Nefrotoxický potenciál domnelých 3,5-metabolitov dichlóranilínu (3,5-DCA) a biotransformácie 3,5-DCA v izolovaných obličkových bunkách z potkanov Fischer 344

Ak sa chcete dozvedieť viac, kontaktujte:tina.xiang@wecistanche.com

Abstrakt:Súčasná štúdia bola navrhnutá tak, aby preskúmala in vitro nefrotoxický potenciál štyroch 3,5-dichlóranilín(3,5-DCA)metabolitov(3,5-dichlóracetanilidu,3,5- DCAA;3,5-dichlórfenylhydroxylamín,3,5-DCPHA;2-amino-4,6-dichlórfenol,2-A-4 ,6-DCP;3,5-dichlórnitrobenzén,3,5-DCNB) a určiť renálny metabolizmus 3,5-DCA in vitro. Pri testovaní cytotoxicity,izolované obličkové bunky(IKC) od samcov potkanov Fischer 344 (~4 milióny/ml, 3 ml) boli vystavené metabolitu (0-1,5 mM; až 90 minút) alebo vehikulu. Z týchto metabolitov bol 35-DCPHA najsilnejší nefrotoxický, pričom 35-DCNB bol stredný v nefrotoxickom potenciáli.{8}}A-4,6-DCP a 3,2- {12}}DCAA neboli cytotoxické. V samostatných experimentoch sa 35-cytotoxicita DCNB znížila predbežným ošetrením IKC antioxidantmi a cytochrómom P450, flavínmonooxygenázou a inhibítormi peroxidázy, zatiaľ čo 3,{16}}cytotoxicita DCPHA bola oslabená dvomi nukleofilnýmiantioxidanty(glutatión a N-acetyl-L-cysteín). Inkubácia IKC s 3,5-DCA (0.5-1.0 mm, 90 min) vyprodukovala iba 3,5-DCAA a 3,{{12 }}DCNB ako detegovateľné metabolity. Tieto údaje naznačujú, že 3,5-DCNB a 3,{16}}DCPHA sú potenciálne nefrotoxické metabolity a môžu prispievať k nefrotoxicite vyvolanej 35-DCA in vivo. Okrem toho môžu obličky bioaktivovať3,5-DCNB na toxické metabolity, a 3,5-DCPHA zrejme vytvára reaktívne metabolity, ktoré prispievajú k3,{24}}nefrotoxicite DCA. In vitro sa N-oxidácia 3,5-DCA javí ako primárny mechanizmus bioaktivácie 3,5-DCA na nefrotoxické metabolity.

Kľúčové slová:nefrotoxicita; in vitro; potkan;3,5-dichlóranilín;35-dichlórfenylhydroxylamín;3,5-dichlóracetanilid;2-amino-4,6-dichlórfenol;3,{{ 9}}dichlórnitrobenzén

kliknutím sa dozviete viac informácií.

1. Úvod

Chlóranilíny sú chemické medziprodukty bežne používané vo výrobnom procese mnohých farbív, poľnohospodárskych chemikálií, liekov a priemyselných chemikálií. K expozícii chlóranilínom dochádza v pracovnom prostredí prostredníctvom ich uvoľňovania alebo tvorby počas metabolizmu mnohých zlúčenín [1-3] u cicavcov alebo degradáciou pesticídov v životnom prostredí[1,{2}}]. Detekcia chlóranilínov v ľudskom moči alebo krvi sa použila ako biomarker expozície pesticídom na báze chlóranilínu [7-10]. Toxicita spojená s expozíciou chlóranilínom zahŕňa hematotoxicitu (napr. anémiu alebo methemoglobinémiu)[11-13], splenotoxicitu [11,14], hepatotoxicitu [14-17], narušenie endokrinného systému [18] a nefrotoxicitu [16,19 ,20]. Chlóranilíny sa tiež považujú za prioritné znečisťujúce látky v štúdiách hodnotenia environmentálnych rizík z dôvodu ich potenciálnych nepriaznivých účinkov na zdravie a uvoľňovania po degradácii pesticídov do životného prostredia v poľnohospodárskych oblastiach [21,22].

Spomedzi troch monochlórovaných a šiestich dechlorovaných anilínov je 3,5-dichlóranilín (3,5-DCA) najúčinnejším nefrotoxickým in vivo ain vitro[16,19,23]. In vivo vystavenie 3,{4}}DCA v Sprague-Dawley alebo Fischer, 344 potkanov viedlo k zvýšenej koncentrácii dusíka močoviny v krvi (BUN), zníženiu transportu organických iónov v proximálnych tubulárnych bunkách, zníženiu hmotnosti obličiek, proteinúrii a hematúrii [23,24]. Najzávažnejšie morfologické zmeny sa vyskytujú v renálnych proximálnych tubulárnych bunkách, ale distálne tubulárne bunky a zberné kanáliky sú tiež ovplyvnené 35-expozíciou DCA [23]. Ďalšie štúdie využívajúceizolované obličkové bunky(IKC) od samcov potkanov Fischer 344 preukázali, že koncentrácie 1,{2}} mm alebo vyššie 3,5-DCA počas 90 minút vedú k zvýšenému uvoľňovaniu laktátdehydrogenázy (LDH), čo je miera cytotoxicity [25 ].

Toxicita anilínových zlúčenín in vivo je spôsobená najmä tvorbou toxických metabolitov. Na základe štúdií s anilínom a niektorými jeho chlórovanými derivátmi boli biotransformačné cesty pre tieto anilínové zlúčeniny jasne stanovené a zahŕňajú N-oxidáciu, N-acetyláciu a oxidáciu fenylového kruhu [13, 26-28]. Hoci in vivo metabolizmus 35-DCA nebol podrobne študovaný, tieto biotransformačné dráhy by mohli produkovať množstvo potenciálne toxických metabolitov (obrázok 1), ako je to v prípade iných chlóranilínov, kde sa uskutočnili biotransformačné štúdie [26, 29,30]. Nedávne štúdie od Racine et al. [25] preukázali, že 35-DCA sa metabolizuje na toxické metabolity prostredníctvom množstva obličkových enzýmových systémov. Nie je však jasné, ktoré metabolity sú produkovanéobličky.

