystická choroba obličiek 1) gén, ktorý preklenul exón 1 na 5' konci a exóny 39 až 40 smerom k 3' koncu (obr. 1). Pozitívny klon BAC pre PKD1 (polycystická choroba obličiek 1) bol identifikovaný gén, ktorý zahŕňal celé susedné telo génu Tsc2. Inzert PKD1 (polycystická choroba obličiek 1) bol podrobne charakterizovaný, aby sa zabezpečilo, že štruktúra genómu zodpovedá štruktúre endogénneho PKD1 (polycystické ochorenie obličiek1) gén myšacieho kmeňa 129/Sv, z ktorého bol inzert odvodený, a z inbredného kmeňa C57BL/6J. Genomické mapy PKD1 (polycystická choroba obličiek 1) lokus v BAC a v týchto inbredných kmeňoch analýzou Southern blot, so štyrmi štiepeniami reštrikčnými enzýmami a siedmimi sondami pokrývajúcimi celú PKD1 (polycystická choroba obličiek 1) gén sa javil identický bez dôkazu preskupení (obr. 1). Tento BAC obsahoval -121-kb inzert vrátane ~37 kb upstream a -39 kb downstream sekvencie PKD1 (polycystické ochorenie obličiek1) gén stanovený elektroforézou a sekvenovaním.

Obr. 2.Produkcia SBPkdlrAc konštruktov a transgénnych myší. (a) Na myšacom Pkdl-BAC sa uskutočnili postupné homológne rekombinácie, aby sa zaviedli dve modifikácie: regulačné prvky SB vložené bezprostredne pred iniciačný kodón Pkdl a tichá bodová mutácia EcoRI (RI*) zavedená do exónu (ex) 10. Rekombinačný vektor BAC obsahuje počiatok replikácie R6Ky, gén rezistentný na ampicilín, gén SacB, gén RecA a jedinečné klonovacie miesto Smal, v ktorom boli klonované regulačné prvky "SB" (alebo mutácia tichého bodu exónu 10). s lemujúcimi ramenami génu Pkd1. BAC rekombinantný vektor bol elektroporovaný do E, coli (DH10B) buniek obsahujúcich Pkdl-BAC divokého typu a po selekcii došlo k prvej homológnej rekombinácii prostredníctvom jedného z dvoch ramien Pkdl za vzniku kointegrátov BAC. Rekombinačný vektor a duplikované oblasti Pkdl kointegrátov BAC boli eliminované v druhom selekčnom kroku. Vyriešené Pkdl-BAC sa môžu buď vrátiť na divoký typ alebo zahŕňať zamýšľanú modifikáciu. Potom sa môže zaviesť následná homológna rekombinácia do novo modifikovaného BAC. (b) (inénomc DNA z SBPkd l-etransgénnej mxce bola anakZovaná pomocou Southern blot. AVicToiD1ecLon linearizovaných fragmentov spôsobilo inzerciu transgénu do hlavy proti hlave. 5'koniec sa analyzoval štiepením genómovej DNA s HindIII a hybridizoval so špecifickou transgénovou sondou SB (ľavý panel). Všetky tri transgénne myšacie línie generovali očakávaných 10 .9-kb pás pre inzerciu od hlavy k chvostu; ďalší pás pozorovaný v línii 39 s najväčšou pravdepodobnosťou predstavuje spojovací fragment medzi SB a myším genómom. Vnútorná integrita transgénu bola monitorovaná niekoľkými štiepeniami reštrikčnými enzýmami a je zobrazený jeden reprezentatívny blot genómovej DNA štiepenej EcoRI a hybridizovanej so sondou Pkdl (exón 7-15) (stredný panel).

Tento SBPKD1 (polycystická choroba obličiek 1)-BAC klon bol modifikovaný dvoma po sebe nasledujúcimi homologickými rekombináciami v E. coli. Gén PKD1 (polycystická choroba obličiek 1) bol označený v exóne 10 substitúciou nukleotidu (G za A), aby sa vytvorilo nové miesto EcoRI v polohe 2355 na mape cDNA. Táto tichá bodová mutácia bola vytvorená na rozlíšenie PKD1 (polycystická choroba obličiek 1) gén a transkript BAC z génu endogénneho pôvodu. Okrem toho sme nahradili 5'regulačné prvky PKD1 (polycystická choroba obličiek 1)-BAC gén využívaním predtým identifikovaných „SB“ renálnych epiteliálnych špecifických prvkov z SBM (spojeného s c-Myc) alebo SBF spojeného s c-fos) konštrukt-trans-génu na obmedzenie expresie na obličky (36, 38) (obr. 2a).

