ČasťⅠ: Tubulárny mitochondriálny AKT1 sa aktivuje počas ischemického reperfúzneho poranenia a má rozhodujúcu úlohu v predispozícii k chronickému ochoreniu obličiek.
Apr 03, 2023
Abstraktné
Renálna tubulárna dysfunkcia môže viesť k akútnemu poškodeniu obličiek a transformácii na chronické ochorenie obličiek. Hoci tubulárne mitochondrie sú spojené s patofyziológiou zlyhania obličiek, mechanizmus je nejasný. Tu demonštrujeme, že ischemicko-reperfúzne poškodenie indukuje akútnu translokáciu a aktiváciu mitochondriálnej proteínkinázy B (tiež známej ako AKT1) v renálnych tubuloch. Predpokladali sme, že mitochondriálna signalizácia AKT1 by mohla zabrániť rozvoju akútneho poškodenia obličiek a následného chronického ochorenia obličiek. Na testovanie tejto predpovede sme použili stratégiu Cre-Lox na vytvorenie dvoch nových kmeňov transgénnych myší špecifických pre obličkové tubuly, ktoré indukovali expresiu buď dominantne negatívneho AKT1 zacieleného na mitochondrie, alebo konštitutívne aktívneho AKT1. u dominantných AKT1-negatívnych myší zacielených na mitochondrie, inhibícia mitochondriálnej AKT1 exacerbovala azotémiu, tubulárne poškodenie, renálnu fibrózu, glomerulosklerózu a prežitie po ischemicko-reperfúznom poškodení negatívne. Na rozdiel od toho, u konštitutívne aktívnych myší AKT1 zacielených na mitochondrie, zvýšená tubulárna mitochondriálna signalizácia AKT1 zoslabila poškodenie obličiek, chránila funkciu obličiek a významne zlepšila prežitie po ischemicko-reperfúznom poškodení (76,9 percent vs. 20,8 percent, v uvedenom poradí). Keď bol mitochondriálny AKT1 inhibovaný, zistilo sa zvýšenie neviazaného mitochondriálneho dýchania a oxidačného stresu v obličkových tubuloch, čo podporuje úlohu mitochondriálnej dysfunkcie v patofyziológii zlyhania obličiek. Naša štúdia teda naznačuje, že tubulárna mitochondriálna signálna dráha AKT1 môže byť novým cieľom pre vývoj nových stratégií na lepšiu prevenciu a liečbu poškodenia obličiek.
Prekladové vyhlásenie
Akútne poškodenie obličiek (AKI) a následný rozvoj chronického ochorenia obličiek (CKD) sú veľké zdravotné problémy. Vyvinuli sme model transgénnej myši a určili sme úlohu aktivácie AKT proximálnych renálnych tubulárnych mitochondrií v AKI a CKD. Tento záchranný mechanizmus ochrany obličiek môže byť novým cieľom pre vývoj nových stratégií na lepšiu prevenciu a liečbu AKI a CKD. Budúce štúdie by mali potvrdiť zapojenie mitochondriálnej signálnej dráhy AKT do poškodenia ľudských obličiek a preskúmať liekové ciele mitochondriálnej dráhy AKT1.
Kľúčové slová
mitochondriálny Akt1; poranenie ischemickej refúzie; akútne poškodenie obličiek; Chronické ochorenie obličiek;Extrakt z cistanche.