Jeden potenciálny 3,5-metabolit DCA,4-amino-2,6-dichlórfenol (4-A-2,6-DCP) , bol hodnotený na nefrotoxický potenciál a je silne nefrotoxický in vivo a in vitro u samcov potkanov Fischer 344 [31-33]. Porovnávacia in vitro štúdia nefrotoxického potenciálu často mono-, di- a trichlórnitrobenzénov v obličkových kortikálnych rezoch zistila, že 3,5-dichlórnitrobenzén (35-DCNB) je najmenej potentný nefrotoxický spomedzi dichlórnitrobenzénov [34] . V súčasnosti neexistujú žiadne štúdie, ktoré by skúmali nefrotoxický potenciál iných predpokladaných 3,5-metabolitov DCA.

Súčasná štúdia bola navrhnutá tak, aby určila nefrotoxický potenciál troch ďalších predpokladaných 3,5-DCA metabolitov, ktoré vznikajú N-acetyláciou, (3,5-dichlóracetanilid;

3.5-DCAA), N-oxidácia (3,5-dichlórfenylhydroxylamín; 35-DCPHA), alebo oxidácia fenylového kruhu (2-amino-4, {{ 8}}dichlórfenol;2-A-4,6-DCP)(obrázok 1) po extrarenálnej biotransformácii 35-DCA. Skúmal sa nefrotoxický potenciál 3,{16}}DCNB v modeli IKC a jeho potenciálny mechanizmus (mechanizmy) bioaktivácie. Okrem toho bol stanovený potenciál voľných radikálov/reaktívnych metabolitov prispievať k 3,{18}}DCPHA cytotoxicite. Nakoniec bola vykonaná biotransformačná štúdia, aby sa zistilo, do akej miery je 3,{20}}DCA biotransformovaná v IKC zo samcov potkanov Fischer 344, a aby sa určilo, ktoré metabolity sa tvoria.

2. Výsledky

2.1. Vzťahy cytotoxicity v čase a koncentrácii pre 35-metabolity DCA

Na stanovenie nefrotoxického potenciálu každého 3 5-domnelého metabolitu DCA sa uskutočnili štúdie koncentrácie a časového priebehu v IKC. Expozícia 3,5-DCAA významne nezvýšila uvoľňovanie LDH, marker cytotoxicity, kedykoľvek (60 alebo 90 min) alebo koncentráciu (0-1). 5 mM) testované (obrázok 2A). Okrem toho expozícia 2-A-4,6-DCP neviedla k významnému zvýšeniu uvoľňovania LDH pri žiadnej testovanej koncentrácii (do 1,5 mM) po 60 alebo 90 minútach expozície ( Obrázok 2B). Inkubácia IKC s 3,5-DCNB alebo 3,5-DCPHA viedla k zvýšeniu uvoľňovania LDH v prípade oboch zlúčenín v závislosti od času a koncentrácie, hoci 35-DCPHA vyvolalo najväčšie zvýšenie uvoľnenie LDH. Významné uvoľňovanie LDH bolo pozorované pri 3,5-koncentráciách DCNB 1,0 alebo 1,5mM alebo vyšších po 90 minútach, ale iba 1,5 mM po 60 minútach (obrázok 2C). Na rozdiel od toho35-DCPHA vyvolal významný nárast pri uvoľňovaní LDH pri 0,25 mM alebo vyššej po 60 a 90 minútach, pričom zvýšenia uvoľňovania LDH pozorované po 90 minútach boli významne zvýšené v porovnaní s príslušnými 60 minútovými zvýšeniami uvoľňovania LDH (obrázok 2D). Preto z testovaných metabolitov boli 35-DCPHA najviac nefrotoxické.

2.2. Renálna biotransformácia a 3,5-cytotoxicita DCNB

Pretože anilíny a nitrobenzény sa môžu navzájom metabolizovať, boli navrhnuté ďalšie štúdie na preskúmanie úlohyrenálna biotransformáciaa voľných radikálov v cytotoxicite po expozícii 1.0 mM 3,5-DCNB počas 60 min. Na určenie potenciálnej úlohy voľných radikálov pri 3,{6}}DCNBcytotoxicite bol IKC vopred ošetrený antioxidantom. Predbežné ošetrenie všetkými antioxidantmi (-tokoferol, glutatión, askorbát a N-acetyl-L-cysteín; obrázok 3) významne zmiernilo 3,5-DCNB-indukovanú cytotoxicitu.

Na preskúmanie úlohy renálnej biotransformácie pri 35-toxicite DCNB v IKC sa použila predúprava inhibítormi cytochrómov P450 (CYPs), monooxygenázy obsahujúce flavín (FMO) a peroxidázy. Použitie inhibítorov CYP (obrázok 4) ukázalo, že dva všeobecné inhibítory CYP (piperonylbutoxid [PiBx]; metyrapón) významne zoslabili 3,5-DCNB cytotoxicitu. Predbežné ošetrenie inhibítormi FMO (n-oktylamin; metimazol) a inhibítorom peroxidázy merkaptosukcinátom významne znížilo 3,{9}}DCBN cytotoxicitu (obrázok 5). Indometacín, ktorý inhibuje peroxidázovú aktivitu cyklooxygenázy, mal tendenciu znižovať uvoľňovanie LDH vyvolané 3,5-DCNB, ale nedosiahol významný rozdiel (obrázok 5).

2.3. Antioxidanty a 3,5-DCPHA Cytotoxicita

Aby sme mohli začať skúmať úlohu voľných radikálov v 35-cytotoxicite indukovanej DCPHA, boli IKC vopred ošetrenéantioxidanty(glutatión, askorbát alebo N-acetyl-L-cysteín) pred vystavením 3,5-DCPHA (0,5 mM). Výsledky ukazujú, že na rozdiel od 3,5-DCNB, 3,{{10}}DCPHA indukovaná cytotoxicita bola čiastočne zoslabená N-acetyl-L-cysteínom a plne chránená glutatiónom (obrázok 6 ).Askorbát (1.{18}} alebo 2,0 mM) nebol účinný pri znižovaní 3,{20}}DCPHA cytotoxicity.

