Otcovský nikotín zlepšuje pamäť strachu, znižuje podávanie nikotínu a mení hipokampálne genetické a nervové funkcie u potomstva

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Lisa R. Goldberg1*|Dana Zeid1*|Munir Gunes Kutlu2|Robert D. Cole3|Valeria Lallai4|Aswathy Sebastian5|Istvan Albert5|Christie D. Fowler4|Vinay Parikh6|Thomas J. Gould1

1Department of Biobehavioral Health, Penn State University, University Park, Pennsylvania

2Katedra farmakológie, Vanderbilt School of Medicine, Nashville, Tennessee

3 College of Pharmacy, University of Kentucky, Lexington, Kentucky

4Katedra neurobiológie a správania, Kalifornská univerzita Irvine, Irvine, Kalifornia

5Bioinformatika, biochémia a molekulárna biológia, Penn State University, University Park, PA

6Katedra psychológie, Temple University, Philadelphia, Pennsylvania

Abstraktné

Užívanie nikotínu je naďalej vysoko rozšírené v prípade tabaku a elektronických cigariet konzumovaných na celom svete. Rastúce dôkazy o transgeneračnej epigenetickej dedičnosti však naznačujú, že užívanie nikotínu môže zmeniť správanie a neurobiológiu v nasledujúcich generáciách. Testovali sme účinky chronickej expozície otcovského nikotínu u myší C57BL6/J na podmienenie strachu u potomkov F1 a F2, ako aj podmienené vyhynutie strachu a spontánne zotavenie, samopodávanie nikotínu, hipokampálne cholinergné fungovanie, expresiu RNA a metyláciu DNA v F1. potomstvo. Expozícia otcovského nikotínu bola spojená so zvýšeným kontextovým a stimulovaným podmieňovaním strachu a spontánnym obnovením spomienok na uhasený strach. Ďalej, posilnenie nikotínu bolo znížené u myší s nikotínom, ako bolo hodnotené v paradigme samopodania. Tieto behaviorálne fenotypy boli spojené so zmenenou odpoveďou na nikotín, upregulovanou väzbou hipokampálneho nikotínového acetylcholínového receptora, zníženými evokovanými hipokampálnymi cholinergnými prúdmi a zmenenou metyláciou a expresiou hipokampálnych génov súvisiacich s nervovým vývojom a plasticitou. Analýza génovej expresie naznačuje viacgeneračné účinky na širšie génové siete potenciálne zapojené do neuroplasticity a duševných porúch. Zmeny v podmieňovaní strachu podobne naznačujú fenotypy podobné úzkostným poruchám podobným posttraumatickému stresu.

KĽÚČOVÉ SLOVÁ: cholinergné, hippocampus, učenie, multigeneračné, nikotínové, transgeneračné

účinky cistanche

1. ÚVOD

Hromadné dôkazy naznačujú, že vplyv vystavenia drogám presahuje jednotlivca a ovplyvňuje fyziologické a behaviorálne fenotypy u neexponovaných potomkov.1-3 Charakterizácia účinkov nikotínu naprieč generáciami je rozhodujúca vzhľadom na prevalenciu užívania tabakových výrobkov4 a dramatický nárast používania elektronických cigariet.5 Prostredníctvom svojich účinkov na mozgové cholinergné systémy spôsobuje expozícia nikotínu výrazné zmeny vo funkcii mozgu, ktoré môžu byť základom závislosti na nikotíne a prispievať k zvýšenému riziku psychiatrických porúch vrátane depresie6 a úzkosti.7 Epigenetické modifikácie po cholinergnej aktivácii môžu umožňujú pretrvávajúce účinky na bunkovú a obvodovú funkciu.8,9 Až donedávna sa verilo, že tieto epigenetické modifikácie boli vymazané po vytvorení zárodočnej línie, a teda sekvestrované z nasledujúcich generácií. Avšak epigenetické modifikácie, vrátane metylácie DNA, histónových posttranslačných modifikácií a nekódujúcich RNA, získané v jednej generácii, môžu byť zdedené v ďalšej generácii.10,11 Tieto epigenetické modifikácie môžu sprostredkovať multigeneračné a transgeneračné účinky expozície rodičovského nikotínu na správanie a neurobiológiu potomstva. .

