Časť 1 Heterogenita fibroblastov a terciárne lymfoidné tkanivá v obličkách

Kontakt: ali.ma@wecistanche.com

Abstraktné

Fibroblasty sídlia v rôznych orgánoch a za fyziologických podmienok podporujú tkanivovú štruktúru a homeostázu. Fenotypové zmeny fibroblastov sú základom vývoja rôznych patologických stavov, vrátane orgánovej fibrózy. Nedávne pokroky v jednobunkovej biológii odhalili, že fibroblasty zahŕňajú heterogénne subpopulácie s odlišnými fenotypmi, ktoré majú priaznivé aj škodlivé účinky na hostiteľské orgány spôsobom závislým od kontextu. Vobličkyfenotypové zmeny rezidentných fibroblastov vyvolávajú bežné patologické stavychronické ochorenie obličiek(CKD), ako je renálna anémia a peritubulárna strata kapilár. Navyše u starších zranenýchobličkyfibroblasty poskytujú funkčnú a štrukturálnu podporu pre terciárne lymfoidné tkanivá (TLT), ktoré slúžia ako ektopické miesto získaných imunitných reakcií v rôznych klinických kontextoch. TLT sú úzko spojené so starnutím a progresiou CKD a vývojové štádiá TLT odrážajú závažnosť poškodenia obličiek. V tomto prehľade popisujeme súčasné chápanie heterogenity fibroblastov za fyziologických aj patologických podmienok, s osobitným dôrazom na príspevok fibroblastov k tvorbe TLT vobličky. Rozoberanie heterogénnych charakteristík fibroblastov poskytne sľubnú terapeutickú možnosť pre patologické stavy súvisiace s fibroblastmi, vrátane tvorby TLT.

KĽÚČOVÉ SLOVÁchronickýobličkychoroba, fibroblast, fibróza, myofibroblast, terciárne lymfoidné tkanivo

Kliknite nacistanche tubulosa dávkovanie pri ochorení obličiek

1|ÚVOD

V minulosti sa bunková identifikácia v tkanive spoliehala na morfologický vzhľad pod starostlivým mikroskopickým pozorovaním. Pokrok v molekulárnej biológii viedol k objavu molekulárnych markerov špecifických pre každý typ bunky, ktoré možno použiť na bunkovú klasifikáciu, a to významne prispelo k skúmaniu rôznych biologických mechanizmov. Nedávne pokroky v jednobunkovej multi-omickej analýze odhalili heterogénne vlastnosti bunkových populácií v bezprecedentnom rozlíšení a dramaticky zrekonštruovali naše chápanie biologických javov. Každá kategória buniek obsahuje rôzne subpopulácie s odlišnými funkciami, ktoré charakterizujú tkanivovo špecifické mikroprostredie vo fyziologickom aj patologickom kontexte. Oblasť výskumu fibroblastov nie je výnimkou a nahromadili sa obrovské dôkazy naznačujúce ich heterogénne vlastnosti.

Fibroblasty sú bunky vretenovitého tvaru nachádzajúce sa v intersticiálnych priestoroch rôznych orgánov, kde syntetizujú niekoľko štrukturálnych proteínov, ako sú kolagény a fibronektíny, aby organizovali extracelulárnu matricu (ECM) a udržiavali homeostázu orgánov.1 Okrem ich spoločných funkcií naprieč orgánmi fibroblasty hrajú orgánovo špecifické úlohy v zhode s inými rezidentnými bunkami. Napríklad subpopulácia rezidentných fibroblastov vobličkyprodukuje erytropoetín (EPO), hlavný regulátor erytropoézy. Nedávne štúdie odhalili, že fibroblasty v rôznych orgánoch vykazujú vysokú funkčnú heterogenitu. Za patologických podmienok dochádza k dramatickým fenotypovým zmenám fibroblastov a významne prispievajú k rozvoju orgánovej dysfunkcie. Fibroblasty sa transdiferencujú na myofibroblasty a podporujú progresiu orgánovej fibrózy, ktorá je prejavom maladaptívnej opravy po poranení.2 V obličkách zohrávajú fibroblasty rozhodujúcu úlohu vo vývoji a progresiichronické ochorenie obličiek(CKD), ktorý má celosvetovo vysokú morbiditu a mortalitu aj v modernej dobe.3 Fibroblasty riadia niekoľko patologických stavov súvisiacich s CKD, ako je renálna fibróza a renálna anémia, bez ohľadu na etiológiu CKD. Okrem toho fibroblasty tiež hrajú mnohostranné úlohy v závislosti od kontextu. Napríklad v starých poškodených obličkách hrajú fibroblasty kľúčovú úlohu pri tvorbe terciárneho lymfoidného tkaniva (TLT), indukovateľného ektopického lymfoidného tkaniva vyvolaného chronickým zápalom.4 Objasnenie individuálnych charakteristík fibroblastov objasní základné mechanizmy súvisiace s fibroblastmi. patologických stavov a uľahčiť vývoj účinných terapeutík.

V tomto prehľade najprv popisujeme heterogenitu fibroblastov z hľadiska ich pôvodu a funkcie za fyziologických podmienok. Následne diskutujeme o funkčnej heterogenite fibroblastov v rôznych patologických stavoch vrátane orgánovej fibrózy a ich interakciách s inými typmi buniek a okolitým mikroprostredím. Zvláštny dôraz sa kladie na rezidentné fibroblasty vobličkya ich vplyv na progresiu CKD. Nakoniec bude diskutovaný príspevok fibroblastov k tvorbe TLT a jeho klinický význam.