Pre získanie kliknite semCistanche prospieva obličkám
Úvod
Akútne poškodenie obličiek (AKI) a následný rozvoj chronického ochorenia obličiek (CKD) sú veľké zdravotné problémy. V súčasnosti sú špecifické lekárske liečby týchto chorobných stavov obmedzené, čiastočne kvôli nedostatočnému pochopeniu molekulárnych mechanizmov, ktoré sú základom poškodenia obličiek. Obličky sú jedným z energeticky najnáročnejších orgánov v tele a mitochondrie, ktoré sú nevyhnutné na uľahčenie aktívneho transportu, udržiavanie správnych elektrochemických gradientov a reguláciu homeostázy tekutín, sú primárnym zdrojom bunkovej produkcie ATP prostredníctvom oxidačnej fosforylácie. poruchy produkcie ATP a mitochondriálna dysfunkcia môžu viesť k zvýšenej produkcii reaktívnych foriem kyslíka (ROS), čo následne zhoršuje funkciu obličkových buniek a vyvoláva bunkovú smrť. Hoci poškodenie a dysfunkcia mitochondrií boli hlásené u pacientov s ochorením obličiek a zvieracích modelov akútneho a chronického poškodenia obličiek, poznatky o patofyziologickej úlohe mitochondrií pri poškodení obličiek zostávajú neúplné.
Zvýšená mitochondriálna funkcia môže zabrániť ischemicko-reperfúznemu poškodeniu (IRI). Počas ischemickej fázy IRI deplécia kyslíka inhibuje prenos elektrónov v mitochondriálnom dýchacom reťazci a znižuje produkciu ATP. Následný prítok sodných iónov a odtok protónov pomáhajú obnoviť normálne pH a môžu podporovať prežitie buniek obnovením vnútrobunkového objemu. Počas reperfúzie je obnovenie prietoku krvi spojené so zvýšenými reaktívnymi formami kyslíka (ROS), Ca2 plus vnútorným prietokom do mitochondrií, stratou mitochondriálne transmembránové elektrochemické gradienty a aktivácia apoptotických dráh Tieto intracelulárne zmeny môžu byť škodlivé pre bunky, ktoré prežijú po počiatočnom ischemickom poškodení.
AKI je bežnejšia u hospitalizovaných pacientov a môže urýchliť nástup nového CKD, exacerbovať existujúce CKD a viesť k renálnej smrti. Mechanizmy, ktoré sú základom prechodu z AKI na CKD, sú nejasné. Nedávne štúdie na zvieratách naznačujú, že renálna tubulárna dysfunkcia hrá dôležitú úlohu v progresii AKI na CKD, čo odráža prechod z AKI na CKD u ľudí. Pochopenie signálnych dráh, ktoré regulujú poškodenie obličiek, nám umožní identifikovať nové terapeutické ciele na zmiernenie poškodenia obličiek a zabránenie progresii AKI na CKD.
Spojenie medzi cytoplazmatickými signálnymi dráhami a mitochondriálnou funkciou počas poškodenia obličiek je do značnej miery neznáme. Mitochondriálna funkcia je úzko spojená s cytoplazmatickou signalizáciou, inými organelami a jadrovými dráhami Naše laboratórium identifikovalo aktiváciu a translokáciu AKT1 do mitochondrií ako kľúčový krok pri ochrane kardiomyocytov pred poškodením IRI reguláciou komplexov oxidačnej fosforylácie, zvýšením účinnosti oxidačnej fosforylácie a zníženie ROS. Nie je však známe, či IRI môže spustiť translokáciu aktivovaného AKT1 z cytoplazmy do mitochondrií v obličkových tubuloch. Ak sa mitochondriálny AKT1 môže aktivovať v renálnych tubuloch v reakcii na poškodenie obličiek, bolo by dôležité posúdiť patofyziologickú úlohu mitochondriálneho AKT1 pri rozvoji akútneho poškodenia obličiek (AKI) a chronického ochorenia obličiek (CKD). Tu sme použili dva indukovateľné renálne tubulárne špecifické transgénne myšacie modely, ktoré modulujú mitochondriálnu signalizáciu AKT1 in vivo a demonštrovali ochrannú úlohu renálnej tubulárnej mitochondriálnej aktivácie AKT1 počas IRI proti AKI a následnému vývoju CKD.
