ČASŤ I.: Podávanie synbiotického kmeňa Lactobacillus Bulgaricus 6c3, inulínu a fruktooligosacharidu znižuje koncentrácie indoxylsulfátu a poškodenia obličiek
Mar 23, 2022
ali.ma@wecistanche.com
AlonsoJerez-Morales,JoseS.Merino,Sindy T.Diaz-Castillo & a kol.
1. Úvod
Chronické ochorenie obličiek(CKD) sa považuje za trvalú zmenuobličkaštruktúra, jej funkcia alebo v najťažších prípadoch oboje. CKD priamo ovplyvňuje zdravie a kvalitu života jednotlivca [1,2]. Na fyziologickej úrovni CKD spôsobené často pozorované zmeny sú zvýšené hladiny kreatinínu, cystatínu korureálneho dusíka v sére [2]. Intenzívnejší dohľad a povedomie v populácii zvýšili diagnózy CKD, ktoré napríklad zistili, že táto patológia postihuje 15% populácie USA [3]. Progresia ochorenia, ako aj účinky vyššie uvedených metabolitov majú vážny vplyv na viaceré systémy tela vrátane kardiovaskulárneho a gastrointestinálneho systému, pričom prítomnosť týchto metabolitov je spojená so zvýšenou úmrtnosťou v prvom a ovplyvňujúca asimiláciu, pohyblivosť a priepustnosť v druhom [4,5]. Gastrointestinálne zmeny vyvolávajú zvýšenú absorpciu metabolitov v čreve, čo prispieva k udržaniu systémového zápalu, ktorý zase ovplyvňuje zloženie normálnej mikrobioty a jej metabolické funkcie a môže spôsobiť črevnú dysbiózu [6].
Kliknite na cistanche vedľajšie účinky a Cistanche produkt pre obličky
Súvislosť medzi CKD a črevnou dysbiózou nemusí byť vysvetlená len zmenami v strave, ale okrem toho aj zvýšením pH jasu, sekundárnym k zvýšenej koncentrácii amónia [7]. Pacienti s CKD v konečnom štádiu majú výrazné rozdiely v množstve niekoľkých bakteriálnych taxónov vo svojich výkaloch v porovnaní so zdravými jedincami [8]. Najmä na úrovni bakteriálneho rodu pacienti s CKD vykazujú zvýšenie Enterorhabdus, Blautia, Ruminococcus, Parasutterella, Bacteroides, Clostridium (sensu stricto),Escherichia, Shigella a Allobaculum a pokles Akkermansie, Bifidobacterium, Clostridium IV, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Alkaliphilus a Pseudomonas [9-11]. Buď zlou depuráciou obličiek, alebo črevnou dysbiózou dochádza k poklesu bakteriálnych rodov schopných metabolizovať a inhibovať patogény, ktoré produkujú toxické metabolity, čo vedie k ich zvýšeniu [12]. Wong et al. [8] preukázali, že pacienti trpiaci pokročilou CKD vykazovali nárast bakteriálnych skupín s enzýmami, ako je ureáza, urikóza a pacienti produkujúci p-krezol a indol.
Akumulácia uremických retenčných metabolitov (URM) v krvi, vrátaneindoxylsulfát(IS), p-cresylsulfát (pCS), trietylamín a trimetylamín N-oxid (TMAO)[5] sa predpokladajú ako urýchľovače CKD [13]. JE(Indoxylsulfát), najznámejší uremický indol, je vylučovaný proximálnymi spletitými tubulmiobličkaa pochádza z metabolizmu tryptofánu bakteriálnou tryptofánou. Dôkazy zo zvieracích modelov ukazujú, že IS(Indoxylsulfát)môže ovplyvniť funkciu obličiek a môže poškodiť bunky tubulov, ktoré vytvárajú oxidačný stres v endotelových bunkách, inhibujú opravné mechanizmy a uprednostňujú intersticiálnu rúrkovú fibrózu, pretože zvyšujúgénnu expresiu TGF-1, inhibítora tkaniva metaloproteinázy (TIMP-1) a kolagénu [14]. Napriek tomu sa môže zmeniť nevyváženosť črevnej mikrobioty a sprievodná produkcia toxických metabolitov. Bolo opísané, že suplementácia určitými probiotikami a prebiotikami môže znížiť produkciu určitých uremických toxínov a obnoviť normálnu mikrobiotu[ 5]. Napríklad štúdie metaanalýzy dospeli k záveru, že pacienti s CKD, ktorí dostávali suplementáciu probiotickými kmeňmi, zvýšili svoje protizápalové cy-tokiny a znížili hladinu uremických toxínov [15,16]. Niektoré štúdie uviedli, že podávanie synbiotík, kombinácie probiotík a prebiotík, je schopné znížiť