2|CHARAKTERISTIKA FIBROBLASTOV

2,1|Charakteristika a funkcie fibroblastov za fyziologických podmienok

Fibroblasty sa vo všeobecnosti identifikujú podľa ich morfológie, lokalizácie a reprezentatívnych expresií markerov, ako sú PDGFR a CD73.1 Tieto markery však nie sú absolútne špecifické pre fibroblasty, takže absencia markerov pre iné bunkové línie (napr. CD45 pre hematopoetické bunky ) sa často používa na identifikáciu fibroblastov. Za fyziologických podmienok prispievajú fibroblasty k udržaniu normálnej štruktúry tkaniva podporou ECM obratu. Okrem týchto funkcií hrajú rezidentné fibroblasty aj tkanivovo špecifické úlohy. Napríklad v srdci, kde fibroblasty tvoria najväčšiu bunkovú populáciu, fibroblasty snímajú mechanické natiahnutie a interagujú s myocytmi cez medzerové spojenie, čo umožňuje vhodné elektrické vedenie a udržiava normálnu srdcovú funkciu.⁵Okrem toho deplécia fibroblastov v kostnej dreni a kostrovom svale vedie k anémii a kachexii, čo naznačuje ich význam pre homeostázu normálnych tkanív v rôznych orgánoch.

Theobličkyje jedinečný orgán v tom, že viaceré typy buniek sa nachádzajú blízko seba a fungujú harmonicky pri vykonávaní úloh špecifických pre obličky, ako je odstraňovanie odpadových produktov a udržiavanie rovnováhy telesných tekutín. Fibroblasty poskytujú štrukturálnu podporu pre nefróny, základnú funkčnú jednotku obličky, a majú priamu interakciu s inými obličkovými rezidentnými bunkami, ako sú proximálne tubulárne bunky.7 Ako špecifická funkcia obličkových rezidentných fibroblastov, určité subpopulácie fibroblastov v hlbokom kortexe a vonkajšia dreň produkuje EPO ako odpoveď na hypoxiu, ktorá stimuluje erytropoézu v kostnej dreni.8 Bunky produkujúce EPO majú dendritickú morfológiu podobnú neurónom a exprimujú neurónové markery, ako je proteín 2 spojený s mikrotubulami (MAP2) a svetelný polypeptid neurofilamentov (NFL) .8 Je zaujímavé, že za ťažkých anemických podmienok takmer všetky rezidentné fibroblasty, vrátane tých vo vonkajšom kortexe, produkujú EPO, čo naznačuje vysokú plasticitu funkcie fibroblastov.9 Lokalizácia buniek produkujúcich EPO je v ostrom kontraste s inými hematopoetickými rastovými faktormi. , ako sú faktory stimulujúce kolónie granulocytov, ktoré sa syntetizujú v blízkosti ich cieľových buniek a zábavy pôsobenie parakrinným spôsobom. Jedným z vysvetlení tohto rozporu je, že fyziologická koncentrácia kyslíka v obličkách je nižšia ako v iných orgánoch a prietok krvi obličkami predstavuje približne 20 percent srdcového výdaja, čo z obličiek robí ideálny biologický senzor hypoxie.10 Obličky môžu tiež okamžite detekovať stav tekutiny v juxtamedulárnej oblasti a regulovať extracelulárny objem úpravou množstva reabsorpcie sodíka. Spolu s produkciou EPO môžu obličky nastaviť objem plazmy a hmoty červených krviniek na priaznivú úroveň, pričom slúžia ako „kritmeter“.^11,12Okrem toho fibroblasty v obličkovej dreni exprimujú COX1 a COX2, ktoré sú kľúčovými enzýmami syntézy prostaglandínov (PG).¹³ Za fyziologických podmienok majú PG viaceré funkcie vobličkyako je regulácia prietoku krvi obličkami a uvoľňovanie renínu. Celkovo rezidentné fibroblasty v obličkách prispievajú k udržaniu renálnej homeostázy niekoľkými mechanizmami.

2,2|Pôvod fibroblastov

Vývojový pôvod fibroblastov je heterogénny. Vobličky, sme predtým odhalili, že rezidentné fibroblasty v obličkovej kôre a vonkajšej dreni pochádzajú z extrarenálnych buniek označených líniou myelínového proteínu nula (P0)-Cre.¹⁴ V embryonálnej fáze sa P0 exprimuje na bunkách neurálnej lišty.¹⁵ P0-Bunky označené líniou Cre migrujú z neurálnej lišty do embryonálnejobličkyv embryonálny deň 13,5 a sú lokalizované spolu s vonkajším puzdrom a močovodom obličky. V dospelomobličkyBunky označené líniou P0-Cre sa pozorujú v renálnom interstíciu a exprimujú fibroblastové markery, ako sú PDGFR a CD73. Je zaujímavé, že väčšina fibroblastov produkujúcich EPO je tiež líniovo označená P0-Cre, čo je v súlade s ich vlastnosťami fenotypov podobných neurónom opísaným vyššie.⁸ Tieto výsledky podporuje aj pozorovanie, že hlavným zdrojom EPO pri primitívnej erytropoéze sú bunky neurálnej a neurálnej lišty.¹⁶

Naproti tomu rezidentné fibroblasty vo vnútornej dreni obličiek sú líniovo označené pomocou Wnt4-Cre,¹⁷ príkladom regionálnej heterogenity fibroblastového pôvodu vobličky. Pri vývoji obličiek sa expresia Wnt4 pozoruje v nefrónoch a medulárnej stróme.18,19 Wnt4 reguluje diferenciáciu medulárnych stromálnych buniek na bunky hladkého svalstva,²⁰ ako aj mezenchymálny prechod z epitelu a tubulogenézu.19 Deplécia Wnt4 skutočne oslabuje expresiu aktínu hladkého svalstva (SMA) v medulárnych stromálnych bunkách.²⁰

V spojení s rôznym pôvodom fibroblastov v obličkovej kôre a dreni bolo tiež hlásených niekoľko fenotypových rozdielov medzi kortikálnymi a medulárnymi fibroblastmi. Napríklad, zatiaľ čo kortikálne fibroblasty exprimujú ekto-5'-nukleotidázu (5'NT), väčšina medulárnych fibroblastov nie.²¹ V ultraštrukturálnej analýze majú kortikálne fibroblasty tendenciu vykazovať dendritickú štruktúru na interakciu so susednými bunkami, zatiaľ čo medulárne fibroblasty obsahujú lipidové kvapôčky.7,22 Je zaujímavé, že tieto lipidové kvapôčky sa objavujú aj v kortikálnych fibroblastoch anemických potkanovobličky.²¹ Budúci výskum je potrebný na určenie, či tieto fenotypové rozdiely súvisia s funkčnými rozdielmi medzi kortikálnymi a medulárnymi fibroblastmi.