2.4.3,5-DCA Metabolizmus od IKC

Predchádzajúce porovnávacie štúdie cytotoxicity boli navrhnuté tak, aby preskúmali nefrotoxický potenciál predpokladaných 3,5-DCA metabolitov produkovaných externe. Tiež sme skúmali, ako IKC metabolizoval 3,5-DCA, aby sme zistili, ktoré metabolity boli priamo produkované obličkovými bunkami. V týchto experimentoch boli IKC inkubované buď s netoxickou koncentráciou 3, 5-DCA (0,5 mM) alebo cytotoxickou koncentráciou (1.0 mM) počas 90 minút a so vzorkami médií a bunky analyzované pomocou HPLC na 3,{12}}DCA a jej metabolity. Retenčné časy pre 3,5-DCA a jej metabolity, limity detekcie a extrakčné koeficienty sú uvedené v tabuľke 1 pre autentické štandardy 3,5-DCA a každého metabolitu (4-A{{ 19}},6-DCP,2-A-4,6-DCP, 3,5-DCPHA, 3,5-DCAA a 3 ,5-DCNB).

Pri oboch koncentráciách bola hlavnou zlúčeninou v médiu a bunkách na konci inkubačnej doby materská zlúčenina 3, 5-DCA. Menej ako 5 percent z 3,5-DCA sa metabolizovalo na 3,5-DCAA a 3,5-DCNB (tabuľka 2). Neexistoval žiadny dôkaz o tvorbe nekonjugovaných aminochlórfenolových metabolitov 2-A-46-DCP alebo 4-A-2,6-DCP.35-DCPHA sa nezistilo, čo nebolo prekvapujúce vzhľadom na vysoko reaktívnu povahu tohto metabolitu, ale zistenie, že 3,5-DCNB bol prítomný v médiách a bunkách, podporuje záver, že sa vytvoril 3,{19}}DCPHA a potom sa ďalej oxiduje na 3,5-DCNB.

Existovala možnosť, že sa vytvorili aminochlórfenoly, ale metabolizovali sa na sulfátové alebo glukuronidové konjugáty. Aby sa určilo, či sa vytvorili konjugáty, 3,5-DCA (1.0 mM) sa inkuboval s IKC počas 45 alebo 90 minút. Ošetrenie médií alebo bunkových lyzátov arylsulfatázou alebo -glukuronidázou však neodhalilo žiadne voľné 2-A-4,6-DCP alebo 4-A-2,{ {12}}DCP (údaje sa nezobrazujú). Tieto výsledky naznačujú, že tieto dva metabolity sa nevytvorili v detekovateľných hladinách alebo sa ďalej oxidovali na reaktívne metabolity (obrázok 1). Keďže však došlo v podstate k úplnej obnove 35-ekvivalentov DCA, je nepravdepodobné, že by veľmi veľa, ak vôbec nejaké, z týchto metabolitov tvoriliobličkové bunky.

2.5. Účinok kyseliny dietylditiokarbámovej (DEDTCA) na metabolizmus 3,5-DCA

Predchádzajúce štúdie preukázali, že predliečenie IKC inhibítormi CYP2C výrazne znížilo 3,{2}}DCA cytotoxicitu [25]. Jedným z najúčinnejších inhibítorov toxicity 35-DCA bol inhibítor CYP2C DEDTCA. Aby sa zistilo, ako DEDTCA ovplyvnila 3,{7}}metabolizmus DCA, IKC boli vopred ošetrené DEDTCA (0,1 mM) a následne {{10}}DCA (1,0 mM) počas 90 min inkubácia. Stanovenie hladín metabolitu 35-DCA a 3,5-DCA odhalilo, že celková hladina 3,5-DCA v médiách a bunkách bola len mierne zvýšená, zatiaľ čo tvorba 3,{{ 20}}DCAA a 3,5-DCNB boli znížené (tabuľka 3). Nebolo zistené žiadne 2-A-4.6-Zistil sa DCP 4-A-2,6-DCP alebo 3,5-DCPHA, čo súhlasí s predchádzajúcimi štúdiami (tabuľka 2).

3. Diskusia

Dôležitým aspektom tejto štúdie bolo stanovenie nefrotoxického potenciálu predpokladaných externe produkovaných metabolitov 3,5-DCA na obličkových cieľových bunkách. Predpokladá sa, že tieto metabolity sa tvoria na základe metabolizmu anilínu a chlóranilínov (obrázok 1)[13.26,28,29]. Predtým sme vypočítali, že nefrotoxická dávka 3,5-DCA u potkana Fischer 344 by poskytla maximálnu hladinu v krvi ~ 1,25 mM [25]. Koncentrácie metabolitov pod touto koncentráciou by teda mohli byť fyziologicky relevantné. Výsledky súčasnej štúdie ukazujú, že metabolit vznikajúci N-acetyláciou 3,5-DCA, 3,5-DCAA mal značne znížený nefrotoxický potenciál v porovnaní s 3,5-DCA. Tento výsledok nie je prekvapivý a je v súlade s predchádzajúcimi štúdiami s monochlóranilínmi a ich metabolitmi, ktoré ukazujú, že N-acetyláciou vznikajú metabolity chlóracetanilidu so zníženým nefrotoxickým potenciálom v porovnaní s materskou zlúčeninou [35,36]. Zdá sa teda, že N-acetylácia je detoxikačná cesta pre nefrotoxicitu vyvolanú chlóranilínom, vrátane 3,5-DCA. Okrem toho je IKC schopný metabolizovať 3,5-DCA na 3,{{30} }DCAA (tabuľka 2). Ale vzhľadom na slabý nefrotoxický potenciál 3,5-DCAA je nepravdepodobné, že by tento metabolit prispieval k nefrotoxicite indukovanej 35-DCA in vitro.