progresiu CKD s priaznivými výsledkami [12]. V kontexte súčasnej práce sú fruktány inulínového typu relevantnými prebiotikami, pretože preukázali svoju schopnosť znižovať progresiu CKD [17] a znižovať URM, ako sú pCS a IS(Indoxylsulfát)[18]. Panza et al. (2017) podala probiotiká L.acidophlilus a Bifidobacterium longum plus fruktooligosacharidy (FOS) u pacientov s štádiom 2- 5 CKD a uviedla, že neliečení pacienti mali výrazne viac pCS a sú(Indoxylsulfát)v krvi ako pacienti, ktorí dostávali synbiotickú liečbu [19]. V tejto práci sme najprv zhodnotili schopnosť probiotických kmeňov znížiť IS(Indoxylsulfát)in vitro vybrať ten najsľubnejší. Potom bol tento kmeň kombinovaný s prebiotikami inulínu a fruktooligosacharidmi (FOS) na získanie domnelého synbiotika. Tieto prebiotiká boli vybrané, pretože ukázali, že môžu znížiť PCS a IS(Indoxylsulfát)koncentrácia v krvi [17,18]. Nakoniec bola účinnosť domnelého synbiotika testovaná in vivo, hodnotiaca krv IS(Indoxylsulfát)a hladiny kreatinínu aobličkaa poškodenie srdca pomocou modelu potkana (potkany Sprague-Dawley) vrátaneobličkanedostatočné (nefrektómia) a neošetrené zvieratá.
2. Výsledky
Izolácia kmeňov schopných znížiť IS(Indoxylsulfát)In Vitro
Z 36 vzoriek mliečnych výrobkov bolo v MRS agare izolovaných 84 kmeňov doplnených bromofenofenolovou modrou (MRS-BFB), ktorá sa používala ako diferenciálne médium. Toto médium umožňuje rozlišovanie baktérií mliečneho kvasenia. Pri pH 3 kolónie budú sfarbené na žlto a pri pH blízko 5 budú sfarbené do modra [19]. Všetkých 84 izolovaných kmeňov bolo testovaných in vitro, aby sa určila ich schopnosť sprostredkovať zníženie IS.(Indoxylsulfát). Na tento účel boli kmene kultivované vo vývare MRS doplnenom o 2,8 mM IS(Indoxylsulfát)za 48 hodín a potom JE(Indoxylsulfát)bola meraná vysoko výkonnou kvapalnou chromatografiou (HPLC). Kmene lc2, 6c3 a VIc2 boli schopné výrazne znížiť (p<0.05) the="" concentration="" of="" the="" compound="" (table="" 1).="" furthermore,="" the="" three="" strains="" were="" cultured="" together="" for="" 48="" h="" in="" the="" presence="" of="">(Indoxylsulfát)vyhodnotiť, či konali synergicky, aby znížili IS(Indoxylsulfát). Keď boli všetky tri kmene kultivované dohromady v prítomnosti IS(Indoxylsulfát), koncentrácia IS(Indoxylsulfát)bola tiež výrazne znížená, ale nižšia ako tá, ktorú dosiahli samotné kmene, pričom sa vylúčila možnosť synergickej činnosti (tabuľka1).
Tabuľka 1.Zníženie in vitro, akindoxylsulfát(IS), je hodnotená vysoko výkonnou kvapalnou chromatografiou (HPLC), sprostredkovanou bakteriálnymi kmeňmi.
2.2. Identifikácia vybraných kmeňov
Tri kmene vybrané kvôli ich schopnosti znížiť IS(Indoxylsulfát)boli identifikované sekvenovaním 16S rRNA po zosilnení DNA PCR. Kmeň 1c2 bol grampozitívny reťazec tvoriaci coccus, ktorý sa v molekulárnej analýze zosilnil pomocou primérov LacZ pre Streptococcus thermophilus. Kmene 6c3 a VIc2 boli grampozitívne bacily a zosilnené primérami LbG na identifikáciu rodu Lactobacillus. Analýza sekvenovania 16SrRNA umožnila identifikovať kmeň lc2 ako Streptococcus thermophilus(97,3% podobnosť; Prístupové číslo: AY188354.1), kmeň 6c3 ako Lactobacillus bulgaricus(podobnosť 99,7%; Prístupové číslo: CR954253) a kmeň VIc2 ako Lactobacillus acidophilus (99,5% podobnosť; Prístupové číslo: AY773947.1). Iba jeden z troch kmeňov bol vybraný na prípravu synbiotika a na pokračovanie nasledujúcich testov. Kmeň Streptococcus thermophilus 1c2 bol zlikvidovaný, pretože vykazoval nízku rýchlosť rastu. Zo zvyšných dvoch kmeňov bol vybraný kmeň Lactobacillus bul-garicus 6c3, pretože vykazoval lepšiu probiotickú funkčnosť a bezpečnostné vlastnosti ako kmeň Lactobacillus acidophilus VIIc2.