2,3|Pericyty a fibroblasty

Pericyty sú nástenné bunky, ktoré obklopujú vaskulárne endotelové bunky a riadia mikrocirkuláciu. Tradične sú pericyty definované hlavne ich anatomickým umiestnením, ich morfológiou a typickou expresiou markerov.²³ Pericyty majú spoločné charakteristiky s rezidentnými fibroblastmi, ako je ich mezenchymálny pôvod a morfológia. Pericyty exprimujú rovnaké bunkové markery ako rezidentné fibroblasty, ako je PDGFR . Hoci sa na identifikáciu pericytov použilo niekoľko markerov, ako napríklad NG{0}}, nie sú absolútne špecifické pre pericyty a neexistuje žiadny konkrétny marker, ktorý by pericyty úplne odlišoval od fibroblastov. Účinnosť sledovania obličkových pericytov pomocou NG-2 je skutočne relatívne nízka.24 Hoci rozdiely v anatomickej lokalizácii za fyziologických podmienok čiastočne pomáhajú pri diferenciácii pericytov od rezidentných fibroblastov, niektoré rezidentné fibroblasty sa nachádzajú aj v perivaskulárnej oblasti ("perivaskulárne fibroblasty"), takže diferenciácia medzi pericytmi a fibroblastmi podľa anatomickej lokalizácie nie je dostatočná.

Rovnako ako fibroblasty, pôvod pericytov je heterogénny. Zatiaľ čo pericyty v centrálnom nervovom systéme a týmus pochádzajú z ektodermy odvodenej neurálnej lišty, pericyty v srdci a pľúcach pochádzajú z mezotelu.²³ V obličkách pochádzajú pericyty z FoxD1-pozitívnych kortikálnych mezenchymálnych progenitorov.²⁵ Bunky FoxD1 plus sú pôvodne odvodené od Osr1-pozitívnych nefrogénnych intermediárnych mezodermových progenitorov v embryonálnej fáze.^26,27Bunky FoxD1 plus slúžia ako mezenchymálne progenitory a diferencujú sa na niekoľko typov buniek, ako sú pericyty, fibroblasty, bunky hladkého svalstva ciev a mezangiálne bunky.²⁷ Je zaujímavé, že populácie stromálnych buniek označených líniou FoxD{0}}Cre sa do značnej miery prekrývajú s bunkami označenými líniou P0-Cre, s výnimkou vnútornej drene.^14,25,27Potvrdzuje to pozorovanie, že migrujúce bunky neurálnej lišty v embryonálnej fáze exprimujú FoxD1,²⁸a P0-bunky označené líniou Cre, ktoré vstupujú do embryaobličkyprechodne exprimovať FoxD1.¹⁴ V súlade s tým sú bunky produkujúce EPO tiež líniovo značené FoxD1-Cre.²⁹ Preto existuje veľké prekrytie medzi bunkovými populáciami definovanými ako „fibroblasty" a „pericyty" a ako také sa často diskutuje o pericytoch a fibroblastoch ako celku. V tomto prehľade používame termín "fibroblasty/pericyty" na definovanie bunkovej populácie vrátane fibroblastov aj pericytov. Príspevok FoxD1 plus mezenchymálnych progenitorov k zásobe myofibroblastov a rozvoju fibrózy bude diskutovaný v ďalšej časti.

Hoci bolo ťažké rozlíšiť pericyty od fibroblastov, nedávna štúdia, ktorá vykonala scRNAseq fibroblastov a nástenných buniek (bunky hladkého svalstva ciev a pericyty) vo svalových orgánoch, nám umožňuje pochopiť ich rozdiely na transkripčných úrovniach.³⁰ Muhl a kol. vykonali scRNAseq buniek odvodených z myšacieho srdca, kostrového svalstva, hrubého čreva a močového mechúra. Hoci každý typ bunky vykazuje transkripčnú heterogenitu závislú od orgánu, identifikovalo sa 90 génových podskupín prekrývajúcich sa vo všetkých štyroch orgánoch, ktoré by sa mohli použiť na rozlíšenie medzi pericytmi a fibroblastmi. Hoci bežné fibroblastové markery zahŕňajú mnohé ECM gény (napr. Col1a1), CD34 a PDGFR, markery nástenných buniek zahŕňajú Mcam, Tagln a Notch3. Hoci žiadny samostatný marker nemôže úplne definovať každý typ bunky, kombinácia týchto markerov účinne odlišuje pericyty od fibroblastov. Je zaujímavé, že pericyty vykazujú orgánovo špecifickú lokalizáciu a expresiu markerov v porovnaní s fibroblastmi. Napríklad, hoci pericyty hrubého čreva sú lokalizované na vrchole subepiteliálnych kapilárnych slučiek so silnou expresiou PDGFR a NG-2, pericyty močového mechúra majú tendenciu exprimovať SMA. Odlišné transkripčné profily pericytov môžu vysvetliť funkčné rozdiely pericytov medzi rôznymi orgánmi.

3|MYOFIBROBL A ST: PÔVOD, FUNKCIA, HETEROGENITA A SÚVISIACE PATOLOGICKÉ STAVY

Fibróza je konečným bežným prejavom orgánovej dyshomeostázy a je definovaná ako nadmerné ukladanie ECM s deformovanou architektúrou tkaniva. Rozvoj fibrózy je regulovaný zložitou rovnováhou medzi syntézou ECM a jej degradáciou.31 Po rozvinutí je fibróza spojená so zlou prognózou v rôznych orgánoch, vrátaneobličkya považuje sa za spoľahlivý prediktor poklesu funkcie orgánov. V obličkách sa fibróza vyvíja súčasne s renálnou anémiou a peritubulárnou kapilárnou stratou, ktoré sú charakteristickým znakom CKD. Pri vývoji fibrózy sa myofibroblasty objavujú de novo po poranení a aktívne proliferujú a syntetizujú zložky ECM (obrázok 1).