Doplnky Cistanche
Výsledky
Aktivácia mitochondriálneho AKT1 v obličkových tubuloch po IRI
Najprv sme skúmali, či IRI aktivuje AKT1 v renálnych mitochondriách. Na tento účel sme vytvorili model IRI obličiek podviazaním ľavej renálnej artérie počas 30 minút, po ktorej nasledovala kontralaterálna nefrektómia (Nx). Podviazanie ľavej renálnej artérie sa obrátilo, aby sa ukončila ischemická fáza, uskutočnila sa reperfúzia a ľavá oblička sa odobrala v uvedenom časovom intervale.
Renálna kôra obohatená o renálne tubuly bola izolovaná a mitochondrie boli pripravené subfrakcionáciou. Po reperfúzii sa zvýšilo množstvo mitochondriálnych pAKT1 a AKT1, čo naznačuje translokáciu aktivovaného AKT1 do mitochondrií (obrázok 1A). Je to podobné tomu, čo sme pozorovali v myokarde v porovnaní s falošne operovanými kontrolami alebo kontrolami resekovanej obličky, kde bol mitochondriálny AKT1 významne zvýšený 30-60 minút po reperfúzii (obrázok 1A a B) (n{8}}). Mitochondriálny pAKT1 bol tiež zvýšený. Tieto výsledky naznačujú, že IRI-indukovaná aktivácia a translokácia AKT1 do renálnych mitochondrií. Farbenie iHC potvrdilo fosforyláciu AKT1 v renálnych tubuloch po IRI (obrázok 1C). Farbenie pozadia pre pAKT1 bolo minimálne v renálnych tubuloch falošne operovaných kontrol, zatiaľ čo pAKT1 bol dramaticky zvýšený v renálnych tubuloch po IRI (obrázky 1C a 1D). Žiadny pAKT1 nebol pozorovaný v žiadnej obličkovej oblasti okrem tubulov. na potvrdenie subcelulárnej lokalizácie pAKT1 v tubuloch sa pAKT1 zafarbil v kombinácii s mitochondriálnymi markermi. významná ko-lokalizácia pAKT1 a mitochondrií bola pozorovaná v renálnych tubulárnych bunkách na IRI (obrázok 1E). Tieto výsledky spolu naznačujú translokáciu IRI a aktiváciu AKT1 do mitochondrií.
Obrázok 1. Ischémiou reperfúziou indukovaná akútna translokácia a aktivácia AKT1 v renálnych mitochondriách.
Generovanie transgénnych myší s indukovateľnou expresiou špecifickou pre obličkové tubuly dominantného negatívneho AKT v mitochondriách
Na testovanie hypotézy, že aktivácia renálnej tubulárnej mitochondriálnej AKT1 počas IRI chráni obličku pred AKI a následným vývojom CKD, sme vytvorili model transgénnej myši, ktorý umožňuje tamoxifénom (TAM) indukovanú expresiu tubulárne špecifického mitochondriálneho zacielenia dominantne negatívneho AKT1. Dominantné negatívne AKT1 (mdnAKT) a mitochondriálne targetingové sekvencie boli pridané na N koniec. Podmienená expresia tamoxifénu AKT1 transgénov bola sprostredkovaná pomocou pCALNL (pozri Materiály a metódy). Aby sa vylúčili mätúce účinky spojené s náhodnou integráciou transgénových polí v genóme, bola vložená jediná kópia transgénu homológnou rekombináciou v ES bunkách s cielenými transgénmi na Gt (ROSA) 26 alebo lokus na chromozóme. Dvojgénové myši (KMDAKT) sa získali krížením tam-indukovaných myší mdnAKT s hemizygotnými KSP-CreERT2 myšami, kde tam-indukovaná Cre aktivita bola riadená promótormi kalmodulínu 16 špecifickými pre renálne tubulárne bunky. tam injekcia vyvolala aktivitu Cre, izolované mitochondrie a mitochondriálne proteíny separované SDS-PAGE na imunobloting. Výsledky ukázali, že TAM úspešne indukoval expresiu mutantnej AKT1. Mutantný proteín bol nedetegovateľný u myší KMDAKT, myší KSPCreERT2 a myší divokého typu (injekcia kukuričného oleja).