2.3. Účinok synbiotika v krvnom kreatiníne a IS(Indoxylsulfát)Úrovne
Probiotikum L. bulgaricus 6c3 bolo lyofilizované v súvislosti s prebiotikami Inulín a FOS, čo je koncentrácia probiotika 10° CFU/g lyofilizovaného produktu. Desať gramov synbiotika sa podávalo denne v pitnej vode skupine nefrektomizovaných synbiotických ošetrených potkanov Sprague-Dawley (Lac). Nefrektomizovaná neliečená skupina (Nef) a nefrektómia kontrolná skupina nedostali syn-biotikum. Kreatinín v sére a IS(Indoxylsulfát)hladiny potkanov boli merané HPLC na začiatku (týždeň po nefrektómii) a na konci testu. Okrem toho boli zaznamenané hematokrity zvierat všetkých skupín. Variácie hladín kreatinínu v sére na konci testu boli výrazne odlišné (p<0.05) in="" the="" nef="" and="" lac="" groups,increasing="" 127%and="" 121%,="" respectively,="" when="" compared="" to="" their="" initial="" values(figure="" 1).="" the="" control="" group="" showed="" a="" non-significant="" creatinine="" increase="" of="" only="" 2%.="" the="" increase="" of="" creatinine="" serum="" levels="" in="" the="" nef="" and="" lac="" groups="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" of="" the="" control="" group="" but="" not="" significantly="" different="" between="" the="" nef="" and="" lac="" groups.="" nevertheless,="" all="" three="" groups="" maintained="" their="" creatinine="" levels="" within="" de="" normal="" limits="" for="" these="" rats.="" on="" the="" other="" hand,="" serum="">(Indoxylsulfát)hladiny sa významne zvýšili len v skupine Nef, ktoré zodpovedajú nefrektomizovaným zvieratám (nedostatok obličiek), ktorým synbiotikum nebolo podávané (38, 8%)(p<0.05).>(Indoxylsulfát)hladiny vykazovali nevýznamný nárast o 0,5 % v kontrolnej skupine a nevýznamný pokles o 0,8 % v skupine Lac (obrázok 2). Keď sa porovnali skupiny nefrektomizovaných zvierat, skupina, ktorá nekonzumovala synbiotikum (Nef), vykazovala výrazne vyššiu úroveň IS.(Indoxylsulfát)v porovnaní so skupinou, ktorá konzumovala synbiotikum (Lac). Medzi skupinou Lac a kontrolnou skupinou nebol žiadny významný rozdiel. Analýza údajov hľadajúcich možnú koreláciu medzi kreatinínom a IS(Indoxylsulfát)úrovne ukázali, že táto korelácia nebola prítomná (doplňujúce materiály: obrázky S1-S3). Nakoniec výsledky hematokritov nepreukázali žiadne významné rozdiely medzi týmito tromi skupinami (obrázok 3).
Obrázok 1. a) Hladiny kreatinínu v sére u potkanov Sprague-Dawley na začiatku a na konci 16-týždňového podávania synbiotika. b) Rozdiely prostriedkov pre konečné koncentrácie kreatinínu s 95% Tukeyho simultánnymi intervalmi spoľahlivosti (Ak interval neobsahuje nulu, zodpovedajúce prostriedky sú výrazne odlišné). Nef: nefrektomizované potkany, ktoré nedostávajú synbiotikum, Lac: nefrektomizované potkany prijímajúce synbiotikum, Kontrola: falošné nefrektomizované potkany.
Obrázok 2.a) Sérumindoxylsulfát(IS) hladiny potkanov Sprague-Dawley na začiatku a na konci 16 týždňov podávania synbiotika. b) Rozdiely v prostriedkoch pre konečné IS(Indoxylsulfát)koncentrácie s 95% Tukeyho simultánnymi intervalmi spoľahlivosti (Ak interval neobsahuje nulu, zodpovedajúce prostriedky sú výrazne odlišné). Nef: nefrektomizované potkany, ktoré nedostávajú synbiotikum, Lac: nefrektomizované potkany prijímajúce synbiotikum, Control:sham-nefrectomized potkany.