3.1|Pôvod myofibroblastov

Počas posledného desaťročia bolo navrhnutých niekoľko bunkových zdrojov ako kandidátov na progenitory myofibroblastov. Štúdie ukázali, že väčšina myofibroblastov pochádza z rezidentných fibroblastov, a to ako vobličkya iné orgány (napr. srdce).^14,32,33Vobličky, P0-Rezidenčné fibroblasty označené líniou Cre sa po poranení transdiferencujú na myofibroblasty so sprievodnou stratou produkcie EPO.¹⁴ Dôsledne, myofibroblasty v zranenýchobličkysú tiež líniovo označené FoxD1-Cre.²⁵ Tieto výsledky boli potvrdené následnou štúdiou s použitím EPO-Cre myší s unilaterálnou ureterálnou obštrukciou (UUO), hlavným in vivo experimentálnym modelom renálnej fibrózy.⁹ V myofibroblastoch sú aktivované NFκB a Smad signalizácia, ktoré sú základom fenotypového prechodu myofibroblastov a zníženej produkcie EPO. Je zaujímavé, že produkcia EPO v myofibroblastoch sa obnovuje podávaním neuroprotektívnych látok, ako je dexametazón a neurotrofíny,¹⁴ alebo cúvanie UUO,⁹ príkladom vysokej funkčnej plasticity myofibroblastov.

Na rozdiel od kortikálnych myofibroblastov medulárne myofibroblasty pochádzajú z Wnt4 plus rezidentných fibroblastov vo vnútornej dreni.¹⁷ Nedávna jednobunková transkripčná analýza tiež podporuje možnosť, že kortikálne a medulárne (myo) fibroblasty môžu vykazovať odlišné fenotypy. snRNAseq na myšiachobličkymodely poranení odhalili, že subpopulácie fibroblastov sú rozdelené do štyroch skupín podľa ich kortikálneho alebo medulárneho miesta pôvodu.³⁴ Je zaujímavé, že kortikálne fibroblasty prechodne exprimujú Acta2 a Col1a1 iba v akútnej fáze IRI, zatiaľ čo medulárne fibroblasty vykazujú trvalú expresiu týchto myofibroblastových markerov, dokonca aj 6 týždňov po IRI. Tieto fenotypové rozdiely medzi kortikálnymi myofibroblastmi a medulárnymi myofibroblastmi môžu pochádzať z odlišného pôvodu fibroblastov, ako je opísané vyššie.

Nedávno publikovaná komplexná štúdia poskytla presvedčivý dôkaz, že väčšina myofibroblastov pochádza z rezidentných fibroblastov/pericytov nielen v myších obličkách, ale aj v ľudských obličkách. Kuppe a kol. analyzovali ľudskú a myšaciu fibrózuobličkypomocou scRNAseq s veľmi vysokým rozlíšením.35 Väčšina myofibroblastov sa diferencuje od fibroblastov a pericytov, s malým príspevkom od iných typov buniek, ako sú dediferencované proximálne tubulárne bunky. V tejto štúdii boli myofibroblasty definované ako bunky exprimujúce najviac génov ECM namiesto expresie SMA a zistilo sa, že myofibroblasty sú účinnejšie označené periostínom (Postn). Je zaujímavé, že prechod fibroblastov/pericytov na myofibroblasty je charakterizovaný skorou expresiou génov súvisiacich so zastavením bunkového cyklu, ako je napríklad aktivačný proteín-1 (AP1). Po expresii AP1 nasleduje expresia integrínov a TGF, ktoré sú hlavnými hnacími silami renálnej fibrózy. Identifikovali tiež Nkd2 ako selektívny marker pre zrelé myofibroblasty. Expresia Nkd2 pozitívne koreluje s expresiou Postn a ECM, ale negatívne s génmi spojenými s fibroblastmi a pericytmi. Knockdown Nkd2 zapnutýobličkyorganoidy potlačili expresiu Col1a1, čo naznačuje, že Nkd2 môže hrať úlohu pri vývoji fibrózy. Hoci je potrebná ďalšia validácia in vivo, existuje možnosť, že Nkd2 môže slúžiť ako terapeutický cieľ pre renálnu fibrózu.

Hoci príspevok fibroblastov/pericytov k zásobe myofibroblastov je najvýznamnejší, bol tiež opísaný príspevok fibrocytov. Fibrocyty sú bunky získané z kostnej drene s pozitívnymi hematopoetickými markermi, ktoré produkujú kolagén a zložky ECM. Fibrocyty migrujú doobličkyako preddiferencované bunky produkujúce kolagén a prispievajú k rozvoju fibrózy v obličkách.³⁶ Skoré štúdie uvádzali protichodné výsledky týkajúce sa celkového príspevku fibrocytov k myofibroblastom,^24,37hlavne kvôli rozdielom v spoľahlivosti transgénnych reportérov. Nedávne štúdie využívajúce modely parabiózy a scRNAseq ukázali, že väčšina myofibroblastov pochádza z fibroblastov/pericytov, ale nie z buniek odvodených z hematopoetickej línie.³⁸ scRNAseq človekaobličkytiež odhalila podobné výsledky,³⁵ čo naznačuje, že príspevok fibrocytov k zásobe myofibroblastov je relatívne malý v porovnaní s fibroblastmi/pericytmi.