Štúdie na hlodavcoch z viacerých nezávislých laboratórií začali identifikovať viacgeneračné a transgeneračné dôsledky vystavenia rodičov nikotínu. Táto práca doteraz identifikovala účinky vystavenia rodičov nikotínu na depresívne a úzkostné fenotypy,1 kognitívnu flexibilitu,2 správanie podobné poruche pozornosti a hyperaktivite (ADHD)3 a génovú expresiu.1,2 Viacgeneračné a transgeneračné dôsledky Expozícia nikotínu môže ovplyvniť endofenotypy zapojené do závislosti od nikotínu a duševného zdravia. Napríklad sme ukázali, že vystavenie nikotínu moduluje kontextové podmieňovanie strachu, model učenia strachu závislého od hipokampu, ktorý súvisí so zraniteľnosťou voči poruchám duševného zdravia, ako je posttraumatická stresová porucha (PTSD) a závislosť.{5}} Nikotín účinky na kontextové učenie strachu moduluje hipokampus.15,16 Zistili sme, že akútna expozícia nikotínu zvyšuje učenie sa strachu závislého od hipokampu,15,17 zhoršuje zánik kontextového strachu18,19 a zvyšuje spontánne zotavenie kontextového strachu po zániku.18 Viacgeneračné a transgeneračné účinky expozície nikotínu zo strany otca na tieto fenotypy sa však neskúmali. Okrem toho žiadne predchádzajúce štúdie necharakterizovali viacgeneračné účinky nikotínu na cholinergnú funkciu. Viacgeneračná dedičnosť sa vzťahuje na fenotypy vznikajúce v generácii bezprostredne po exponovaných jedincoch, zatiaľ čo transgeneračná dedičnosť pozostáva z dedičnosti epigenetických informácií medzi generáciami sprostredkovanej zárodočnou líniou pri absencii priamych environmentálnych vplyvov, ktoré vedú k fenotypovej variácii.11 Tu sme skúmali obe viacgeneračné a transgeneračné účinky otcovskej expozície nikotínu na kontextové a cudlé učenie strachu v generácii F1 a F2, ako aj na samopodávanie nikotínu, väzbu hipokampálneho nikotínového acetylcholínového receptora (nAChR), hipokampálne cholinergné fungovanie, expresiu hipokampálnych génov a metyláciu hipokampálnej DNA v generácie F1. Predpokladáme, že otcovská expozícia nikotínu ovplyvní kondicionovanie strachu, expresiu hipokampálnych génov a funkciu u potomkov a vnukov.

účinky extraktu cistanche

2 METÓDY A MATERIÁLY

2.1 Predmety

Subjektmi boli samce a samice myší C57BL/6J (vo veku 8-20 týždňov, Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). S výnimkou ustajnenia na chov v háreme boli všetky zvieratá ustajnené v skupinách s 12-hodinovým cyklom svetlo/tma a ad libitum prístupom k potrave a vode. Počas samopodávania mali subjekty jedlo obmedzené na 85 percent až 90 percent ich voľnej telesnej hmotnosti a voda im bola poskytovaná ad libitum. Všetky behaviorálne testy sa uskutočnili medzi 9:{8}} AM a 18:{10}} PM. Všetky postupy boli vykonané v súlade s NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals a schválené výbormi Penn State University, Temple University alebo University of California Irvine IACUC.

2.2 Expozícia nikotínu zo strany otca

Muži (8 týždňov) dostávali 0,9 percent sterilný fyziologický roztok alebo nikotín hydrogéntartarát (12,6 mg/kg/deň, voľná základná hmotnosť – Fisher Scientific, Waltham, MA alebo MP Biomedical, Santa Ana, CA) rozpustený v 0,9 percent sterilný fyziologický roztok, podávaný subkutánne pomocou osmotických minipúmp (Alzet, Model 1004, Durect, Cupertino, CA) počas 28 dní. Táto dávka vytvára plazmatické hladiny nikotínu a kotinínu porovnateľné s hladinami pozorovanými u stredne silných fajčiarov.20,21

2.3 Generovanie myší F1 a F2

Polčas nikotínu u myší je približne 6 minút.22 Už predtým sa ukázalo, že účinky abstinencie od nikotínu sa rozplynú 4 dni po odstránení nikotínu.23-25 Preto je medzi liečbou nikotínom a šľachtenie bolo zavedené na zabezpečenie systémovej eliminácie nikotínu pred šľachtením. Samce myší boli umiestnené do klietok s dvoma naivnými samicami C57BL/6 J (vo veku 8-20 týždňov) na 2 týždne, aby sa vytvorilo potomstvo F1. F2 myši boli generované párením naivných samcov F1 myší s naivnými samicami.