Na overenie expresie špecifickej pre obličky sa mitochondriálne proteíny extrahovali z rôznych tkanív po injekcii TAM. his-značený mutant AKT1 bol exprimovaný iba v obličkách. Rezy obličiek boli zafarbené protilátkami anti-his-tag a mitochondriálnym Mitotrackerom na imunofluorescenčné zobrazovanie. Výsledky ukázali, že všetky mutanty AKT1 boli zafarbené protilátkou His-tag a lokalizované v mitochondriách. V glomeruloch sa nezistili žiadne mutácie AKT1. Enzymatická aktivita mitochondriálneho AKT1 sa analyzovala pomocou rekombinantného GSK3, aby sa potvrdila hlavná negatívna úloha v mitochondriách tubulov KMDAKT ošetrených tam. Pretože mitochondriálny AKT1 obličkových tubulov je aktivovaný IRI, porovnali sme enzymatickú aktivitu AKT1 v mitochondriách izolovaných z myší liečených tam a myší liečených kukuričným olejom po IRI. Výsledky ukázali, že renálna mitochondriálna AKT1 aktivita bola významne inhibovaná u KMDAKT myší liečených TAM. Preto je táto transgénna myšacia línia dobrým modelom na štúdium úlohy AKT1 v tubulárnych mitochondriách.
Výhody Cistanche
Inhibícia mitochondriálneho AKT obličkových tubulov zhoršila IRI in vivo
IRI bola indukovaná pri jednostrannej renálnej ischémii. V poslednej sérii experimentov bol fosforylovaný AKT1 sotva detegovateľný v mitochondriách proximálnych renálnych tubulov. U myší KMDAKT s injekciou kukuričného oleja a injekciou tam sa nepozorovali žiadne významné rozdiely v renálnej histológii, dusíku močoviny v krvi (BUN) a sérovom kreatiníne (Cr), čo naznačuje, že mitochondriálna signalizácia AKT1 nemá žiadnu významnú úlohu v štruktúre a funkcii obličiek na začiatku. pred indukciou IRI. Aby sa zistilo, či mitochondriálny AKT1 hrá ochrannú úlohu počas IRI, použila sa jednostranná IRI na indukciu AKI u myší s kukuričným olejom alebo u myší TAM-KMDAKT. neboli žiadne rozdiely v hladinách BUN alebo Cr získaných bezprostredne po indukcii IRI, ale u myší TAM-KMDAKT boli hladiny BUN aj Cr významne zvýšené po 45 dňoch. Tieto výsledky naznačujú, že blokovaná aktivácia mitochondriálneho AKT1 v obličkových tubuloch počas IRI zhoršila neskorý vývoj renálnej dysfunkcie. histologická analýza rezov obličiek zafarbených H&E ukázala, že poškodenie obličiek sa zhoršilo u myší TAM-KMDAKT. Jablonskiho skóre poškodenia renálnych tubulov bolo vyššie so stratou tubulárneho kefového lemu, tubulárnou lýzou a väčším množstvom odpadu v tubulárnom lúmene (p=0.018). Aby sa vylúčil účinok TAM alebo Cre rekombinázy, analyzovali sme aj myši KSP/CreERT2 s injekciou TAM a Jablonskiho skóre bolo podobné u myší KMdakt s kukuričným olejom a TAM-KSP/CreERT2 v deň 7 po IRI (obrázok 3D) (p{{ 19}}.7613). Tieto údaje naznačujú, že naše zistenia neboli skreslené účinkami TAM alebo Cre rekombinázy. U myší TAM-KMDAKT po IRI farbenie trichrómom Masson ukázalo vyššiu fibrotickú oblasť ( percent ) (p < 0,001), sprevádzanú neusporiadanými tubulárnymi štruktúrami s intraluminálnymi odliatkami a úlomkami. expresia col1a sa zvýšila v súlade s farbením trichrómom podľa Massona. Expresia tGF nebola zvýšená, čo naznačuje, že mitochondriálny AKT1 nereguloval zápalovú odpoveď. Po IRI bola expresia markera tubulárneho poškodenia-KIM -1 zvýšená v skupine TAM-KMDAKT, čo potvrdzuje zvýšené poškodenie obličiek v skupine TAM-KMDAKT (p=0.002).