Predchádzajúca štúdia tvrdila, že epitelové bunky sa transdiferencujú na myofibroblasty prechodom z epitelu na mezenchym (EMT),³⁹ hlavne na základe kolokalizácie epitelových a mezenchymálnych markerov. Podrobné štúdie sledovania bunkového osudu však spochybnili hlavný prínos EMT in vivo a preukázali, že EMT predstavuje iba malú časť súboru myofibroblastov, ak existuje.^24,25,35Endotelový-mezenchymálny prechod (EndoMT) je ďalší biologický proces, pri ktorom sa endotelové bunky transdiferencujú na myofibroblasty. Hoci niektoré štúdie odhalili, že EndoMT prispieva k renálnej fibróze,^40-42Zdá sa, že príspevok EndoMT k celkovej populácii myofibroblastov je menej významný ako fibroblasty/pericyty alebo fibrocyty.^24,35

3,2|Predefinovanie myofibroblastov

Tradične sa myofibroblasty definovali ako bunky, ktoré majú vlastnosti fibroblastov aj buniek hladkého svalstva a exprimujú kontraktilný proteín SMA. . Ako už bolo opísané, v nedávno vykonanej analýze scRNAseq fibrotickýchobličkyboli myofibroblasty definované ako bunky s najväčšou expresiou ECM a Postn sa použil na identifikáciu myofibroblastov namiesto SMA.³⁵Sun a kol. skutočne použili duálne reportérové ​​myši Col-EGF / SMA-RFP a odhalili, že iba malá časť buniek produkujúcich kolagén exprimuje SMA v modeloch fibrózy obličiek a pľúc.⁴³ Ďalšia štúdia tiež naznačila, že bunky hladkého svalstva a pericyty exprimujú vyššie hladiny SMA ako my-fibroblasty, čím sa SMA stáva nekonzistentným markerom pre myofibroblasty, aspoň pri fibróze pľúc.⁴⁴ Je zaujímavé, že myofibroblasty sú rozdelené do piatich zhlukov pomocou scRNAseq a pseudočasová analýza naznačuje, že každý z nich predstavuje rôzne štádiá prechodu my-fibroblastov z fibroblastov.35 Na potvrdenie funkčnej heterogenity rôznych podtypov fibroblastov je potrebná ďalšia validačná štúdia.

3,3|Funkčná heterogenita (myo)fibroblastov

Za patologických podmienok získavajú fibroblasty odlišné fenotypy a hrajú rôzne úlohy v závislosti od ich mikroprostredia a klinického kontextu. V pľúcach bola hlásená vysoká funkčná heterogenita rezidentných fibroblastov, ktorá prispieva k pľúcnej fibróze prostredníctvom rôznych mechanizmov.44-46 Existujú odlišné subpopulácie pľúcnych fibroblastov, ktoré sa nachádzajú v rôznych anatomických lokalitách (alveolárne, adventiciálne a peribronchiálne fibroblasty), a každý z nich vykazuje odlišné transkripčné profily v scRNAseq.44 Spomedzi nich bola unikátna fibroblastová subpopulácia s vysokou produkciou ECM identifikovaná expresiou kolagénového triple helix repeat obsahujúceho 1 (Cthrc1). Cthrc1-pozitívne fibroblasty sa líšia od alveolárnych fibroblastov a pozorujú sa hlavne vo fibroblastických ložiskách, centrálnom mieste fibrogenézy. Po intratracheálnom prenose vykazujú vysokú migračnú a kolonizačnú kapacitu, čo naznačuje ich patologické funkcie. Tieto výsledky naznačujú, že odlišné subpopulácie fibroblastov zaberajú rôzne anatomické miesta v pľúcach a Cthrc1 označuje škodlivé fibroblasty s vysokou expresiou ECM. Iná štúdia odhalila, že fenotypové zmeny starých myofibroblastov v pľúcach sú základom zhoršenej schopnosti rozlíšenia pľúcnej fibrózy u starších jedincov.47 Staršie myofibroblasty vykazujú vyššiu expresiu NADPH-oxidázy 4 (Nox4), zatiaľ čo faktor 2 súvisiaci s NFE{10}}(Nrf2 ), ktorý je primárnym regulátorom reakcie na antioxidačný stres, je downregulovaný. Redoxná nerovnováha medzi Nox4 a Nrf2 spúšťa získanie antiapoptotických a senescentných fenotypov vo starých fibroblastoch, čo podporuje pretrvávajúcu fibrózu. Blokáda aktivity Nox4 in vivo pomocou siRNA alebo inhibítora s malou molekulou skutočne obnovuje schopnosť rozlíšenia fibrózy u starých myší so zníženými fenotypmi starnutia a antiapoptózy v myofibroblastoch.

Jedinečný fibroblastový fenotyp je hlásený aj pri chorobe súvisiacej s IgG4-(IgG4-RD), ktorá je charakterizovaná IgG4-pozitívnou infiltráciou plazmatických buniek a storiformnou fibrózou.48 Hoci väčšina pacientov s IgG4-RD dobre reagujú na liečbu glukokortikoidmi, základný dôvod terapeutickej odpovede bol nejasný. Zistili sme, že expresia glukokortikoidného receptora (GR) je významne upregulovaná v postihnutých orgánoch pacientov, ako sú submandibulárne žľazy, retroperitoneum aobličky.49 Je zaujímavé, že GR sa exprimuje hlavne na fibroblastoch, ako aj leukocytoch postihnutého orgánu, čo čiastočne vysvetľuje, prečo podávanie glukokortikoidov tlmí rozvoj fibrózy v IgG4-RD. Hoci príspevok fibroblastov k rozvoju IgG4-RD by mal byť ďalej overený, tieto výsledky sú príkladom funkčnej heterogenity fibroblastov pri vývoji rôznych patologických stavov.

3,4|Renálna anémia a peritubulárna strata kapilár: dva bežné patologické stavy spôsobené dysfunkciou fibroblastov v obličkách