2.4 Podmieňovanie strachu

Postupy podmieňovania strachu a vyhynutia boli podrobne opísané už skôr.19 Stručne povedané, myši boli trénované a testované v komorách na tlmenie hluku (18,8 × 20 × 18,3 cm, 65 dB hluk pozadia; MED Associates, St. Albans, VT). Myši F1 a F2 boli podmienené strachom pomocou dvoch párov podmienených stimulov (CS, 30 s, 85‐dB biely šum) – nepodmieneného stimulu (USA, 2 s, 0,57‐mA šoky do nohy) oddelených 120 sekundami. Na preskúmanie akútnych účinkov nikotínu na kondicionovanie strachu u myší F1 a F2 dostali potomkovia akútny nikotín (0,09 mg/kg, hmotnosť voľnej bázy NIC, ip; hydrogéntartarát nikotínu, Fisher Scientific) alebo fyziologický roztok (SAL) 2 až 4 minúty pred na školenia a testovanie. Dvadsaťštyri hodín po tréningu sa myši vrátili do tréningového kontextu na 5 minút, aby sa vyhodnotilo kontextové zmrazenie. Po kontextovom testovaní boli myši umiestnené do odlišných komôr, aby sa vyhodnotilo učenie vyvolané strachom. Experimentátori zaslepení voči podmienkam hodnotili zmrazenie, definované ako neprítomnosť dobrovoľného pohybu okrem dýchania, prostredníctvom metódy nezaujatého časového vzorkovania.19 Na preskúmanie potenciálnych efektov stropu počas testovania na podnety dostala samostatná kohorta myší F1 rovnaký tréning len s jedným CS‐US Skúmalo sa aj párovanie a kontextové vyhynutie strachu a spontánne zotavenie. Vyhasnutie strachu sa vyskytlo počas piatich po sebe nasledujúcich sedení, ktoré sa začali deň po kontextovom testovaní a testovaní strachu. Po záverečnej relácii vyhynutia boli myši ponechané nerušené vo svojich domácich klietkach počas 7 dní a potom znova testované v kontexte tréningu na spontánne zotavenie. Aby sa zistilo, či nejaké pozorované rozdiely v podmieňovaní strachu boli spôsobené rozdielmi v citlivosti na šok, úzkosťou alebo širšími poruchami učenia, samce a samice zvierat NIC- a SAL-Sired boli dodatočne testované v otvorenom poli, citlivosť na šok, zvýšené plus bludisko ( EPM) a nové paradigmy rozpoznávania objektov (úplné metódy a výsledky nájdete v podporných informáciách).

2.5 Jedlo a intravenózna aplikácia nikotínu

A separate cohort of adult SAL‐Sired and NIC‐Sired F1 mice were used for food and nicotine self‐administration studies. Beginning at 6 weeks of age, male F1 mice were weighed, mildly food‐restricted to 85% to 90% of their free‐feeding body weight, and then trained to press a lever in an operant chamber (Med Associates) for food chow pellets (20 mg; TestDiet, Richmond, IN) under a fixed‐ratio 5, time out 20 seconds (FR5TO20 sec) schedule of reinforcement (see Supporting Information for full methods). Once stable responding was achieved (>25 peliet na reláciu počas troch nasledujúcich relácií), subjekty boli katetrizované do krčnej žily v anestézii izofluránom (1 % ‐ 3 %)/kyslíkovými parami, ako bolo opísané vyššie. znova odpovedať za odmenu za jedlo. Obnovenie reakcie na potravu zaisťuje, že myši sa dostatočne zotavili po intravenóznom chirurgickom zákroku a vykazovali normálnu reakciu operanta po oneskorení prístupu do komôr operanta. Myšiam bolo potom umožnené, aby si sami intravenózne (IV) aplikovali nikotín počas 1-hodinových denných sedení, 6 až 7 dní v týždni (sol nikotín hydrogéntartrátu rozpustený v 0,9 percentnom sterilnom fyziologickom roztoku, {{1{101} {12}}}}.03 mg/kg/infúzia, voľná základná hmotnosť; MP Biomedical, Santa Ana, CA). IV nikotín bol dodávaný injekčnou pumpou Razel (Med Associates). Každá relácia mala dve zasúvateľné páky (jedna aktívna, jedna neaktívna). Splnenie kritérií odozvy na aktívnej páke viedlo k podaniu IV nikotínovej infúzie (0.{{20}}objem infúzie 3 ml; plán FR5TO20 s). Odozvy na neaktívnej páke boli zaznamenané, ale nemali žiadne plánované následky. Po ôsmich akvizičných reláciách pri 0,03 mg/kg/infúzia sa infúzna dávka zmenila na 0,1 mg/kg/infúziu počas šiestich relácií. Pre každú dávku sa na štatistické analýzy použil priemerný príjem z posledných troch sedení. Katétre sa denne preplachovali fyziologickým sterilným fyziologickým roztokom (0,9 % hmotn./obj.) obsahujúcim heparín (100 USP jednotiek/ml). Priechodnosť katétra bola overená Brevitalom (metohexital sodný, Eli Lilly, Indianapolis, IN) po fáze samopodania nikotínu. Na posúdenie správania súvisiaceho s relapsom boli myši testované na inkubáciu túžby po relácii bezprostredne po poslednej 0,1 mg/kg/infúznej dávke IV nikotínu, ktorú si sami podali; v tomto postupe je myšiam umožnené reagovať na aktívnu páku, ale nedostávajú žiadne infúzie nikotínu. Na prvej základnej inkubačnej relácii (deň 1) sa myši umiestnili do operačných komôr podľa plánu FR5TO20 s s podmienenou aktiváciou signálneho svetla. Potom boli myši umiestnené v domácich klietkach na 20 dní. Na 21. deň abstinencie boli myši vyšetrené na inkubáciu túžby, pričom aktívne pákové signálne svetlo bolo dodávané podľa plánu FR5TO20 s. Štúdie boli vykonané experimentátormi zaslepenými voči skupinovým podmienkam a behaviorálne reakcie boli automaticky zaznamenané softvérom MedAssociates.