Tento nový SBPkdlrAG-BAC bol štiepený NotL, jedinečným miestom umiestneným bezprostredne pred prvkami SB a Clal v tele génu Tsc2, čím sa skrátili regulačné prvky Tsc2 a 5' polovica tela génu, aby sa zabezpečil nedostatok T'sc2. exogénnu expresiu vo všetkých tkanivách a na odstránenie prokaryotických vektorových sekvencií BAC (obr. 1 a 2). Tento 70-kb NotI-ClaI linearizovaný fragment bol izolovaný, purifikovaný. a kvantifikované pre mikroinjekciu oocytov (36).

CISTANCHE BENEFIT: LIEČBA OCHORENÍ OBLIČIEK

Produkcia a analýza SBPkdl-ac transgénnych myší. Štyria transgénni zakladatelia nesúci niekoľko kópií transgénu SBPkdlrAc konzistentne vyvinuli PKD. Zo štyroch SBPKD1 (polycystická choroba obličiek 1)RAC zakladajúce myši určené Southern analýzou, tri SBPKD1 (polycystická choroba obličiek 1) TAG transgénne línie boli založené s dvoma až deviatimi kópiami transgénu (obr. 2b). Charakterizácia integrity transgénu v týchto líniách bola monitorovaná 5', internými a 3' sondami, ako je znázornené na reprezentatívnych príkladoch na obr. 2b. Transgénne línie odhalili pomocou 5'"SB" sondy pás s veľkosťou 10,9 kb konzistentný s SBPkdlrAc trans-gén je integrovaný v orientácii hlava-chvost a pomocou 3' sondy je odhalený 7{12}}kb pás (obr. 2b). Okrem toho interná sonda detegovala 9,{15}}kb endogénny pás PKD1 (polycystická choroba obličiek 1), ako aj 6,{19}}kb a 2,0{21}}kb pásy transgénu v dôsledku miesta inzercie EcoRI v exóne 10 (obr. 2b). Tieto myši obsahovali úplné kópie transgénu na základe analýzy genómovej prekrývajúcej sa štruktúry.

PKD1 (polycystická choroba obličiek 1)získanie funkcie u dospelých transgénnych myší SBPkdl-Ac. Expresia SBPkdl-AG. transgén a PKD1 (polycystická choroba obličiek 1) gén bol skúmaný v rôznych orgánoch. Kvantifikácia hladín transkriptov z transgénu a/alebo endogénneho génu sa uskutočnila analýzou Northern blot (obr. 3a). Ako sa očakávalo, transgénové a endogénne génové transkripty mali podobnú dĺžku (14,2 kb). Na základe kontrolnej expresie GAPDH mali obličky zo všetkých myších línií SBPkd 1 A konzistentne zvýšenú expresiu transkriptu v porovnaní s normálnou PKD1 (polycystická choroba obličiek 1) hladiny v obličkách dospelých (n=3) podobného veku. Renálny transgén a endogénna expresia pre rôzne transgénne línie vykazovali rozsah 2- až 15--násobok nad kontrolnou renálnou endogénnou PKD1(polycystická choroba obličiek 1)hladiny (obr. 3a). Najmä transgénna línia39(n=4) vykazovala vyššiu PKD1 (polycystická choroba obličiek 1) úrovne ako riadky 3 (n=3) a 41 (n=4). Okrem toho PKD1 (polycystická choroba obličiek 1Hladiny expresie merané analýzou Northern blot korelovali s hladinami získanými pomocou PCR v reálnom čase s použitím primérov v exónoch 1 a 2 (obr. 3b).