Fibróza je konečnou spoločnou cestou CKD bez ohľadu na jej základnú etiológiu. Fibróza v obličkovej kôre sa skutočne považuje za najlepší histologický prediktor renálnej dysfunkcie pri CKD.50 Je to čiastočne preto, že fibróza úzko súvisí s inými patologickými stavmi bežnými pri CKD, ako je renálna anémia a strata peritubulárnych kapilár. Niekoľko faktorov spúšťa prechod fibroblastov na myofibroblasty a rozvoj fibrózy v obličkách, ako je poškodenie proximálnych tubulov.51,52 Ako je opísané v predchádzajúcej kapitole, fibroblasty/pericyty produkujúce EPO sa v reakcii na poškodenie transdiferencujú na myofibroblasty so sprievodnou stratou produkcie EPO. 14,29 Produkcia EPO je indukovaná v hypoxickom stave a regulovaná hypoxiou indukovateľnými faktormi (HIF). Za normoxických podmienok sú HIF rýchlo hydroxylované proteínmi obsahujúcimi doménu HIF-prolylhydroxylázy (PHD), ktoré podporujú proteazomálnu degradáciu HIF. Vobličky, HIF aktivácia Ph.D. inhibícia obnovuje produkciu EPO v myofibroblastoch a os PHD2-HIF2 je hlavnou regulačnou kaskádou.53 Je zaujímavé, že produkcia EPO vo fibroblastoch označených líniou FoxD1-Cre je upregulovaná inaktiváciou PHD2, ale nie inaktiváciou PHD1 alebo PHD3, čo naznačuje, že produkcia EPO v týchto bunkách je regulovaná jedinečnými mechanizmami.⁵³ Hoci súčasnou štandardnou terapiou renálnej anémie je podávanie rekombinantného ľudského EPO (rhEPO), podávanie exogénneho rhEPO je spojené s niekoľkými nepriaznivými účinkami, ako je hypertenzia a trombotické príhody.^54,55Aby sa prekonali tieto nevýhody rhEPO, Ph.D. Inhibítory, ktoré upregulujú gény vyvolané hypoxiou, vrátane EPO, boli vyvinuté a používané na liečbu renálnej anémie.⁵⁶ Hoci sú potrebné ďalšie štúdie týkajúce sa dlhodobých nepriaznivých účinkov Ph.D. Sľubnou a priaznivou terapeutickou stratégiou pri renálnej anémii pri CKD by mohlo byť zacielenie na myofibroblasty na vyvolanie endogénnej produkcie EPO.

Peritubulárna kapilárna strata a zriedenie kapilár sa tiež vyvíjajú v spojení s fibrózou a funkčná zmena pericytov je základom týchto prejavov.^57-59Vobličkyperitubulárne kapiláry sú obklopené pericytmi, ktoré podporujú kapilárnu štruktúru a funkciu za fyziologických podmienok. Po poranení sa tieto pericyty oddelia od peritubulárnych kapilár a migrujú do poškodených tubulov.^53,60 V tomto procese peritubulárne kapiláry strácajú mechanickú podporu pericytov, čo vedie k|201 ARAI a kol. kapilárna regresia a riedenie.^57,58V modeli UUO sa apoptóza endotelových buniek a strata peritubulárnych kapilár vyvíja v súlade s progresiou fibrózy.⁶¹ Okrem toho peritubulárne kapiláry fibrotickýchobličkyvykazujú morfologické abnormality, ako je tvorba kaveol a vakuolizácia, a ich permeabilita je zvýšená, ako je zrejmé zo zvýšenej extravazácie pri dvojfotónovom mikroskopickom zobrazovaní.⁶² Znížené zásobovanie obličkami vyvolané stratou peritubulárnych kapilár a ich zriedením sa skutočne deteguje na modeloch myší s CKD pomocou mikropočítačovej tomografie so zvýšeným kontrastom.63 Spolu s rozvojom fibrózy a relatívnym deficitom EPO prispieva peritubulárna kapilárna strata k zníženiu prísunu kyslíka do renálnych tubuloch a interstíciu, čo zhoršuje poškodenie obličiek a vytvára začarovaný kruh progresie CKD.⁶⁴

4|FUNKČNÁ HETEROGENITA FIBROBLASTOV ZA FIBRÓZOU

Nedávne štúdie využívajúce analýzu scRNAseq odhalili fenotypovú heterogenitu fibroblastov za patologických podmienok v rôznych orgánoch a následne preukázali všestranné funkcie fibroblastov. Fibroblasty majú nielen škodlivé účinky, ale majú aj prospešné funkcie v závislosti od kontextu. V tejto časti uvádzame prehľad súčasného chápania rôznych funkcií fibroblastov, iných ako vývoj fibrózy.

4.1|Zápalové funkcie

Fibroblasty podporujú zápal tkaniva v niekoľkých kontextoch.⁶⁵ Napríklad v myšom modeli infarktu myokardu rezidentné fibroblasty vedú nielen k srdcovej fibróze, ale aj k lokálnemu zápalu k zhoršovaniu srdcovej funkcie. Po infarkte myokardu srdcové fibroblasty vo fibrotickej oblasti upregulujú Sox9,^66,67čo je transkripčný faktor zodpovedný za ukladanie ECM v chondrocytoch.⁶⁸ Fibroblastovo špecifická delécia Sox9 in vivo zmierňuje zápal srdca a fibrózu v chronickej fáze po infarkte myokardu, čo vedie k zlepšeniu dysfunkcie ľavej komory a zjazveniu myokardu. RNAseq srdcového jazvového tkaniva odhalil, že delécia Sox9 vo fibroblastoch down-reguluje prozápalové gény, ako je IL-6, ako aj gény kolagénu. ChIPseq na chondrocytoch cicavcov odhalil, že niektoré z týchto prozápalových génov sú priamo viazané Sox9 v lézii zosilňovača.69 Celkovo, hoci upstream signály pre upreguláciu SOX9 by sa mali ďalej skúmať, tieto zistenia naznačujú, že Sox9 v srdcových fibroblastoch reguluje fibrózu aj zápal po infarkt myokardu a možno ho považovať za nový terapeutický cieľ.