Na rozdiel od 3,5-DCAA, aspoň jeden metabolit, ktorý je výsledkom oxidácie fenylového kruhu 3,5-DCA, indukuje nefrotoxicitu. Oxidáciou 3,5-DCA v polohe 4- vzniká 4-A-2,6-DCP (obrázok 1), ktorý je silný nefrotoxický in vivo a in vitro [31-33]. In vivo 4-A-2,6-DCP(0,38 mmol/kg,ip) vyvoláva výraznú nefrotoxicitu u samcov potkanov Fischer 344 charakterizovaných proteinúriou, glukozúriou, zvýšenou koncentrácia močovinového dusíka v krvi (BUN) aobličkyhmotnosť a proximálna tubulárna nekróza v segmente S3 [3132]. In vitro,4-A-2,6-DCP znížilo vychytávanie p-aminohippurátu (PAH) a tetraetylamónia (TEA) u potkanaobličkové kortikálne rezypri koncentráciách 5 μM a 50 μM 【31】 a zvýšené uvoľňovanie LDH pri 50 μM alebo vyššej po 2 hodinách expozície 【33】. V IKC sú na zvýšenie uvoľňovania LDH pre 4-A-2,6-DCP potrebné koncentrácie 250 μM alebo vyššie a 90-minútová expozícia. Vyššie koncentrácie potrebné na vyvolanie cytotoxicity v tomto modeli sú s najväčšou pravdepodobnosťou spôsobené prítomnosťou albumínu v inkubačných médiách pre IKC, ale nie v Krebs-Ringerovom roztoku používanom v štúdiách inkubácie rezov obličkovej kôry. V tejto štúdii2-A-4,6-DCP, ktorá je výsledkom oxidácie v 2-polohe 35-DCA, nezvýšila uvoľňovanie LDH pri koncentráciách do 1,5 mM a do 90-násobnej expozície, čo naznačuje, že 4-A-2,6-DCP bol účinnejší ako nefrotoxický ako 2-A-4, 6-DCP. Toto zistenie je v súlade s porovnaním nefrotoxických potenciálov iných 4-amino- a 2-aminofenolov[37,38]. Takže 4-A-2.6-Zdá sa, že DCP s väčšou pravdepodobnosťou ako 2-A-4,6-DCP prispeje k 3,{{38 }} DCA-indukovaná nefrotoxicita in vivo.

V IKC3,5-štúdiách metabolizmu DCA, ani 2-A-4,6-DCA ani 4-A-2,6- DCA boli detegované ako voľné metabolity alebo ako glukuronidové alebo sulfátové konjugáty (tabuľka 2), aj keď je možné, že sa vyprodukovali malé množstvá týchto aminodichlórfenolov, bola úplná regenerácia 3,{10}}DCA pridanej do IKC inkubácie detekovaný ako materská zlúčenina plus ďalšie metabolity (tabuľka 2). Tieto výsledky naznačujú, žeobličkynevytvára dostatok aminodichlórfenolových metabolitov na to, aby prispeli k 3,5-DCA nefrotoxicite in vitro.

Ukázalo sa, že N-oxidácia je dôležitou biotransformačnou dráhou metabolizmu anilínu a chlóranilínu, ktorá môže prispieť k hepatotoxicite a potenciálne ďalším toxicitám vyvolaným týmito zlúčeninami [11, 39-41]. N-oxidáciou anilínu vzniká fenylhydroxylamínový metabolit, ktorý sa ďalej oxiduje na nitrózobenzénový metabolit [39] (obrázok 1). Metabolity fenylhydroxylamínu a nitrózobenzénu môžu redoxný cyklus vytvárať voľné radikály a oxidovať železité železo v hemoglobíne a ďalšie proteíny obsahujúce železnaté železo na železité železo. Tento cyklus premieňa hemoglobín na methemoglobín v erytrocytoch, ale môže tiež ovplyvniť biologickú aktivitu iných proteínov a enzýmov, ktoré na biologickú aktivitu vyžadujú molekulu železnatého železa. Metabolity nitrózobenzénu sú tiež reaktívne a môžu sa kovalentne viazať na nukleofily na makromolekulách v bunke [42,43]. Nitrózoskupina môže byť ďalej oxidovaná za vzniku nitrobenzénových metabolitov (obrázok 1). Predchádzajúce štúdie ukázali, že 3,{11}}DCA môže vyvolať methemoglobinémiu in vivo a že za túto toxicitu je primárne zodpovedný 3,{13}}DCPHA (obrázok 1) [40,44,45]. Tieto zistenia naznačujú, že 3,{19}}DCPHA sa produkuje externe, najpravdepodobnejšie v pečeni, a presúva sa do krvi, aby vyvolal methemoglobinémiu, ako je to pri anilíne [44,45]. Tieto zistenia tiež naznačujú, že oblička je vystavená 3,{23}}DCPHA produkovaným mimo obličky.

Tvorba 3,5-DCNB pomocou IKC (tabuľka 2) ukazuje, že oblička môže tvoriť 3,5-DCPHA z 3,5-DCA. Oblička teda môže byť vystavená 3,{8}}DCPHA z intrarenálnej aj extrarenálnej tvorby.3,5-DCPHA sa ukázal ako najtoxickejší testovaný metabolit a je pravdepodobné, že 3,{ {13}}DCPHA je hlavným prispievateľom k 3,{15}}nefrotoxicite DCA, priamo na obličkové bunky a/alebo nepriamo prostredníctvom hematotoxicity. Je tiež pravdepodobné, že viaceré enzýmové systémy sú schopné tvoriť 35-DCPHA z 3,5-DCA a tieto enzýmové systémy môžu vytvárať aj ďalšie 3,{20}}DCA nefrotoxické metabolity [46, 47]. Ukázalo sa, že N-oxidácia anilínových zlúčenín je katalyzovaná CYP, flavínmonooxygenázami (FMO),

peroxidázy a prostaglandínsyntetázy [48-51]. Predchádzajúce štúdie z nášho laboratória ukázali, že 3,{2}}nefrotoxicita DCA pri IKC môže byť v rôznej miere oslabená inhibítormi týchto rôznych rodín enzýmov [25], čo naznačuje, že inhibícia jednej rodiny enzýmov umožní 35- DCA sa má naďalej bioaktivovať inými metabolizujúcimi enzýmovými systémami. Aby sa určilo, či inhibítory používané Racinom a kol. [25] menili N-oxidáciu 3,5-DCA, skúmala sa schopnosť dietylditiokarbamátu (DEDTCA), inhibítora CYP2C a v menšej miere CYP2E1, znižovať tvorbu DCNB. DEDTCA bola vybraná na štúdiu, pretože výrazne znížila 3,{13}}DCA cytotoxicitu v IKC [25]. Zistenie, že DEDTCA znížila tvorbu 3,5-DCNB v IKC, podporuje záver, že DEDTCA zmiernila 3,{18}}DCA nefrotoxicitu, aspoň čiastočne, inhibíciou N-oxidácie 3,{{21} }DCA. Keďže inhibítor CYP2E1 izoniazid nemal žiadny vplyv na cytotoxicitu 3,5-DCA, zdá sa, že enzýmy CYP2C sú bioaktiváciou 3,5-DCA na toxické metabolity prostredníctvom tvorby 35-DCPHA.