Obr.3.Analýza renálnej expresie myší SBPkdlrA. ( a ) Analýza expresie Pkd1 endogénnych (endo) a transkriptov transgénu SBPkdlrA (Tg) v obličkách z troch transgénnych línií pomocou Northern blottingu. Dve vzorky z každej transgénnej línie, 3, 39 a 41, sa porovnali s endogénnym renálnym Pkdl transkriptom normálnych kontrolných myší rovnakého veku z rovnakého genetického pozadia (C5BI 6I × CBA/DE, vzorky obličkovej RNA boli získané z transgénnych myší pred terminálne štádium ochorenia obličiek. Transkripty z endo a Tg majú dĺžku -14,2 kb. Systematická nadmerná expresia transkriptov bola pozorovaná v obličkách všetkých transgénnych myší v porovnaní s netransgénnymi kontrolami. GAPDH sa použil ako vnútorná kontrola Kvantifikácia renálnej expresie u týchto transgénnych myší sa pohybovala od 2- do 15-násobku vzhľadom na endogénne hladiny Pkd1 z kontrolných myší, ktoré boli ľubovoľne nastavené na 1. (b) Schematické znázornenie SBPkdl-transgénu a primerov bolo použitý na amplifikáciu celkového Pkdl vrátane endogénneho a transgénu (exón 1 a exón 2) a iba transgén Pkd1 (B. exón 2) pomocou PCR v reálnom čase a semikvantitatívnej RT-PCR, analýza RT-PCR expresie transgénu SBPkdlAc bola kvantifikovaná v obličkách a navyše obličkové tkanivá. Je ukázané reprezentatívne semikvantitatívne hodnotenie SBPkdl.Ac transgénu (Tg), ktoré zahŕňa vzorku obličkového tkaniva (K) od jednej myši zo všetkých troch transgénnych línií (3. 39 a 41) a extrarenálnych tkanív. H, srdce; Lu, pľúca; B. mozog; Li, pečeň; a S. slezina z myši línie 39. Expresia transgénu je ľahko detegovateľná v obličkách všetkých transgénnych myší, zatiaľ čo v extrarenálnych tkanivách je nízka až nedetegovateľná. Expresia z transgénu SBPkd1rAc vytvorila špecifický 307-bp amplikón, zatiaľ čo vnútorná kontrola S16 vytvorila 102-bp amplikón. M,100-značka bp; H, O, negatívna kontrola pre PCR amplifikáciu. c) Analýza expresie SBPkdlr PCR v reálnom čase. Transgén sa určil z niekoľkých nezávislých myší. Transgén SBPkdl.Ac z troch transgénnych myších línií 3 (n=5), 39(n =7) a 41 (n=5) ukázal, že línie 39 a 41 mali najvyššie hladiny renálnej expresie. Expresia transgénu SBPkdlrAc v extrarenálnych tkanivách od myší (n=3) z troch transgénnych línií bola hodnotená pomocou PCR v reálnom čase. V porovnaní s obličkami každej transgénnej línie (100 percent) analýza extrarenálnych tkanív ukázala, že hladiny expresie transgénov boli v mozgu, srdci, pečeni, pankrease konzistentne nižšie o 10- až 1,000-krát nižšie , slezina a pľúca. (d) Expresia endogénneho génu c-mc v obličkách SBPkdl.Ac semikvantitatívnou RT-PCR. Schematické znázornenie ukazuje priméry použité na amplifikáciu c-Myc. Ako sa očakávalo, expresia c-Myc je minimálna v dospelých netransgénnych obličkách (kontroly). Naopak, zvýšená expresia c-Mye sa detegovala vo všetkých dospelých obličkách SBPkdlrAc troch línií, ako bolo pozorované u dospelých transgénnych obličiek SBM použitých ako pozitívna kontrola. Amplikón c-Myc bol 250 bp; amplikón S16, interná kontrola, bol 102 bp.M,100-bp marker.