Prozápalové fenotypy subpopulácií fibroblastov sa tiež intenzívne skúmali pri reumatoidnej artritíde (RA). Croft et al skúmali myšacie modely ustupujúcej a perzistujúcej artritídy a odhalili, že fibroblasty pozitívne na aktivačný proteín fibroblastov-a (FAPa) sa hromadia v zapálenom kĺbe.70 Delécia FAPa plus fibroblasty zmierňuje lokálny zápal a deformáciu kĺbov, čo naznačuje ich patologické funkcie. Je zaujímavé, že FAPa plus fibroblasty sú rozdelené do dvoch odlišných subpopulácií pomocou scRNAseq: FAPa plus THY1 plus fibroblasty a FAPa plus THY1- fibroblasty. FAPa plus THY1 plus fibroblasty sú lokalizované v synoviálnej výstelkovej vrstve, zatiaľ čo FAPa plus THY1- fibroblasty sa nachádzajú v synoviálnej výstelkovej vrstve. Okrem ich priestorového rozdielu sú tieto fibroblasty funkčne odlišné; adoptívny prenos FAPa plus fibroblastov THY1 plus do kĺbu vyvoláva závažný lokálny zápal so zvýšenou infiltráciou leukocytov, zatiaľ čo prenos fibroblastov FAPa plus THY1- má za následok zvýšenú aktivitu osteoklastov a deformáciu kĺbov bez zhoršenia zápalu. Tieto funkčne odlišné fibroblasty sú tiež pozorované v ľudských kĺboch ​​s RA. FAPa plus THY1 plus fibroblasty sú skutočne hojnejšie v kĺboch ​​pacientov s RA ako pacientov s osteoartritídou (OA), 70 čo je príkladom ich zápalového podpisu. Ďalšia štúdia skúmala ľudské synoviálne tkanivá pomocou hromadných RNAseq a scRNA-seq a identifikovala tri hlavné podskupiny fibroblastov s odlišnou expresiou povrchových proteínov.⁷¹ Medzi nimi fibroblasty Pdpn plus THY1 plus CD34− expandujú v perivaskulárnej zóne zapáleného synovia a pozitívne korelujú so závažnosťou synoviálneho zápalu pri RA. Fibroblasty Pdpn plus THY1 plus CD34− vykazujú vysoké migračné a proliferačné profily in vitro. Je zaujímavé, že väčšina týchto fibroblastov Pdpn plus THY1 plus CD34- exprimuje kadherín-11, ktorý je základom patologických charakteristík myších synoviálnych fibroblastov.72 Skúmal sa aj základný mechanizmus regulácie prozápalových fibroblastov pri RA. Wei et al odhalili, že signalizácia Notch3 riadi diferenciáciu THY1 plus sublimujúce fibroblasty, ktoré sú základom synoviálneho zápalu RA.73 Genetická deplécia alebo farmakologická blokáda signalizácie Notch3 zmierňuje zápal kĺbov a eróziu kostí na myšom modeli RA. Celkovo tieto zistenia naznačujú, že špecificky zamerané na zápalové fibroblasty môže byť sľubnou terapeutickou stratégiou pri RA.

Fibroblasty pôsobia aj ako bunky vrodenej imunity. Pericyty/fibroblasty exprimujú niekoľko receptorov na rozpoznávanie vzorov, ako sú Toll-like receptory (TLR), a podporujú lokálnu zápalovú kaskádu. Leaf et al odhalili, že obličkové pericyty snímajú molekulárne vzory súvisiace s poškodením (DAMP) uvoľnené z poškodených buniek spôsobom závislým od TLR a MyD88-.74 Rovnakým spôsobom ako klasické imunitné bunky, pericyty aktivujú zápal NLRP3, čo vedie k sekrécii IL-1 a IL{7}}. Tieto zistenia ukazujú, že intersticiálna lokalizácia pericytov/fibroblastov im umožňuje okamžite zaznamenať počiatočné poškodenie a fungovať ako propagátor lokálneho zápalu. Ako ďalší mechanizmus na šírenie lokálneho zápalu intravitálne mikroskopické pozorovanie odhalilo, že pericyty menia svoju morfológiu počas zápalu a vytvárajú medzery medzi susednými pericytmi, čo uľahčuje migráciu neutrofilov a plazenie.⁷⁵

Fibroblasty tiež prispievajú k tvorbe TLT v starých poškodených obličkách.4,76 Sekréciou homeostatických chemokínov, ako sú CXCL13 a CCL19, sa fibroblasty nachádzajúce sa v TLT získavajú 202|ARAI a kol. lymfocyty a poskytujú funkčný skelet pre TLT, ako je uvedené v nasledujúcej časti.

4,2|Regulácia progresie nádoru

V mikroprostredí nádoru (TME) tvoria fibroblasty spojené s rakovinou (CAF) najväčšiu bunkovú zložku v stróme TME a hrajú dôležitú úlohu v patogenéze rakoviny.⁷⁷ CAF podporujú progresiu rakoviny prostredníctvom viacerých mechanizmov, ako je remodelácia ECM a sekrécia rastových faktorov a prozápalových cytokínov. CAF tiež regulujú nábor imunitných buniek a potláčajú protinádorovú imunitnú reakciu.^77,78CAF vykazujú vysokú funkčnú a regionálnu diverzitu v závislosti od ich bydliska. Napríklad pri duktálnom adenokarcinóme pankreasu (PDAC) sa identifikujú dva odlišné podtypy CAF: jedna podskupina CAF sa nachádza v blízkosti nádorových buniek so zvýšenou expresiou SMA, zatiaľ čo druhá podskupina je umiestnená ďaleko od nádorových buniek a vylučuje zápalové cytokíny, ako napr. IL-6.⁷⁹Pri rakovine prsníka sú CAF klasifikované do troch subpopulácií podľa ich pôvodu, z ktorých každá má nezávislé prognostické schopnosti.80 Zaujímavé je, že štúdie naznačili, že tieto heterogénne subpopulácie CAF by mohli byť rozdelené do dvoch funkčne odlišných podtypov: rakovinu podporujúce CAF (pCAFs ) a rakovinu obmedzujúce CAF (rCAF).77,81 Existenciu rCAF naznačilo pozorovanie, že genetická deplécia alebo funkčná intervencia proliferujúcich CAF neinhibuje, ale skôr podporuje, progresiu rakoviny.^82-84Aj keď sa špecifický marker pre rCAF ešte musí určiť, nedávna štúdia odhalila, že rCAF v PDAC sa vyznačuje expresiou Mifflina,⁸⁵ktorý bol prvýkrát identifikovaný ako proteín ukotvený v glykozylfosfatidylinozitole špecificky označujúci mezenchymálne stromálne/kmeňové bunky.86 U pacientov s PDAC infiltrácia meflínu plus CAF pozitívne koreluje s priaznivými výsledkami. V analýze myšacieho modelu subkutánneho xenoimplantátu lentivírusom indukovaný prenos meflínu do buniek stromálnej strómy nádoru zoslabil rast nádoru a infiltráciu SMA plus CAF. Stróma nádorov Mifflinových knockoutovaných myší vykazuje rovnejšie a širšie kolagénové štruktúry a úroveň Mifflinovej expresie v ľudskom PDAC je spojená so zmenenými kolagénovými štruktúrami. Vzhľadom na to, že progresia rakoviny je úzko spojená s remodeláciou matrice,87 tieto zistenia naznačujú, že Meflin plus CAF potláčajú progresiu nádoru inhibíciou remodelácie kolagénu. Hoci je potrebná ďalšia štúdia o základnom mechanizme vývoja Meflin plus CAF, regulácia rCAF by mohla byť novou terapeutickou stratégiou v protirakovinovej terapii.