Cytotoxicita môže byť vyvolaná in vitro v IKC pomocou 3,5-DCPHA prostredníctvom dvoch potenciálnych mechanizmov; redoxný cyklus na produkciu voľných radikálov (napr. superoxidový aniónový radikál) a oxidačný stres alebo produkcia alkylačného metabolitu(ov). Racine a kol. [25] zistili, že 3,{4}}DCA-indukovaná cytotoxicita v IKC nebola spôsobená oxidačným stresom. Znížené aj celkové hladiny glutatiónu boli znížené o 3,5-expozíciu DCA, čo naznačuje tvorbu reaktívneho metabolitu. V súčasnej štúdii bola 35-DCPHA cytotoxicita znížená nukleofilnými antioxidantmi (glutatión a N-acetyl-L-cysteín), ale nie nenukleofilným antioxidantom askorbátom (obrázok 6). Tieto výsledky podporujú jeden alebo viacero reaktívnych alkylačných metabolitov 3,5-DCPHA ako cytotoxických druhov.

Chlórované nitrobenzény sú nefrotoxické in vivo a in vitro [34,52,53]. Rickert a Held [3] zistili, že pečeňové mikrozómy samcov potkanov Fischer 344 metabolizovali 3-chlórnitrobenzén redukciou nitroskupiny za vzniku 3-chlóranilínu, čo naznačuje, že metabolizmus medzi 3,{8}}DCA a 3,5-DCNB je reverzibilné. Redukciou 3,5-DCNB teda vznikne 3,5-dichlórnitrózobenzén a 3,{16}}DCPHA, rovnako ako oxidáciou 35-DCA vznikajú tieto dva metabolity. Potenciálny príspevok nefrotoxicity 3,{20}}DCNB k 35-DCA však nebol jasný. Ak bol 35-DCNB nefrotoxický metabolit, nebolo tiež jasné, či bola na produkciu toxických chemických druhov potrebná biotransformácia. Súčasné výsledky podporujú 3,5-DCNB ako toxický3,5-DCA metabolit, ktorý potenciálne prispieva k 3,5-DCA nefrotoxicite po biotransformácii.

Súčasná štúdia ukazuje, že 3,5-DCNB je silnejší nefrotoxický ako 35-DCA v IKC [25]. Okrem toho schopnosť antioxidantov a inhibítorov oxidačnej biotransformácie zoslabiť 3,5-cytotoxicitu DCNB odzrkadľuje účinky týchto predliečieb pri znižovaní cytotoxicity 3,{8}}DCA v IKC [25]. Tieto výsledky naznačujú, že akýkoľvek 3,{11}}DCNB vytvorený počas 35-biotransformácie DCA má potenciál prispieť k 3,{15}}nefrotoxicite DCA prostredníctvom metabolizmu 3,5- DCNB sa konvertuje späť na 3,5-dichlórnitrobenzén a 3,5-DCPHA. Avšak slabá aktivita inhibítorov CYP na 3,{23}}DCNB cytotoxicitu naznačuje, že iné enzýmové systémy (napr. non-CYP nitroreduktáza) môžu byť zodpovedné za redukciu nitroskupiny v tomto modelovom systéme alebo k nej môžu prispieť. . Okrem toho schopnosť antioxidantov výrazne oslabiť 3.5-Cytotoxicita DCNB podporuje úlohu voľných radikálov odvodených od nitroskupiny a/alebo reaktívnych foriem kyslíka/dusíka v nefrotoxickom mechanizme tejto zlúčeniny. Vzhľadom na výrazné zoslabenie 3,5-nefrotoxicity DCNB niektorými inhibítormi oxidačného metabolizmu (napr. n-oktylaminom a merkaptosukcinátom), je nepravdepodobné, že 35-DCNB je priamo toxický pre obličkové bunky, ale produkuje jeho cytotoxicita prostredníctvom metabolitov. Okrem toho in vitro štúdie metabolizmu 3,5-DCA naznačujú, že obličkové bunky nemusia produkovať dostatočné množstvo 3,{35}}DCNB, aby boli zodpovedné za 3,{37}}DCA cytotoxicitu in vitro. Je možné, že extrarenálny metabolizmus 3,5-DCA produkuje dostatok 3,5-DCNB na to, aby prispel k 3,5-DCA-indukovanej nefrotoxicite in vivo, ale celkový príspevok 3,{{ 46}}DCNB až 3,5-nefrotoxicita DCA bude vyžadovať ďalšiu štúdiu.

Stručne povedané, výsledky týchto štúdií naznačujú, že externe generované amino-dichlórfenolové metabolity a metabolity vznikajúce N-oxidáciou majú potenciál prispievať k 3.5-nefrotoxicite DCA in vivo, zatiaľ čo N-acetylácii {{5} }DCA je detoxikačný mechanizmus. In vitro je N-oxidácia 3,5-DCA hlavným mechanizmom bioaktivácie 3,5-DCA na cytotoxické metabolity a toxicita je s najväčšou pravdepodobnosťou sprostredkovaná 3,5-dichlórnitrobenzénom a /alebo 3,5-DCPHA. Okrem toho 3,5-nefrotoxicita vyvolaná DCNB je spôsobená tvorbou metabolitov a nefrotoxicita 3,5-DCNB je tiež s najväčšou pravdepodobnosťou sprostredkovaná 3,5-dichlórnitrobenzénom a/alebo 35-DCPHA.

4. Materiály a metódy

4.1.Zvieratá

Samce potkanov Fischer 344 (200-250 g) boli získané od Hilltop Lab Animals, Inc. (Scotts-dale, PA, USA). Zvieratá umiestnili dva potkany na klietku s potravou a vodou dostupnou ad libitum, s kontrolovanou teplotou (21-23 stupeň), vlhkosťou (40-55 percent) a svetlom (12 hodín zapnuté/12 hodín vypnuté). Pred použitím bolo všetkým zvieratám umožnené aspoň jeden týždeň aklimatizovať sa v akreditovaných zvieracích zariadeniach American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC). Všetky použitia na zvieratách boli schválené Inštitucionálnym výborom pre starostlivosť o zvieratá a ich používanie na Marshallovej univerzite (protokoly 447 (5. augusta 2010) a 531 (1. februára 2013)) a experimenty s použitím zvierat sa uskutočňovali v súlade s Príručkou pre starostlivosť a používanie laboratórnych zvierat , ktorú prijal Štátny zdravotný ústav.