2.6 Väzba na nikotínový acetylcholínový receptor

Rádioligandový väzbový test16 sa uskutočnil pomocou hipokampov z 8 týždňov starých myší NIC-Sired (5 M a 10F) a SAL-Sired (9 M a 6F) F1. Vzorky boli homogenizované s použitím lyzačného pufra (5 mM Tris plus 5 mM EDTA plus 5 mM EGTA), centrifugované pri 100 000 g počas 30 minút pri 4 stupňoch, resuspendované v lyzovacom pufri a znovu centrifugované. Pelety boli resuspendované v Tris/10 percentnom sacharózovom pufri a inkubované s [3H] epibatidínom ([3H]EB) (~2 nM na základe27,28) (špecifická aktivita 54,1 Ci/mmol, PerkinElmer, Boston, MA) počas 1 hodinu pri izbovej teplote. [3H]EB bol vybraný na väzbu nAChR, pretože predchádzajúce výsledky ukázali, že hipokampálne heteromérne 4 2 nAChR sprostredkúvajú účinky nikotínu na podmieňovanie strachu.17 Nešpecifická väzba sa hodnotila v prítomnosti 300 μM nikotínu (soli hydrogentartrátu nikotínu rozpustené v Tris pufri, koncentrácia voľnej bázy). nAChR naviazané na [3H]EB boli filtrované (24-jamkový zberač buniek, Brandel Co, Gaithersburg, MD) a kvapalinovým scintilačným počítačom (Tri‐Carb 2810 TR, Perkin Elmer, Boston, MA) sa merala rádioaktivita filtra. Špecifická väzba vyjadrená ako fmol/mg tkaniva bola vypočítaná ako rozdiel medzi celkovou a nešpecifickou väzbou.16

2.7 Amperometrické cholinergné záznamy in vivo

Samostatná kohorta naivných 10- až 20-týždňových myší NIC-Sired a SAL-Sired F1 sa použila na vyhodnotenie zmien v hipokampálnom cholinergnom prenose pomocou amperometrie. Keramické mikroelektródy (Center for Microelectrode Technology, Lexington, KY), so 4 (15 × 333 μm) platinovými záznamovými miestami usporiadanými do párov (horné a spodné), boli potiahnuté cholínoxidázou (EC číslo 1.1.3.17; Sigma‐ Aldrich, St. Louis, MO), ako už bolo uvedené.29 Elektródy sa elektropolymerizovali s meta-fenyléndiamínom (m-PD; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), aby sa zvýšila selektivita na detekciu cholínových prúdov. Mikroelektródy s citlivosťou vyššou alebo rovnou 3 pA/μM a limitom detekcie menším alebo rovným 400 nM pre cholín sa použili na poskytnutie citlivého indexu uvoľňovania acetylcholínu (ACh).30 Zvieratá boli anestetizované uretánom (1,2‐1,5 g/kg, ip) a enzýmom potiahnuté mikroelektródy boli stereotaxicky znížené na dorzálne (A/P ‐1,7 mm, M/L ± 1,5 mm, D/V ‐2,3 mm) alebo ventrálne (A/P ‐3,1 mm, M /L ± 3,0 mm, D/V −4,3 mm) hipokampus. Ventrálny a dorzálny hipokampus boli hodnotené oddelene, pretože rozdielne prispievajú ku kontextovému podmieňovaniu strachu: ventrálny hipokampus (vHPC) má významnejšiu úlohu v asociácii a prejave strachu, zatiaľ čo dorzálny hipokampus (DHCP) je rozhodujúci pre kontextovú pamäť.31 Ag/ Referenčné elektródy AgCl boli implantované do kontralaterálneho rostrálneho kortexu.