2.4.Histologická analýza ukázala, že podávanie sybiotiky znížilo progresiu CKD
Na konci experimentu boli potkany utratené, aby získali vzorky zľava.obličkya srdcia, ktoré sa majú spracovať na histologickú analýzu. Fibrotická oblasť bola určená Massonovou trichrómovou (MT) škvrnou pomocou informačného nástroja Image-Pro Plus 3.0 (Media Cybernetics, Rockville, MD, USA)na výpočet percenta poškodenej (t. j. fibrotickej) oblasti (tabuľka 2) a dvojfotónovou excitačnou mikroskopiou, metódou, ktorá detekuje kolagén emisiami dvojfotónov, čo spôsobuje, že kolagén vytvára druhú harmonickú, ktoré môžu byť vizualizované konfokálnou mikroskopiou, ktorá získa špecifický obraz blízky organizácii a distribúcii kolagénu vo vnútri tkaniva. Pri porovnaní fibrotických oblastí obličiek, hodnotených škvrnou MT, bolo možné pozorovať, že fibrotické oblasti boli o 25% väčšie v skupine Nef, ale len o 12% väčšie v skupine Lac, podávané snbiotikum v porovnaní s falošnými nefrektomizovanými kontrolnými zvieratami. Lézie pozorované pri tomto postupe farbenia boli umiestnené na parietálnej vrstve Bowmanovej kapsuly a suterénnej membráne proximálnych a distálnych spletitých tubulov zvierat skupín Nef a Lac. V prípade skupiny Nef, vrátane zvierat, ktorým nebol podávaný synbiotikum, sa pozorovala strata cytoplazmy buniek spletitých tubulov so súčasným vývojom fibrotického tkaniva. Keď boli tkanivá obličiek analyzované dvojfotónovou excitačnou mikroskopiou, kolagén bol pozorovaný vo všetkých vzorkách s konformitou typu sieťoviny. Skupiny Nef a Lac vykazovali viac lézií ako kontrolná skupina, v ktorej sa našla iba jedna fibrotická oblasť (obrázok 4). V obličkových krvinkách sa nezistili žiadne lézie v žiadnej vzorke, keď sa pozorovali pri dvojfotónovej excitačnej mikroskopii.
Tabuľka 2.Percento fibrotickej oblasti v Massonovom trichróme zafarbenomobličkahistologické úseky. Výsledky sú vyjadrené ako stredná + štandardná chyba.
 |  |
| Obrázok 3.Hematokritové hodnoty potkanov Sprague-Dawley na konci 16-týždňového podávania synbiotika. Nef: nefrektomizované potkany, ktoré nedostávajú synbiotikum, Lac: nefrektomizované potkany prijímajúce synbiotikum, Control:sham-nefrectomized potkany. | Obrázok 4.Histologické časti obličiek potkanov Sprague-Dawley. (A-C): Massonova trichrómovaná škvrna nefrónov. Fibrotické oblasti sú pozorované modrou farbou (šípky). (D-F): rovnaké tkanivo pozorované dvojfotónovou excitačnou mikroskopiou. Fibrotické tkanivo sa pozoruje v zelenej farbe. Nef: nefrektomizované potkany, ktoré nedostávajú synbiotikum, Lac: nefrektomizované potkany prijímajúce synbiotikum, Control:sham-nefrectomized potkany. Stupnicová lišta∶ 100 μum pre(A-C) mikrografy a 50 μm pre (D-F) mikrografy. |
2.5.Podávanie synbiotikum nezľahčilo kardiálnu fibrózu
V srdci škvrna MT ukázala prítomnosť fibrotických oblastí v tkanive nefrektomizovaných potkanov, zatiaľ čo tieto oblasti chýbali u kontrolných zvierat. Indukcia CKD u potkanov vytvára srdcovú fibrózu, ktorej sa nezabránilo podaním synbiotickej liečby u nefrektomizovaných potkanov (obrázok 5).
Obrázok 5.Massonovo trichrómové (MT) zafarbenie srdca potkanov Sprague-Dawley. Fibrotické oblasti sú zafarbené modrou farbou (šípky). Nef: nefrektomizované potkany, ktoré nedostávajú synbiotikum, Lac: nefrektomizované potkany, ktoré dostávajú synbiotikum. Kontrola: falošné-nefrektomizované potkany. Lišta mierky 100 um.