Kvantifikácia hladín expresie transgénu sa špecificky uskutočňovala pomocou PCR v reálnom čase a semikvantitatívnej RT-PCR v troch transgénnych líniách v dospelom veku pomocou primérov v 5'netranslatovanej oblasti (B, -globínový promótor) a v exóne 2 PKD1 (polycystická choroba obličiek 1) (obr. 3b). SBPKD1 (polycystická choroba obličiek 1) Expresia RAC u transgénnych myší sa porovnávala s génovým produktom ribozomálneho proteínu S16 ako vnútorným štandardom. Podmienky použité na semikvantitatívnu RT-PCR amplifikáciu boli v lineárnom rozsahu. Expresia transgénu pomocou PCR v reálnom čase a semikvantitatívnej RT-PCR konzistentne a špecificky vykazovala najvyššiu expresiu v obličkách zo všetkých transgénnych línií v porovnaní s inými orgánmi (obr. 3b a c). Hladiny renálnej expresie pre individuálnu vzorku boli reprodukovateľné akoukoľvek z použitých detekčných techník. Najvyššie hladiny PKD1 (polycystická choroba obličiek 1) transgénová renálna expresia sa merala pre línie 39 a 41. Na monitorovanie, či zvýšená expresia PKD1 (polycystická choroba obličiek 1) vyplýva z transgénu alebo endogénneho génu, sa rovnaká skupina myší z troch transgénnych línií porovnávala s renálnou PKD1 ( polycystické ochorenie obličiek 1) expresiu transgénu a pre renálnu PKD1 (polycystické ochorenie obličiek 1) celkovú (transgénnu a endogénnu) expresiu pomocou PCR v reálnom čase. Zaujímavé. riadky 39 a 41 vo vzťahu k riadku 3 ukázali, že zvýšená PKD1 (polycystická choroba obličiek 1) renálna expresia transgénu bola podobná alebo vyššia ako PKD1 (polycystická choroba obličiek 1) celková renálna expresia, čo poukazuje na to, že transgén je špecificky zodpovedný za túto indukovanú expresiu. V rôznych orgánoch (vrátane srdca, pľúc, mozgu, pečene, pankreasu a sleziny) sa SBPKD1 (polycystická choroba obličiek 1) RAC; transgén vykazoval veľmi slabú expresiu, občas detegovanú v slezine a pľúcach, s malou až nedetegovateľnou expresiou v iných orgánoch (obr. 3b). Kvantifikácia pomocou PCR v reálnom čase preukázala 10-až 1,{5}}krát nižšiu úroveň expresie transgénu v extrarenálnych tkanivách v porovnaní s expresiou obličiek (obr. 3c). "SB" regulačné prvky transgénu SBPkdlrAc poskytujú preferenčnú renálnu expresiu; táto konkrétna distribúcia orgánov bola určená aj pri použití v transgénoch spojených s c-Myc (SBM) a c-fos (SBF) (36, 38). c-Mye, downstream efektor PKD1 (polycystická choroba obličiek 1) signálne dráhy u SBPkdlrAc: myši. Aby sme získali prehľad o intracelulárnom patogenetickom mechanizme transgénnych myší SBPkdlrAc, ďalej sme sa snažili monitorovať úroveň renálnej expresie c-MyC na základe nášho predchádzajúceho pozorovania deregulácie c-Myc v obličkách ľudských ADPKD (autozomálne dominantné polycystické ochorenie obličiek) (22). Analýza obličiek bola vykonaná zo všetkých troch transgénnych línií 3(n=4).39(n=7) a 41 (n=4), ako aj kontrol (n {{9 }}). Ako je znázornené na obr. 3d, existuje podstatná expresia endogénneho c-Mye indukovaného u myší SBPkdlrAa v porovnaní s kontrolnými myšami podobného veku. Je zaujímavé, že úroveň expresie c-Myc v niektorých obličkách SBPkdlrAG, najmä v línii 39, dosiahla úrovne porovnateľné s úrovňou pozorovanou v modeli transgénnej myši PKD SBM produkovanej expresiou c-Myc v obličkách.

Renálne anomálie v SBPKD1 (polycystická choroba obličiek 1) ARC mice similar to PKD. To characterize the phenotype caused by the transgene expression, gross and histologic examinations were undertaken on transgenic kidneys. Adult kidneys from all transgenic lines were affected bilaterally. Kidneys contained numerous cortical cysts that varied from microscopic to macroscopic in size (Fig.4a and b). SBPkdlrAc. kidneys were pale, a typical finding in PKD. On histologic examination, all transgenic founder mice and progenies (n = 25;n>6 pre každú líniu) vyvinuté mnohopočetné tubulárne (T) a glomerulárne cysty (G) (obr. 4d, f a g). Cysty boli pozorované v tubuloch z kortikálnych a medulárnych oblastí, ako aj v zberných tubuloch z papily (obr. 4d a e). Transgénne myši vykazovali tubulárnu epiteliálnu hyperpláziu (šípka) zahŕňajúcu cystické aj necystické tubuly a častú hypertrofiu (obr. 4g a h). ale závažnosť sa medzi jednotlivými myšami líšila. Intersticiálna fibróza (F). Často boli pozorované perivaskulárne lymfoidné infiltráty a proteínové odliatky (P) (obr. 4d a e).