4.2. Chemikálie

Všetky chemikálie boli zakúpené v najvyššej dostupnej čistote od Fischer Scientific (Pittsburgh, PA, USA) alebo Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA), okrem 3,5-dichlórfenylhydroxylamínu(3,{{3} }DCPHA), 35-dichlóracetanilid (3.5-DCAA) a 2-amino-4,6-dichlórfenol (2-A{{11 }},6-DCP), ktoré boli syntetizované v našom laboratóriu. 3,5-DCPHA sa syntetizoval redukciou 3,{16}}DCNB s použitím hydrazínu-paládia na uhlíku pomocou skôr opísanej metódy Rondestvedta a Johnsona [54] a purifikoval, ako opísali Valentovic et al. [55]. Syntéza a purifikácia 3,5-DCAA sa uskutočnila použitím metódy Newell et al. [56]reakciou rovnakých množstiev 3,5-dichlóranilínu a acetanhydridu v prítomnosti octanu sodného. Na prípravu 2-A-4,6-DCP,2,4-dichlórfenolu sa nitroval pomocou metódy McMillana a kol.[29,57], po ktorej nasledovala redukcia nitroskupiny skupiny na aminoskupinu s hydrosiričitanom sodným v 10% vodnom hydroxide sodnom podľa Newell et al. [56].

4.3. Príprava a liečba izolovaných obličkových buniek

Izolované obličkové bunky(IKC) sa získali od neliečených samcov potkanov Fischer 344. Samce potkanov Fischer 344 boli vybrané ako model na získanie izolovaných obličkových buniek, keďže väčšina našich predchádzajúcich údajov o toxicite s 3,{3}}DCA bola získaná v tomto modeli. Potkany boli anestetizované pentobarbitalom (75 mg/kg, ip) a IKC bol pripravený metódou podľa Jonesa a kol.[58]. použitím perfúzie kolagenázy, ako je opísané v Racine et al. [25]. Obličkové bunky izolované touto technikou sú obohatené o renálne kortikálne bunky na základe biochemickej charakterizácie a často sa používajú pri hodnotení renálnej toxikológie [59-63]. Počiatočná životaschopnosť buniek bola stanovená ako ~85-90 percent uvoľnením laktátdehydrogenázy (LDH) a vylúčením trypánovej modrej (2 percentá w/o). Pred inkubáciou sa IKC spočítali a resuspendovali v Krebs-Henseleitovom pufri (pH 7,37; 25 mM Hepes; 2 % w/o albumínu hovädzieho séra) v koncentrácii ~4,2 milióna buniek/ml. IKC (3 ml) sa predinkubovali v 25 ml polykarbonátových Erlenmeyerových bankách počas 5 minút pri 37 stupňoch v atmosfére 95 percent kyslíka/5 percent oxidu uhličitého. Po predinkubácii boli bunky vystavené rôznym koncentráciám 3,5-DCNB (0.5-1,5 mM), 3.5-DCAA({{32} }.5-1,5 mM),3.5-dichlórfenylhydroxylamín (3,5-DCPHA;0.{{40}}.{{45 }} mM, 2-A-4,6-DCP （0.5-1,5 mM） alebo vozidlo （30 μl DMSO） do 90 Na konci pridelenej inkubačnej doby sa odobrali vzorky (0,5 ml) na test uvoľňovania LDH, ako už bolo opísané [20,25].

Na určenie úlohyrenálna biotransformáciav 3,5-cytotoxicita DCNB a voľné radikály v35-nefrotoxicite DCPHA, boli IKC vopred ošetrené buď antioxidantom alebo inhibítorom biotransformačných enzýmových systémov (tabuľka 4) alebo vehikulom (30ul DMSO) pred vystavením 1 0mM35-DCNB (60 min) alebo 0,5 mM3,5-DCPHA (60 min). Všetky koncentrácie a časy predúpravyantioxidantyainhibítory obličkových enzýmovboli založené na predtým publikovaných štúdiách [20,25].

4.4. Metabolizmus IKC 3,5-DCA

4.4.1. Inkubácie IKC a izolácia metabolitov

IKC (~4,2 milióna buniek/ml; 3 ml) sa inkubovali s 3,5-DCA (0,5 alebo 1.0mM) v Krebs-Henseleitovom (KH) pufri ( pH 7,4) počas 90 minút v trepacom vodnom kúpeli v atmosfére 95 percent kyslíka/5 percent oxidu uhličitého, ako je opísané vyššie. Koncentrácia 0,5 mM 3,5-DCA je necytotoxická koncentrácia po 90 min, zatiaľ čo koncentrácia 1,5 mM indukuje cytotoxicitu, čo dokazuje zvýšené uvoľňovanie LDH. Na konci inkubačnej doby sa odobrali 1,{30}} ml vzorky a médiá a bunky sa oddelili centrifugáciou. Peletované bunky sa premyli pufrom KH (bez hovädzieho sérového albumínu) a výplach sa pridal do média. Bunky sa lyžovali sonikáciou a proteín sa vyzrážal pridaním metanolu (1,0 ml) ku všetkým vzorkám. Vzorky sa odstredili (3000 g; 10 minút 4 stupne) a supernatant sa prefiltroval cez 0,45u filter injekčnej striekačky a skladoval sa pri -20 stupňoch až do analýzy pomocou HPLC, ako je opísané nižšie.

4.4.2. Stanovenie sulfátových a glukuronidových konjugátov

Aby sa určilo, či sa vytvorili sulfátové alebo glukuronidové konjugáty, v niektorých experimentoch sa médiá a frakcie bunkového supernatantu získané tak, ako je opísané vyššie, ošetrili ß-glukuronidázou (6500 jednotiek/ml, konečná koncentrácia) alebo arylsulfatázou (200 jednotiek/ml, konečná koncentrácia) plus saccaharolaktón (20 mM, konečná koncentrácia) počas 18 hodín (37 stupňov) v 0,1 M acetátovom tlmivom roztoku (pH 5,0), aby sa hydrolyzovali akékoľvek glukuronidové alebo sulfátové konjugáty, ktoré sa vytvorili 26] . Hydrolýza sa zastavila pridaním studeného metanolu (2,4 ml). Frakcie sa potom prefiltrovali a skladovali až do analýzy, ako je opísané vyššie.