Farbenie TUNEL sa použilo na vyhodnotenie apoptózy obličkových buniek. Počet apoptotických buniek sa významne zvýšil v tubuloch (p{0}}.0054) a glomeruloch (p<0,001) myší TAM-KMDAKT v porovnaní s kontrolnou skupinou. Predpokladá sa, že inhibícia tubulárneho mitochondriálneho AKT1 počas IRI exacerbuje tubulárnu bunkovú smrť a glomerulárne poškodenie. V súlade s tým bola aktivácia kaspázy 9 (promótor) aj kaspázy 3 (vykonateľ) významne zvýšená v TAM-KMDAKT renálnych tubulárnych epiteliálnych bunkách. Na ďalšie preskúmanie chronických glomerulárnych zmien sa uskutočnila analýza farbenia kyselinou periodickou-Schiff (PAS) na rezoch obličiek, aby sa kvantifikovala glomeruloskleróza. Hoci sa 7 dní po IRI nepozoroval žiadny rozdiel v glomeruloskleróze (p=0.2634), viac glomerulosklerózy sa zistilo u myší TAM-KMDAKT 45 dní po IRI (p<0,001). Toto zistenie naznačuje, že renálna tubulárna mitochondriálna signálna dráha AKT môže regulovať tvorbu glomerulárnej jazvy počas vývoja CKD. Kaplan-Meierova analýza prežitia ukázala účinok inhibície tubulárnej mitochondriálnej AKT na výsledok IRI. Prežitie bolo znížené po IRI u myší TAM-KMDAKT v porovnaní s kontrolami (p=0,0013).
Miera prežitia myší TAM-KMDAKT bola významne nižšia ako u kontrol do 7 dní po IRI, ale hladiny BUN/Cr u myší TAM- a kukuričného oleja-KMDAKT boli počas tohto obdobia podobné. Hlásené zmeny BUN/Cr u myší liečených TAM mohli byť podhodnotené v dôsledku nedostupnosti údajov BUN/Cr od mŕtvych myší. Okrem toho vyššia úmrtnosť u myší TAM-KMDAKT môže byť spôsobená skôr dysfunkciou distálnych orgánov (pľúca, srdce, mozog) než len zmenami BUN/Cr.
Úloha tubulárneho mitochondriálneho AKT1 sa hodnotila aj u samíc myší KMDAKT. sérový BUN/Cr a renálna histológia boli relatívne vyššie u samíc myší TAM-KMDAKT 45 dní po IRI. Nebol pozorovaný žiadny významný sexuálny účinok.
Bylinná cistanche
LITERATÚRA
1. Yang JY, Deng W, Chen Y a kol. Zhoršená translokácia a aktivácia mitochondriálnej Akt1 zmiernila aktivitu mitochondriálnej oxidačnej fosforylácie komplexu V v diabetickom myokarde. J Mol Cell Cardiol. 2013;59:167–175.
2. Wang Z, Ying Z, Bosy-Westphal A, a kol. Špecifické rýchlosti metabolizmu hlavných orgánov a tkanív v dospelosti: hodnotenie mechanistickým modelom pokojového výdaja energie. Am J Clin Nutr. 2010;92(6):1369–77.
3. Li SY, Susztak K. Role of Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Gamma Coactivator 1alpha (PGC-1alpha) in Kidney Disease. Semin Nephrol. 2018;38(2):121–6.
4. Portilla D, Dai G, McClure T, a kol. Zmeny PPARalpha a jeho koaktivátora PGC-1 pri akútnom zlyhaní obličiek vyvolanom cisplatinou. Kidney Int. 2002;62(4):1208–18.