Obr

Presnejšie definovať miesto lokalizácie zvýšeného PKD1 (polycystická choroba obličiek 1) expresie v obličkách sme uskutočnili in situ hybridizáciu s použitím predtým použitej exónovej 36-45 sondy (16). Hybridizačný signál bol lokalizovaný špecificky do epitelových buniek lemujúcich cysty a hyperplastické tubuly, ako aj glomerulárne cysty. Okrem toho bol pozorovaný určitý signál nad epitelom necystických alebo mierne rozšírených tubulov, pravdepodobne identifikujúcich tubuly predurčené na budúce cystické zmeny (obr. 4i a j). Renálna histologická analýza sa uskutočnila aj na transgénnych myšiach pri narodení (n=8), 10. deň po narodení (P10)(n=3), P20(n=5), P35(n{ {10}}) a P45(n{12}}) v porovnaní s negatívnymi súrodencami rovnakej vekovej skupiny (n =2 až 4). Je zaujímavé, že všetky novonarodené transgénne myši vykazovali tubulárnu a glomerulárnu dilatáciu v porovnaní s kontrolných negatívnych súrodencov (obr. 4k a 1), čo naznačuje, že renálne anomálie sa začali in utero, ako sa pozorovalo u myší SBM a ADPKD (autozomálne dominantné polycystické ochorenie obličiek) pacientov. Tubulárna a glomerulárna dilatácia sa zväčšovala čo do veľkosti a počtu s postupujúcim vekom. Podľa P35 transgénne myši vykazovali závažnejšiu hyperpláziu a dôkaz glomerulosklerózy. Zmenené renálne fyziologické funkcie u myší SBPkdlrsc. Renálne fyziologické funkcie všetkých transgénnych myší vykazovali vlastnosti podobné PKD, zatiaľ čo u netransgénnych súrodencov sa toto ochorenie nikdy nerozvinulo. V priebehu niekoľkých mesiacov po narodení sa u postihnutých zvierat rozvinula chronická renálna insuficiencia. U týchto zvierat sa monitorovali funkčné parametre obličiek meraním hladín v sére a v moči. dusík močoviny v krvi (BUN) a kreatinín, osmolalita moču, bielkoviny v moči a vylučovanie iónov (tabuľka 1). Všetky myši z troch línií v porovnaní s kontrolami vykazovali koncentračné defekty, čo je bežný nález pri ADPKD (autozomálne dominantné polycystické ochorenie obličiek). a následne vykazovali znížený BUN v moči. koncentrácie kreatinínu, bielkovín a železa. Transgénny SBPKD1 (polycystická choroba obličiek 1)rAc.zakladatelia a potomkovia (n=6) z každej línie sa kvalitatívne monitorovali na proteinúriu vo vzorkách moču pomocou SDS-PAGE (obr. 5). Myši staršie ako 2 mesiace vykazovali neselektívnu proteinúriu, ktorá progredovala s vekom. Okrem toho sa zvýšili hladiny sérového BUN a sérového kreatinínu, čo odhalilo renálnu insuficienciu (tabuľka 2). Pretože chronická renálna insuficiencia bežne vedie k zmenám hematologických parametrov, tieto sa skúmali na SBPkdlAc transgénnych myšiach vo veku 3 až 14 mesiacov (tabuľka 2). Tieto transgénne myši boli anemické, o čom svedčí výrazne znížený počet červených krviniek, pričom hemoglobín a hematokrit dosahovali polovicu normálnych hladín. Ostatné parametre červených krviniek, ako je percento retikulocytov, neboli ovplyvnené, ako sa očakávalo, keď boli vyvolané poruchou obličiek. Tieto zvieratá sústavne umierali na zlyhanie obličiek vo veku -5,9 ± 2,8 mesiaca (n {{12} }) pre transgénnu líniu 39 a v neskoršom veku,-14.6± 3,1 mesiaca (n= 20)a-11.7 ±6,5 mesiaca (n=7) ,pre linky 3 a 41, resp.

ÚČINKY CISTANCHE: LIEČBA OCHORENÍ OBLIČIEK

DISKUSIA

Tu uvádzame izoláciu a charakterizáciu myšieho PKD1 (polycystická choroba obličiek 1)-BAC. Tento PKD1 (polycystická choroba obličiek 1) gén bol označený a regulačné elementy boli nahradené tak, aby sa expresia zacielila špecificky na obličky dvoma po sebe nasledujúcimi homologickými rekombináciami. Transgénne myši produkované týmto novým génom SBPkdlrAG vykazovali 2-až 15-násobné zvýšenie expresie PKD1 (polycystická choroba obličiek 1) a reprodukovateľne sa u nich vyvinuli skoré morfologické zmeny obličiek typické pre PKD. Renálna insuficiencia je zjavná v strednom veku a myši umierajú predčasne na zlyhanie obličiek. Naše výsledky tiež naznačujú, že mechanizmus nadmernej expresie PKD1 (polycystická choroba obličiek 1) zodpovedný za tento fenotyp je sprostredkovaný signalizačnou aktiváciou c-Myc in vivo. Táto štúdia demonštruje, že zvýšenie funkcie myšej PKD1 (polycystická choroba obličiek 1) v obličkách je dostatočné na vytvorenie renálneho fenotypu PKD.