Amperometrické záznamy sa uskutočňovali pri 2 Hz aplikovaním fixného potenciálu plus 0,7 V a údaje sa digitalizovali (potenciostat FAST-16, Quainton, Nicholasville, KY). Prúdy pozadia sa stabilizovali počas 60 minút, potom sa lieky aplikovali do hipokampu pomocou sklenenej kapiláry (priemer hrotu: 15 μm) pripojenej k elektróde. Uvoľňovanie ACh vyvolané depolarizáciou sa meralo aplikáciou buď krátkych pulzov draslíka (KCl 70 mM; 100 NL) alebo NIC (1 mM voľná báza, tartrát nikotínu; 100 NL) pri 2 až 10 psi každé 2 minúty. Záznamy boli vyvážené pre oblasť hipokampu (dorzálnu alebo ventrálnu) a liečivo (draslík alebo NIC). Amplitúdy cholínového signálu boli merané zmenou prúdu na enzýmom potiahnutom kanáli od základného prúdu a prevedené na μM ekvivalenty cholínu na základe in vitro kalibrácie. Samoreferencovanie bolo prijaté na elimináciu artefaktov odčítaním prúdov zo sentinelových kanálov.29 Umiestnenie mikroelektródy bolo overené farbením koronálnych hipokampálnych rezov podľa Nissla (obrázok S1). Na štatistickú analýzu sa použili priemery dvoch odpovedí na manipuláciu s liekom na zviera.

2.8 Štatistická analýza

Štatistické porovnania boli vykonané pomocou SPSS (IBM, Armonk, NY) alebo GraphPad Prism (La Jolla, CA, USA). Odľahlé hodnoty boli určené hodnotami o 2 štandardné odchýlky nad priemerom. Ak bola zistená odľahlá hodnota, informácie sú zahrnuté v sekcii výsledkov. Kritérium významnosti bolo nastavené na=0,05. Na začiatku sa uskutočnila štatistická analýza zahŕňajúca pohlavie ako faktor pre všetky experimenty testujúce potomstvo mužov aj žien. Analýzy sa zrútili naprieč pohlavím, keď sa nezistili trojstranné alebo obojstranné interakcie s pohlavím (P > 0,05). Údaje sa analyzovali pomocou t-testu, 1-cestnej alebo 2-cestnej ANOVA, podľa potreby. Po významných hlavných alebo interakčných účinkoch nasledovali LSD post hoc porovnania. Po opakovaných meraniach ANOVA nasledovalo Bonferroniho post hoc porovnanie s korekciou pre viacnásobné porovnania. Ak sa zistili nerovnaké odchýlky, použil sa Welchov t-test pre nerovnaké odchýlky a stupne voľnosti sa zaokrúhlili nadol.

2.9 Izolácia RNA/DNA

Dospelé myši F1 (vo veku 8 týždňov; n=3 M a 3 F na skupinu) boli usmrtené cervikálnou dislokáciou. Hipokampy boli rýchlo rozrezané na ventrálne a dorzálne časti (v pomere 1:1), zlúčené z ľavej a pravej strany a rýchlo zmrazené na suchom ľade. DNA a RNA sa spoločne izolovali a purifikovali pomocou súpravy AllPrep DNA/RNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA). Koncentrácia a kvalita RNA a DNA sa hodnotili pomocou NanoDrop2000 (NanoDrop, Wilmington, DE) a Agilent Bioanalyzer (Agilent, Santa Clara, CA). Pre extrakcie RNA bolo minimálne číslo integrity RNA (RIN) 8,5.

2.10 Analýza transkriptómu prostredníctvom

Knižnice na sekvenovanie RNA pripravil Huck Institutes of Life Sciences Genomics Core Facility (Penn State University) pre 150 bp jedno-endové čítanie pomocou súpravy Illumina TruSeq Stranded mRNA Library Prep Kit (Illumina, San Diego, CA) a sekvenované na Illumina HiSeq 2500 v režime rýchleho spustenia (tri po sebe idúce série s približne 10 miliónom čítaní na vzorku). Súbory FASTQ boli skontrolované prostredníctvom FASTQC a mali priemerné skóre kvality Phred na čítanie vyššie ako 30 (tj menej ako 0,1 percenta chyby sekvenovania). Súbory FASTQ boli zarovnané s myšacím referenčným genómom (mm10; UCSC Genome Browser) pomocou TopHat (v2.1.0)32 na Galaxy Project33. Manžetové gombíky a Cuffmerge (v2.2.1.0)34 sa použili na zostavenie prepisov z mapovaných čítaní a zlúčenie súborov prepisov na konečné zostavenie prepisu. Hodnoty P upravené pre mieru falošného objavenia (FDR) sa vypočítali pre rozdielnu génovú expresiu zo vzoriek NIC-Sired a SAL-Sired pomocou Cuffdiff (v2.2.1.3),34 so štandardným limitom FDR 0,05,35 boli uložené súbory údajov transkriptómu do omnibusu génovej expresie.

2.11 Analýza obohatenia

Diferenciálne exprimované gény sa analyzovali pomocou analýzy dráhy vynaliezavosti (IPA, spustenie v decembri 2018; www.qiagen.com/ingenuity; Qiagen, Redwood City, CA, USA)36 s cieľom odhaliť potenciálne obohatenie asociatívnych biologických sietí. Parametre behu špecifikovali maximálne 35 molekúl na génovú sieť a analýzu obmedzili na tkanivo CNS alebo bunkové línie cicavcov. Štatistická významnosť pre obohatenie sa určila pomocou pravostranného Fisherovho presného testu korigovaného na viacnásobné testovanie.