5. Forbes JM. Mitochondrie – mocní hráči vo funkcii obličiek? Trendy Endocrinol Metab. 2016;27(7):441–4425.
6. Szeto HH, Liu S, Soong Y, a kol. Zlepšenie mitochondriálnej bioenergetiky v ischemických podmienkach zvyšuje toleranciu teplej ischémie v obličkách. Am J Physiol Renálny Physiol. 2015;308(1):F11– F21.6.
7. Kalogeris T, Baines CP, Krenz M, a kol. Bunková biológia ischemického/reperfúzneho poškodenia. Int Rev Cell Mol Biol. 2012;298:229–317.
8. Gracia-Sancho J, Casillas-Ramirez A, Peralta C. Molekulárne dráhy pri ochrane pečene pred ischémiou/reperfúznym poškodením: aktualizácia z roku 2015. Clin Sci (Londýn). 2015;129(4):345–62.
9. Pozri EJ, Jayasinghe K, Glassford N, a kol. Dlhodobé riziko nepriaznivých výsledkov po akútnom poškodení obličiek: systematický prehľad a metaanalýza kohortových štúdií s použitím konsenzuálnych definícií expozície. Kidney Int. 2019;95(1):160–72.
10. Szeto HH, Liu S, Soong Y, a kol. Ochrana mitochondrií po akútnej ischémii zabraňuje predĺženej upregulácii IL-1beta a IL-18 a zastavuje CKD. J Am Soc Nephrol. 2017;28(5):1437–49.
11. Tran MT, Zsengeller ZK, Berg AH, a kol. PGC1alfa riadi biosyntézu NAD spájajúcu oxidačný metabolizmus s ochranou obličiek. Príroda. 2016;531(7595):528–32.
12. Tait SW, Green DR. Mitochondrie a bunková signalizácia. J Cell Sci. 2012;125(Pt 4):807–815.
13. Deng W, Leu HB, Chen Y a kol. Proteínkináza B (PKB/AKT1) vytvorila signálne komplexy s mitochondriálnymi proteínmi a zabránila dysfunkcii glykolytickej energie v kultivovaných kardiomyocytoch počas ischemicko-reperfúzneho poškodenia. Endokrinológia. 2014;155(5):1618–28.
14. Kanegae Y, Lee G, Sato Y a kol. Účinná aktivácia génu v cicavčích bunkách pomocou rekombinantného adenovírusu exprimujúceho miestne špecifickú Cre rekombinázu. Nucleic Acids Res. 1995;23(19):3816–21.
15. Matsuda T, Cepko CL. Riadená expresia transgénov zavedených in vivo elektroporáciou. Proc Natl Acad Sci USA A. 2007 1 16;104(3):1027–32.
16. Lee SA, Cozzi M, Bush EL, a kol. Dysfunkcia vzdialených orgánov pri akútnom poškodení obličiek: prehľad. Am J Kidney Dis. 2018;72(6):846–856.
Hugo YH Lin1,2,3,4, Mňam Chen1, Yu-Han Chen1, Albert P. Ta1,2, Hsiao-Chen Lee1,5, Grant R. MacGregor6, Nosratola D. Vaziri1,2, Ping H. Wang1,2,7
1. UC Irvine Diabetes Center and Department of Medicine, University of California, Irvine, California
2. Katedra fyziológie a biofyziky, Kalifornská univerzita, Irvine, Kalifornia
3. Katedra medicíny, Kaohsiung Medical University, Kaohsiung, Taiwan
4. Oddelenie interného lekárstva, Kaohsiung Municipal Ta-Tung Hospital, Taiwan
5. Oddelenie plastickej chirurgie, Kaohsiung Medical University, Kaohsiung, Taiwan
6. Katedra vývojovej a bunkovej biológie, Kalifornská univerzita, Irvine, Kalifornia
7. Oddelenie diabetu, endokrinológie a metabolizmu, City of Hope National Medical Center, Duarte, Kalifornia