Keďže myšacia PKD1 (polycystická choroba obličiek 1) gén nie je duplikovaný ako u ľudí (27), priamo sme identifikovali a izolovali klon BAC, ktorý obsahoval celý PKD1 (polycystická choroba obličiek 1) gén. Kompletná charakterizácia 129/Sv myšacej PKD1 (polycystická choroba obličiek 1)-BAC. nepriame porovnanie s dvoma ďalšími inbrednými kmeňmi myší potvrdilo integritu lokusu PKD1 (polycystická choroba obličiek 1). PKD1 (polycystická choroba obličiek 1)-BACinsert obsahoval-37 až 39 kb upstream a downstream sekvencií od génu PKD1 (polycystická choroba obličiek 1). Naša analýza ukázala, že PKD1 (polycystická choroba obličiek 1) gén v tomto BAC bol bona fide myší lokus divokého typu, ktorý by mohol slúžiť na ďalšie štúdie.

Aj keď existujú silné dôkazy, že tvorba cýst pri ADPKD (autozomálne dominantné polycystické ochorenie obličiek) môže byť výsledkom straty heterozygotnosti po somatickej inaktivácii normálnej PKD1 (polycystická choroba obličiek 1) alely (3.21.32), existujú aj náznaky trvalej alebo dokonca zvýšenej expresie polycystínu-1 v cystickom tubulárnom epiteli (22.29). Posledné pozorovanie vyvoláva otázku, či nadmerná expresia PKD1 (polycystická choroba obličiek 1) ako taká je dostatočnou blízkou príčinou cystogenézy. U transgénnych myší nesúcich ľudský PKD1 (polycystická choroba obličiek 1), TSC2. RAB26. V génoch NTHL1 a SLC9A3R2 sa cysty vyvinuli iba u menšiny myší a žiadna z nich nemala detekovateľnú expresiu transgénu v dospelosti napriek 30 kópiám transgénu (31). U tých transgénnych myší. bolo ťažké stanoviť jasnú úlohu nadmernej expresie PKD1 (polycystická choroba obličiek 1) v cystogenéze. Náš model sa líši, pretože dve až deväť kópií divokého typu samotnej PKD1 (polycystická choroba obličiek 1) bez priľahlých génov bolo integrovaných do transgénnych myší. Keďže gén PKD1 (polycystická choroba obličiek 1) má základné funkcie v rôznych orgánoch alebo tkanivách, ako je opísané u mnohých myší s abláciou génu PKD1 (polycystická choroba obličiek 1), systémová nadmerná expresia PKD1 (polycystická choroba obličiek 1) môže viesť k ďalším mätúcim účinkom. Následne sme sa zaoberali úlohou PKD1 (polycystická choroba obličiek 1)získanie funkcie pomocou prístupu, ktorý sa zameriava na PKD1 (polycystická choroba obličiek 1) špecificky na obličky. Homológnou rekombináciou sme najprv nahradili PKD1 (polycystická choroba obličiek 1) upstream regulačnú oblasť s "SB" obličkami obmedzenými regulačnými prvkami, čím sme zabránili zníženej génovej expresii, ktorá sa normálne pozoruje pre PKD1 (polycystická choroba obličiek 1)v dospelosti, ako aj potenciálnu sekundárnu reguláciu slučky spätnej väzby(36,38). Po druhé, označili sme myšaciu PKD1 (polycystická choroba obličiek 1) transgén (Pkdlr) s tichou bodovou mutáciou v exóne 10, ale nevložil epitopovú značku, aby sa zabezpečilo, že sa vytvorí plne funkčný proteín "divokého typu" so zachovanou štruktúrou a integritou. Z tohto modifikovaného BAC bol fragment SBPkdlrAG purifikovaný preč z génu Tsc2 a vektora BAC, aby sa zabránilo interferencii génu Tsc2, ktorý môže tiež indukovať cystický fenotyp (8.20.28). ako aj vyhnúť sa inhibičnému účinku prokaryotických sekvencií(5).

Štyri rôzne zakladajúce myši SBPkdlrActransgenic a tri nezávislé línie boli vytvorené so špecifickým renálnym PKD1 (polycystická choroba obličiek 1)-vylepšený výraz. Zvlášť pozoruhodná je úplná penetrácia fenotypu u týchto transgénnych myší. SBPKD1 (polycystická choroba obličiek 1) Zakladateľské a myšacie línie rAc zdieľali niekoľko fyziopatologických znakov spoločných s ADPKD (autozomálne dominantné polycystické ochorenie obličiek). Tieto zahŕňajú vývoj cýst v kôre, dreni a glomerulách spolu s epiteliálnou hyperpláziou, intersticiálnou fibrózou a fokálnym intersticiálnym zápalom.