4,3|Regeneračné funkcie

Hoci škodlivé účinky fibroblastov pritiahli výskumný záujem, ako je opísané v predchádzajúcej časti, fibroblasty tiež podporujú regeneráciu tkaniva v dôsledku poranenia. Inhibícia funkcie fibroblastov totiž nemusí nevyhnutne viesť k lepšiemu výsledku. Napríklad delécia Postn plus myofibroblastov v srdci bráni vhodnej tvorbe jaziev, čo vedie k ruptúre komôr a vyššej úmrtnosti.³²

Nedávne štúdie odhalili, že pri poranení a oprave tkaniva má špecifická subpopulácia fibroblastov regeneračné účinky vo viacerých mechanizmoch. V koži sú fibroblasty rozdelené do dvoch kategórií podľa lokalizácie: papilárne fibroblasty v hornej dermis a retikulárne fibroblasty v dolnej dermis.88 Po poranení sa retikulárne fibroblasty zverbujú do lézie pred migráciou papilárnych fibroblastov a vylučujú kolagény zodpovedné za tvorbu jaziev . Naproti tomu papilárne fibroblasty, ktoré sa zhromažďujú v neskoršom časovom bode po poranení, prispievajú k regenerácii vlasových folikulov. Tieto zistenia naznačujú, že priestorovo a funkčne odlišné podtypy fibroblastov prispievajú k regenerácii kožných rán koordinovaným spôsobom. Nedávna analýza scRNAseq tiež odhalila, že fibroblasty v kožných ranách vykazujú vysokú heterogenitu a možno ich klasifikovať do dvanástich subklastrov.89 Pseudotime a analýza rýchlosti RNA preukázali, že niektoré z týchto zhlukov predstavujú stavy diferenciácie smerom k kontraktilným fenotypom, zatiaľ čo iné získavajú regeneračné fenotypy. Je zaujímavé, že bola identifikovaná jedinečná subpopulácia kožných fibroblastov špecializovaných na opravu tkaniva po poranení. Po poranení kože fibroblasty nachádzajúce sa vo fascii, čo je želatínová membránová štruktúra oddeľujúca kožu a tuhú štruktúru pod ňou, stúpajú k povrchu kože.90 V reakcii na hlboké poranenia nasmerujú fibroblasty fascie svoju obklopujúcu kompozitnú matricu do rany a vytvárajú provizórna matica. Väčšina týchto "fasciálnych fibroblastov" je označená engrailed 1 (En1), ktorý bol prvýkrát identifikovaný ako marker buniek fibrogénnej línie v dorzálnej koži myší.⁹¹ Množstvo fasciálnych fibroblastov v rane pozitívne koreluje s hĺbkou jazvy. Genetická deplécia fibroblastov fascie skutočne zabraňuje nasmerovaniu matrice do rany a vedie k chybnému zjazveniu. Implantácia nepriepustného filmu pod kožu zabraňuje migrácii fibroblastov fascie a vedie k otvorenej jazve. Bol tiež opísaný príspevok ďalšej unikátnej podskupiny fibroblastov, adipocytových prekurzorových buniek (APS); AP interagujú s CD301b plus makrofágmi a prispievajú k regenerácii kože po poranení.⁹² Celkovo tieto zistenia naznačujú, že heterogénne subpopulácie fibroblastov so špecializovanými funkciami prispievajú k regenerácii kože po poranení.

Tieto "regeneračné fibroblasty" sú tiež pozorované vobličky. Ultramikroskopické pozorovanie odhalilo, že myofibroblasty migrujú okolo poškodených tubulov a štrukturálne ich podporujú v modeli poškodenia obličiek, čo naznačuje, že myofibroblasty môžu uľahčiť regeneráciu tubulárnych buniek.93 Použitím P0-Cre: DTR myší, ktorým sa podával difterický toxín (DT) vyčerpáva rezidentné fibroblasty značené líniou Cre v obličkách P0-, odhalili sme, že deplécia fibroblastov v skorej fáze poranenia oslabuje tubulárnu regeneráciu a zhoršuje poškodenie obličiek.⁹⁴ Je zaujímavé, že v reakcii na poškodenie fibroblasty upregulujú expresiu retinaldehyddehydrogenázy 2 (RALDH2), enzýmu obmedzujúceho rýchlosť syntézy kyseliny retinovej. Receptor kyseliny retinovej (RAR) je exprimovaný na proximálnych tubulárnych bunkách a B-kryštalín, produkt cieľových génov RAR, je upregulovaný výlučne v poškodených proximálnych tubulárnych bunkách. Inverzný agonista RAR tlmí proliferáciu tubulárnych buniek in vitro. Vzhľadom na to, že kyselina retinová vylučovaná stromálnym mezenchýmom v embryonálnomobličkyje nevyhnutný pre vývoj ureterického pupene,^95,96tieto zistenia naznačujú, že RALDH2 plus myofibroblasty môžu hrať dôležitú úlohu pri regenerácii poškodených proximálnych tubulov prostredníctvom signalizácie kyseliny retinovej v skorej fáze poranenia.