4.4.3. Inhibícia metabolizmu CYP2C prostredníctvom DEDCTA

V samostatnom experimente boli bunky vopred ošetrené kyselinou dietylditiokarbamátovou (DEDTCA, 0,1 mM, 30 minútová predbežná úprava), inhibítorom CYP2C, pred pridaním 3,{5}}DCA, aby sa určilo, ktoré metabolity boli znížené pomocou DEDTCA predúprava. Po 90-minútovej inkubačnej dobe boli bunky a médiá ošetrené a uskladnené tak, ako je opísané vyššie, na stanovenie koncentrácií 3,5-DCA a koncentrácií vytvorených 3,{10}}DCA metabolitov.

4.4.4. HPLC Stanovenie metabolitov

Vzorky (75 ul) média a lyzovaný IKC sa analyzovali na Waters Alliance e2695 HPLC systéme (Waters Co., Milford, MA, USA), s použitím Waters 2489 variabilného UV/Vis detektora pri 254 nM. Chromatogramy sa zozbierali a integrovali pomocou softvéru Empower 3 (Waters Co., Milford, MA, USA）. Kolóna Waters X Select HSS T3 C18 （3,5 μm; 4,6×150 mm²） vybavená Waters XSelect HSS T3 Na separáciu zlúčenín bola použitá VanGuard Cartridge (3,5 um; 3,9 x 5 mm2). Mobilná fáza pozostávala z 50:50 metanolu, vody s prietokom 0,75 ml/min. Štandardné krivky limity detekcie a extrakčné koeficienty boli určené pre 3,5-DCA a domnelé metabolity. Extrakčné koeficienty boli stanovené porovnaním integrácie 1,0 mM3,5-DCA alebo vzorky metabolitu, ktorá bola podrobená vzorke spracovanie (t.j. pridanie metanolu a centrifugácia) k nespracovanému 1,0 mM 35-DCA alebo vzorke metabolitu.

4.5. Štatistiky

Údaje sú prezentované ako priemer ± SEM s N z {{0}} samostatných experimentov na zvieratách, s výnimkou N=3 v experimente metabolizmu netoxického 0,5 mM 3,{5}}DCA. Údaje medzi ošetreniami sa analyzovali jednosmernou analýzou rozptylu (ANOVA), po ktorej nasledoval Tukeyov test. Významnosť bola stanovená u p<0.05. a="" power="" analysis="" was="" performed="" with="" g*="" power="" software="" version="" 3.1.9.7="" for="" f="" tests,="" anova="" (repeated="" measures,="" within="" factors)="" with="" effect="" size="" f="0.85," α="" error="" probability="0.05," power(1-β="" error="" probability)="0.8" and="" actual="" power="0.832," which="" determined="" a="" sample="" size="" of="" n="4" was="" sufficient="" with="" a="" 95%="" confidence="">

Autorské príspevky: CRR: prehľad literatúry, vedenie práce, analýza údajov a interpretácia prispeli k napísaniu článku; MAV: experimentálny dizajn a interpretácia údajov, DKA: asistovanie pri vykonávaní práce a príprave príspevku; GOR: prehľad literatúry, experimentálny dizajn, interpretácia údajov, napísal a upravil príspevok. Všetci autori si prečítali publikovanú verziu rukopisu a súhlasili s ňou.

Financovanie: Tento výskum bol čiastočne podporovaný Národným inštitútom všeobecných lekárskych vied Národného inštitútu zdravia pod číslom pridelenia P20GM103434 pre GOR Za obsah sú výlučne zodpovední autori a nemusí nevyhnutne predstavovať oficiálne názory Národných inštitútov zdravia .

Vyhlásenie inštitucionálnej revíznej rady: Všetky použitia na zvieratách boli schválené Inštitucionálnym výborom pre starostlivosť o zvieratá a ich používanie na Marshallovej univerzite (protokoly 447 (5. augusta 2010) a 531 (1. februára 2013)) a experimenty s použitím zvierat sa uskutočnili v súlade s príručkou pre starostlivosť a používanie zvierat. Laboratórne zvieratá, prijaté Štátnym zdravotným ústavom.

Vyhlásenie o dostupnosti údajov: Údaje prezentované v tejto štúdii sú dostupné na požiadanie od príslušného autora.

Konflikt záujmov: Autori nevyhlasujú žiadny konflikt záujmov.

Referencie

1. Aizawa, H. Metabolické mapy pesticídov; Academic Press, Inc.: Londýn, Spojené kráľovstvo, 1989; Zväzok 2.

2. Ehlhardt, WJ Metabolizmus a dispozícia protirakovinovej látky síry u myší, potkanov, opíc a ľudí. Drug Metab. Dispos. 1991, 19, 370-375. [PubMed]

3. Rickert, DD; Held, SD Metabolizmus chlórnitrobenzénov izolovanými potkaními hepatocytmi. Drug Metab. Dispos. 1990, 18, 5-9. [PubMed]

4. Lee, JB; Sohn, HY; Shin, KS; Kim, JS; Jo, MS; Jeon, CP; Jang, JO; Kim, JE; Kwon, GS Mikrobiálna biodegradácia a toxicita vinclozolínu a jeho toxického metabolitu 3,5-dichlóranilínu. J. Microbiol. Biotechnol. 2008, 18, 343–349. [PubMed]

5. Santos, TCR; Rocha, JC; Alonsa, RM; Martinez, E.; Ibanez, C.; Barcelo, D. Rýchla degradácia propanilu v poľných plodinách ryže. Environ. Sci. Technol. 1998, 32, 3479-3484. [CrossRef]

6. Marlett, VL; Martyniuk, CJ Biologické reakcie na fenylmočovinové herbicídy u rýb a obojživelníkov; nové smery pre charakterizáciu mechanizmov toxicity. Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol. 2017, 194, 9.–21. [CrossRef]

7. Lindh, CH; Littorin, M.; Amilon, A.; Jonsson, BA Analýza 3,5-dichlóranilínu ako biomarkeru vinclozolínu a iprodiónu v ľudskom moči pomocou kvapalinovej chromatografie/trojnásobnej kvadrupólovej hmotnostnej spektrometrie. Rapid Commun. hmotnostné spektrum. 2007, 21, 536–542. [CrossRef]