Pretože fenotyp PKD bol konzistentne pozorovaný u všetkých rôznych transgénnych zakladateľských myší a integrácia transgénu do myšacieho genómu je náhodný jav, fenotyp nemôže byť výsledkom účinku chromozomálnej polohy, ale iba zvýšeného PKD1 (polycystická choroba obličiek 1)výraz. V skutočnosti sa ukázalo, že expresia transgénu PKD1 (polycystická choroba obličiek 1) vo všetkých líniách je obmedzená na obličky. ako bolo predtým pozorované pre iné transgény regulované "SB" elementmi (36, 38). Navyše táto zvýšená expresia PKD1 (polycystická choroba obličiek 1) bola spôsobená transgénom a nie nepriamym endogénnym PKD1 (polycystická choroba obličiek 1) aktivácia. Naše výsledky teda poskytujú jasný dôkaz, že zosilnenie funkcie funkčnej PKD1 divokého typu (polycystická choroba obličiek 1) môže produkovať viaceré obličkové cysty. Dôležité je, že tieto postupy SBPKD1 (polycystická choroba obličiek 1) predstavujú prvý myšací model vytvorený jedinou nadmernou expresiou myšacieho ortológu ľudského PKD1 (polycystická choroba obličiek 1) gén.

Myši SBPkdl-Ac demonštrujú, že PKD1 (polycystická choroba obličiek 1)nadmerná expresia je primárnym patogenetickým mechanizmom cystogenézy obličiek. Dôležité je, že najvyššie hladiny expresie transgénu v obličkách zrejme korelujú s progresiou a závažnosťou fenotypu. Zistili sme tiež, že nadmerná expresia PKD1 (polycystická choroba obličiek 1) pri vývoji SBPKD1 (polycystická choroba obličiek 1)-Ac fenotyp pravdepodobne signalizuje aktiváciu c-Myc in vivo. Je možné, že táto aktivácia by mohla byť dokonca priama prostredníctvom polycystínového-1 C-koncového chvosta, ktorý prechádza proteolytickým štiepením a jadrovou translokáciou (7), keďže sa ukázalo, že zvýšená renálna expresia c-Myc u dospelých myší indukuje PKD, by bolo vysoko konzistentné na podporu c-Myc ako hlavného downstream efektora PKD1 (polycystická choroba obličiek 1) signálne dráhy Tento výsledok tiež koreloval s našimi predchádzajúcimi zisteniami o zvýšenej expresii c-Myc v obličkách všetkých analyzovaných ľudských ADPKD (autozomálne dominantné polycystické ochorenie obličiek) (22). Celkovo tieto výsledky naznačujú, že c-Mye je hlavným mediátorom PKD1 (polycystická choroba obličiek 1) cystogenéza.

Naše výsledky z PKD1 (polycystická choroba obličiek 1) model získania funkcie spolu s haploinsuficienciou myšieho PKD1 (polycystická choroba obličiek 1) a stratou funkcie naznačujú, že akýkoľvek PKD1 (polycystická choroba obličiek 1) dysregulácia by mohla viesť k cystogenéze (2.19.23-26.31.40). Závažná nerovnováha PKD1 (polycystická choroba obličiek 1) u myší vyvolaná PKD1 (polycystická choroba obličiek 1) ablácia alebo transgénna nadmerná expresia spôsobili skorý nástup a rýchlu progresiu renálnych cýst a ovplyvnili vysoký podiel tubulov. Naopak, miernejšia PKD1 (polycystická choroba obličiek 1) nerovnováha, ako je haploinsuficiencia, viedla k pomalšej progresii PKD s viac fokálnymi cystami. Zjavný paradoxný vývoj podobného fenotypu prostredníctvom opačnej dysregulácie polycystínu{0}} možno vysvetliť spoločným výsledkom, konkrétne nerovnováhou relatívnej koncentrácie proteínov, ktorá by mohla zmeniť tvorbu alebo funkciu aktívneho polycystínového multiproteínového komplexu. Celkovo naše výsledky a výsledky iných výskumníkov tvrdia, že mechanizmus tvorby cysty pri ADPKD (autozomálne dominantné polycystické ochorenie obličiek) pravdepodobne vzniká z troch patogenetických mechanizmov: zisk funkcie, strata funkcie a účinky dávkovania génov.