2.12 Cielené bisulfitové sekvenovanie

DNA koizolovaná s RNA (pozri časť 2.9) sa použila na analýzu metylácie DNA. RNA-seq identifikovala 952 a 162 odlišne exprimovaných génov vo vHPC a DHCP. 1010 jedinečných génov z týchto kombinovaných zoznamov sa vybralo na obohatenie bisulfitovým-seq pomocou vlastného systému SeqCap Epi Enrichment System (Roche, Pleasanton, CA, USA; tabuľka S1).38 Cielené bisulfitové sekvenovanie sa uskutočnilo v Penn State Huck Institute of Life Sciences Genomics Core Facility. Knižnice boli skonštruované s použitím súpravy KAPA Hyper Prep (Kapa Biosystems, Wilmington, MA). Knižnice konvertované hydrogensiričitanom sodným sa amplifikovali a obohatili o vybrané genómové oblasti pomocou vlastnej sady zachytávacích sond (SeqCap Epi Choice Probes; Roche, Pleasanton, CA, USA). Zachytená DNA bola sekvenovaná na Illumina HiSeq 2500 pomocou 100 nt párovaných koncov. Súbory FASTQ boli skontrolované prostredníctvom FASTQC. Sekvencie adaptérov Illumina sa odstránili a bázy nízkej kvality sa orezali pomocou Trimmomatic.39 Nekvalitné orezanie základne sa uskutočnilo pomocou posuvného okna, orezanie, keď priemerná kvalita v rámci okna so štyrmi pármi báz klesla pod prah 20, s minimálna dĺžka čítania 35. Po orezaní mali súbory FASTQ priemerné skóre kvality Phred na čítanie väčšie ako 30 (tj menej ako 0,1 percenta chyby sekvenovania). Orezané hodnoty boli mapované do myšacieho referenčného genómu (mm10) pomocou Bowtie240 implementovaného v Bismark. 41 Metyl{20}}extrakt v Bismark sa použil na extrakciu informácií o metylácii CpG a na vytvorenie správ o metylácii. MethylKit42 sa použil na analýzu diferenciálne metylovaných oblastí (DMR). Stav metylácie bol zhrnutý cez neprekrývajúce sa okná s 500 pármi báz a bola vykonaná diferenciálna metylačná analýza so štandardným FDR 0,05,35. Súbory údajov boli uložené do Gene Expression Omnibus.

Prínos extraktu z cistanche

3 VÝSLEDKY

3.1 Otcovský nikotín zvyšuje kontextové kondicionovanie strachu a obracia akútne nikotínové zosilnenie kontextového kondicionovania strachu u myší generácie F1 a F2

Samce a samice myší NIC-Sired a SAL-Sired F1 boli po akútnom podaní SAL alebo NIC podmienené strachom (0.09 mg/kg ip, obrázok 1A). Kompletná analýza základnej línie, pred-CS a zmrazenia CS je zahrnutá v podporných informáciách. 3-cestná ANOVA kontextového zmrazenia s liečbou otca, akútnou liečbou liekom a pohlavím ako faktormi odhalila významnú interakciu otec × akútna liečba liekom (F(1,36)=32.75, P <.{{27 }}01).="" pretože="" nedošlo="" k="" žiadnej="" významnej="" interakcii="" medzi="" pohlavím="" a="" otcom="" alebo="" akútnou="" liečbou="" liekom,="" vykonala="" sa="" dvojcestná="" anova="" kolabovaná="" naprieč="" pohlavím="" a="" odhalila="" významnú="" interakciu="" medzi="" liečbou="" a="" akútnou="" liečbou="" liekom="" (f(1,40)="20.96" ,="" p="">< 0,001).="" post="" hoc="" porovnania="" ukázali,="" že="" myši="" nic-sired="" f1="" liečené="" fyziologickým="" roztokom="" vykazovali="" rozšírené="" kontextové="" podmieňovanie="" strachu="" v="" porovnaní="" s="" myšami="" sal-sired="" f1="" liečenými="" fyziologickým="" roztokom="" (t20="2" 0,73,="" p="">< 0,05).="" v="" súlade="" s="" predchádzajúcimi="" zisteniami43="" akútna="" nic="" v="" dávke="" 0,09="" mg/kg="" vyvolala="" u="" myší="" sal-sired="" zvýšené="" kontextové="" podmieňovanie="" strachu="" (t22="20,99," p="">< 0,01).="" avšak="" akútna="" nic="" v="" dávke="" 0,09="" mg/kg="" zhoršila="" kontextové="" podmieňovanie="" strachu="" u="" myší="" splodených="" nic="" (t18="30,36," p="">< 0,01).="" celkovo="" boli="" hladiny="" kontextového="" zmrazenia="" u="" myší="" nic-sired="" nic="" porovnateľné="" s="" hladinami="" pozorovanými="" u="" myší="" sal-sired="" sal="" pri="" 0,09="" mg/kg="" (p=""> 0,05).