8. Kutting, B.; Goen, T.; Schwegler, U.; Fromme, H.; Uter, W.; Angerer, J.; Drexler, H. Monoarylamíny vo všeobecnej populácii — Prierezová populačná štúdia zahŕňajúca 1004 bavorských subjektov. Int. J. Hyg. Environ. Zdravie 2009, 212, 298–309. [CrossRef]

9. Turci, R.; Barisano, A.; Balducci, C.; Colosio, C.; Minoia, C. Stanovenie dichlóranilínov v ľudskom moči plynovou chromatografiou/hmotnostnou spektrometriou: Validačný protokol a stanovenie referenčných hodnôt v skupine populácie žijúcej v strednom Taliansku. Rapid Commun. hmotnostné spektrum. 2006, 20, 2621–2625. [CrossRef]

10. Vitelli, N.; Chiodini, A.; Colosio, C.; De Paschale, G.; Somaruga, C.; Turci, R.; Minoia, C.; Brambilla, G.; Colombi, A. Profesionálna a environmentálna expozícia anilidovým a dikarboximidovým pesticídom. G. Ital. Med. Lav. Ergon. 2007, 29 (Suppl. 3), 276–277.

11. Chhabra, RS; Thompson, M.; Elwell, MR; Gerken, DK Toxicita p-chlóranilínu u potkanov a myší. Food Chem. Toxicol. 1990, 28, 717-722. [CrossRef]

12. Guilhermino, L.; Soares, AM; Carvalho, AP; Lopes, MC Akútne účinky 3,4-dichlóranilínu na krv samcov potkanov Wistar. Chemosphere 1998, 37, 619-632. [CrossRef]

13. Pizon, AF; Schwartz, AR; Shum, LM; Rittenberger, JC; Dolná, DR; Giannoutsos, S.; Virji, MA; Krasowski, MD Toxikologická laboratórna analýza a vystavenie ľudí p-chlóranilínu. Clin. Toxicol. 2009, 47, 132–136. [CrossRef] [PubMed]

14. Koenig, CM; Beevers, C.; Pant, K.; Young, RR Hodnotenie mutagénneho potenciálu para-chlóranilínu a anilínu v pečeni, slezine a kostnej dreni potkanov Big Blue® s mikronukleárnou analýzou v periférnej krvi. Environ. Mol. Mutagén. 2018, 59, 785–797. [CrossRef] [PubMed]

15. Valentovič, MA; Ball, JG; Anestis, DK; Pivá, KW; Madan, E.; Hubbard, JL; Rankin, GO Akútna renálna a hepatálna toxicita 2-haloanilínov u potkanov Fischer 344. Toxikológia 1992, 75, 121–131. [CrossRef]

16. Valentovič, MA; Ball, JG; Anestis, DK; Rankin, GO Porovnanie in vitro toxicity štruktúrnych izomérov dichlóranilínu. Toxicol. In Vitro 1995, 9, 75–81. [CrossRef]

17. Valentovič, MA; Lo, HH; hnedá, PI; Rankin, GO 3,5-Toxicita dichlóranilínu u potkanov Fischer 344 vopred liečených inhibítormi a induktormi cytochrómu P450. Toxicol. Lett. 1995, 78, 207-214. [CrossRef]

18. Bhuiyan, MNH; Kang, H.; Kim, JH; Kim, S.; Kho, Y.; Choi, K. Endokrinné narušenie niekoľkými anilínovými derivátmi a súvisiacimi mechanizmami v ľudskej nadobličkovej bunkovej línii H295R a dospelých samcoch zebrafish. Ecotoxicol. Environ. Saf. 2019, 180, 326–332. [CrossRef]

19. Hong, SK; Anestis, DK; Henderson, TT; Rankin, GO Haloanilínom indukovaná in vitro nefrotoxicita: Účinky 4-haloanilínov a 3,5-dihalogénanilínov. Toxicol. Lett. 2000, 14, 125–133. [CrossRef]

20. Racine, C.; Ward, D.; Anestis, DK; Ferguson, T.; Preston, D.; Rankin, GO 3,4,5-Trichlóranilínová nefrotoxicita in vitro: Potenciálna úloha voľných radikálov a renálnej biotransformácie. Int. J. Mol. Sci. 2014, 15, 20900–20912. [CrossRef]

21. Boehncke, A.; Kielhorn, J.; Konnecker, G.; Pohlenz-Michel, C.; Mangelsdorfer, I. Stručný dokument medzinárodného hodnotenia chemikálií 48-4-chlóranilín; Svetová zdravotnícka organizácia: Ženeva, Švajčiarsko, 2003.

22. Vangnai, AS; Kataoka, N.; Soonglerdsongpha, S.; Kslsmbaheti, C.; Tajima, T.; Kato, J. Konštrukcia a aplikácia bioreportéra Escherichia coli na detekciu anilínu a chlóranilínu. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2012, 39, 1801–1810. [CrossRef]

23. Lo, HH; hnedá, PI; Rankin, GO Akútna nefrotoxicita vyvolaná izomérnymi dichlóranilínmi u potkanov Fischer 344. Toxikológia 1990, 63, 215–231. [CrossRef]

24. Rankin, GO; Yang, DJ; Teets, VJ; Lo, HH; Brown, PI 3,5-dichlóranilínom indukovaná nefrotoxicita u potkanov Sprague-Dawley. Toxicol. Lett. 1986, 30, 173–179. [CrossRef]

25. Racine, ČR; Ferguson, T.; Preston, D.; Ward, D.; Ball, J.; Anestis, D.; Valentovič, M.; Rankin, GO Úloha biotransformácie a oxidačného stresu pri nefrotoxicite indukovanej 3,5-dichlóranilínom (3,5-DCA) v izolovaných obličkových kortikálnych bunkách samcov potkanov Fischer 344. Toxikológia 2016, 341–343, 47–55. [CrossRef] [PubMed]

26. Hong, SK; Rankin, GO Biotransformácia 2-chlóranilínu u potkana Fischer 344: Identifikácia metabolitov v moči. Xenobiotica 1998, 28, 985-994. [CrossRef] [PubMed]

27. Rankin, GO; Racine, C.; Sweeney, A.; Kraynie, A.; Anestis, DK; Barnett, JB Nefrotoxicita in vitro vyvolaná propanilom. Environ. Toxicol. 2008, 23, 435–442. [CrossRef]