Román SBPkdlrAc; myši predstavujú silný model cystogenézy obličiek, ktorý môže poskytnúť hlavné poznatky o patofyziológii PKD, PKD1 (polycystická choroba obličiek 1) dráhy prenosu signálu a interagujúcich partnerov. Štúdium tohto modelu môže tiež viesť k vývoju nových terapeutických stratégií na obnovenie normálnej proteínovej rovnováhy v rámci PKD1 (polycystická choroba obličiek 1) multimérny komplex.

Cistanche lieči ochorenie obličiek a zlepšuje funkciu obličiek

LITERATÚRA

1. Blouin, MJ, H.Beachemin, A Wright, ME. De Paepe, M. Surrette, AM. Beau. B. Nakamoto, CN. Ou, G. Stamatoyannopoulos a M. Trudel. 2000. Genetická korekcia kosáčikovitej anémie: pohľady pomocou modelov transgénnych myší Nat. Stred.{4}}.

2 Boulter, C, S. Mulroy, S. Webb, S. Fleming, K. Brindle a R. Sandford. 2001.Kardiovaskulárne, kostrové. a renálne defekty u myší s cieleným narušením PKD1 (polycystická choroba obličiek 1)gén. Proc. Natl.Acad. Sci. USA 9812174-12179.

3. Brasier, JL a EPHenske. 1997. Stratapolycystické ochorenie obličiek(PKD1）oblasť chromozómu 1φp13 v obličkovej cystickej bunke podporuje model straty funkcie pre patogenézu cysty. J. Clin. Investig.99:194-199.

4. Burn, TC, TD Connars, W. R. Dackowski, LR.Petry, TJVan Raay, JMMilhalland, M. Venet, G. Milker, R ML Hakim,G. ML Landes,KW Klinger,F. Qiam, LF. Onuchic, T. Watnick GGGermino a N. A Doggett. 1995. Analytická sis genómovej sekvencieautozomálne dominantné polycystické ochorenie obličiekgén predpovedá prítomnosť opakovania bohatého na leucín. Hum Mol, Genet.{1}}.

5. Chada, K, J.Magram, K. Raphael, G.Radice, E. Lacy a F.Costantini. 1985. Špecifická expresia cudzieho -globínového génu v erytroidnej bunke transgénnych myší Nature 337-380.

6. Chauvet, V, F. Qian, N. Bought, Y. Cai B. Phakdeekitacharoen, LF. Onuchi, T. Attie-Bitach, L. Guicharnaud, O. Devuryst, GG Germino a M.-C. Gubler.2002.Expresia PKDI a PKD2 transkriptov a proteínov v ľudskom embryu a počas normálneho vývoja obličiek. Am. J.Pathol. 160973-983.

7.Chaurvet,V, X Tian, ​​H.Husson, DH Grimm,T.Wang T.Hiesberger, P. Igarashi, AMBennett, O.braghimov-Beskrovnaya,S.Somlo a MJ Caplan.2004 Mechanické stimuly vyvolávajú štiepenie a jadrové translokácia pobeystínu-1 C konca.J. Cin.Investig 114:1433-1443.

8. Cheadle, JP, MPReeve, JR Sampson a DJ Kwiatkowski 2000. Molekulárny genetický pokrok pri tuberóznej skleróze. Hum. Genet10797-114.

9. Konzorcium, EPKD1993. Identifikácia a charakterizácia génu tuberóznej sklerózy na chromozóme 16.Cell75:1305-1315.

10. Konzorcium, EPKD1994polycystická choroba obličiek 1gén kóduje všetko transkribovateľné v duplikovanej oblasti na bunke chromozómu 16 7781-894.

11. Konzorcium, L PK D 1995.Polycystické ochorenie obličiek: kompletná štruktúra PKD1 (polycystické ochorenie obličiek1) gén a jeho proteín. Ce 81:289-298

12. Couillard, M., R. Guilkume, N. Tanj, V. DAgati a M. Trudel. 2002. c-Myc-indukovaná apoptóza vpolycystické ochorenie obličiekje nezávislý od interakcie FasL/Fas. Cancer Res. 62:{1}}.

13. De Paepe, M. Land M Trudy 1904, Model ľudskej kosáčikovitej glomerulopatie. Kidney Int. 46:{3}}.

14. GengL,Y, Segal B.PekseL N.Den Y. Pei, F.Carone, H.G. Rennke, AM Glücksman-Kuis, MCSchneider, M Ericsson, STREeders a J.Zhou. 1996. Identifikácia a lokalizácia polyesteru, PKD1 (polycystická choroba obličiek 1) génový produkt. J. Clin. Vyšetrovať. 98-2674-2682