Okrem toho sa samce a samice zvierat NIC- a SAL-Sired testovali na citlivosť na šok (obrázok S2), zvýšené plus bludisko (EPM, obrázok S3), otvorené pole a nové paradigmy rozpoznávania objektov (obrázok S4, úplné metódy nájdete v časti Podporné informácie a výsledky). S výnimkou samíc NIC-Sired v EPM (ktoré vykazovali zvýšené správanie podobné úzkosti) a zvierat NIC-Sired s citlivosťou na šok (ktoré vykazovali zníženú hlasovú reaktivitu na šok, čo by nezmiatlo zvýšený viacgeneračný fenotyp učenia strachu), žiadne rozdiely boli zistené medzi myšami NIC- a SAL-Sired.

OBRÁZOK 1 Otcovský nikotín zosilňuje kontextové podmieňovanie strachu a zmierňuje akútne nikotínové zosilnenie podmieňovania strachu. Kontextové zmrazenie bolo významne vyššie v kontrolách NIC-Sired plus SAL v porovnaní s kontrolami SAL-Sired plus SAL. Akútny nikotín v dávke 0,09 mg/kg zvýšil kontextové podmieňovanie strachu u SAL-Sired, ale významne znížil kontextové podmieňovanie strachu u zvierat NIC-Sired (n=10-12 na skupinu). B, Kontextové zmrazenie bolo signifikantne vyššie u NIC-starý otec plus SAL v porovnaní s SAL-starý otec plus SAL kontrol (n=9-11 na skupinu). Chybové stĺpce označujú štandardnú chybu priemeru (SEM), *P <>

Aby sa určilo, či narušené kontextové kondicionovanie strachu pokračovalo do ďalšej generácie (F2), samce a samice myší F2 NIC-starého otca a SAL boli vyšľachtené z naivných samcov myší F1. Kompletná analýza základnej línie, pred-CS a zmrazenia CS je zahrnutá v podporných informáciách. Uskutočnila sa 3-cestná ANOVA kontextového zmrazenia s liečbou prarodičov, akútnou liečbou drogami a pohlavím ako nezávislými faktormi (obrázok 1B). Pretože nedošlo k žiadnej významnej interakcii medzi pohlavím a otcom alebo akútnou liečbou liekom, vykonala sa 2-cestná ANOVA kolabovaná naprieč pohlavím. Zistil sa významný hlavný účinok otca (F(1,37)=9.88, P <.01) a="" post="" hoc="" porovnania="" ukázali,="" že="" myši="" nic-starého="" otca="" vykazovali="" rozšírené="" kontextové="" podmieňovanie="" strachu="" v="" porovnaní="" s="" sal-starými="" myšami="" (t39="3,04," p="">< 0,01).="" okrem="" toho="" myši="" sal-starého="" otca,="" ktorým="" bola="" podávaná="" akútna="" nic,="" mali="" zosilnené="" kontextové="" podmieňovanie="" strachu="" (t19="2.41," p="0.026)," ale="" akútne="" nic="" nezvýšilo="" kontextové="" podmieňovanie="" strachu="" u="" myší="" nic-starého="">

OBRÁZOK 2 Otcovský nikotín zvyšuje podmieňovanie vyvolaného strachu a spontánne obnovenie pamäte strachu. Aby sa preskúmali potenciálne efekty stropu počas testovania na podnet, samostatná kohorta myší F1 dostala rovnaký tréning iba s jedným párovaním CS-US. Kontextové aj stimulované podmieňovanie strachu bolo rozšírené u myší NIC-Sired v porovnaní s myšami SAL-Sired trénovanými s 1 párovaním CS-US (n=8-10 na skupinu). B, Otcovská expozícia nikotínu neovplyvnila zánik kontextového strachu, ale zlepšila spontánne obnovenie pamäte strachu 7 dní po poslednej relácii zániku (n=8‐10 na skupinu). Chybové stĺpce označujú štandardnú chybu priemeru (SEM), *P <>

3.2 Otcovský nikotín zvyšuje u myší F1 generácie kondicionovanie vyvolaného strachu

Aby sa preskúmalo, či stropný efekt zabránil detekcii rozdielov medzi skupinami pri podmieňovaní strachu (pozri Podporné informácie), bola oddelená skupina myší F1 trénovaná s jedným párovaním CS-US. V tejto kohorte sa u myší NIC-Sired (t6=2 0,41, P < 0,05)="" zistilo="" zlepšenie="" kontextového="" podmieňovania="" strachu="" (t7="3.21," p="">< 0.05),="" ako="" aj="" podmieňovania="" vyvolaného="" strachom.="" 05,="" obr.="">

3.3 Otcovský nikotín zlepšuje spontánne obnovenie kontextovej pamäte strachu u myší F1 generácie

Kohorta myší F1, ktorá dostala jedno párovanie CS-US, bola následne testovaná na vyhynutie a spontánne obnovenie kontextovej pamäte strachu. Myši F1 NIC-Sired vykazovali normálne vyhynutie strachu, ale vykazovali zlepšenú spontánnu obnovu kontextovej pamäte strachu v porovnaní s myšami SAL-Sired (t7=3.38, P < 0.05;="" obrázok="">

3.4 Paternálny nikotín znižuje samoaplikáciu nikotínu

Pred tréningom na samopodávanie nikotínu boli subjekty analyzované na ich schopnosť naučiť sa operatívnu úlohu na získanie odmeny za jedlo a neboli pozorované žiadne rozdiely (podporné informácie, obrázok S5). Aby sa otestovali potenciálne účinky expozície nikotínu u otca na posilnenie nikotínu u potomstva F1, získanie IV samoaplikácie nikotínu (0,03 mg/kg/infúzia) bolo hodnotené v 2-cestnom zmiešanom dizajne ANOVA, ktorý identifikoval hlavný účinok relácie (F(7,119)=13,60, P < .001)="" a="" interakcia="" sedenia="" ×="" ošetrenie="" otca="" (f(7,119)="5,00," p="">< 0,001).="" post="" hoc="" testy="" však="" neodhalili="" žiadne="" štatisticky="" významné="" rozdiely="" medzi="" skupinami="" na="" každej="" z="" ôsmich="" akvizičných="" relácií="" (obrázok="" 3a).="" potom="" sa="" analyzoval="" počet="" aktívnych="" a="" neaktívnych="" stlačení="" páky,="" aby="" sa="" určilo,="" či="" si="" skupiny="" počas="" akvizície="" zachovali="" preferenciu="" aktívnej="" páky="" naprieč="" reláciami="" (obrázok="" 3b),="" čo="" identifikovalo="" hlavný="" účinok="" relácie="" (f(7,238)="" {{20}="" },18,="" p="">< 0,001)="" a="" interakcia="" relácia="" ×="" liečba="" otca="" (f(21,238)="11" 0,40,="" p="">< 0,001).="" post="" hoc="" analýza="" odhalila,="" že="" skupiny="" sa="" líšili="" v="" prvý="" deň="" samoaplikácie="" nikotínu.="" skupina="" nic-sired="" vykazovala="" väčšie="" aktívne="" stlačenie="" páky="" v="" porovnaní="" so="" skupinou="" sal-sired.="" tento="" účinok="" môže="" predstavovať="" buď="" vyššiu="" úroveň="" správania="" pri="" hľadaní="" lieku="" v="" prvý="" deň="" expozície,="" vytrvalosť="" v="" reakcii="" na="" odmenu="" za="" jedlo="" a/alebo="" zníženú="" kognitívnu="" flexibilitu="" pri="" prechode="" reakcie="" z="" jedla="" na="" liek.="" tento="" rozdiel="" však="" nepretrval="" počas="" ďalších="" relácií.="" myši="" sal-sired="" vykazovali="" konzistentnú="" štatisticky="" významnú="" preferenciu="" aktívnej="" páky="" pred="" ich="" neaktívnou="" pákou="" (post="" hoc="" p="">< 0,01),="" ale="" myši="" nic-sired="" nevykazovali="" túto="" udržiavanú="" preferenciu="" pre="" relácie="" 3="" až="">

OBRÁZOK 3 Paternálny nikotín znižuje samoaplikáciu nikotínu. Samce myší NIC‐ a SAL‐Sired (n=9‐10 na skupinu) sa nelíšili v celkovom počte infúzií získaných za každú reláciu počas akvizičného obdobia dňa 0 0,03 mg/kg/dávka infúzie. B, Počas akvizície sa počet aktívnych a neaktívnych stlačení páčky pri prvej relácii výrazne líšil, pričom nikotín myší NIC-Sired vykazoval väčší počet aktívnych stlačení páčky v porovnaní s myšami SAL-Sired. Počas nasledujúcich relácií však myši NIC-Sired znížili reakciu, čo viedlo k žiadnym významným rozdielom medzi ich aktívnym a neaktívnym počtom stlačení páky v rámci relácií 3 až 8. Na rozdiel od toho zvieratá SAL-Sired vykazovali konzistentnú štatisticky významnú preferenciu pre aktívnu páku cez ich neaktívnu páku. C, Priemerný počet infúzií nikotínu počas posledných troch akvizícií sa významne nelíšil medzi myšami NIC- a SAL-Sired. D, Pri miernej dávke 0,1 mg/kg/infúziu si myši NIC‐Sired samostatne podávali významne nižší počet infúzií nikotínu. E, Inkubácia hodnotenia túžby odhalila významné zvýšenie odozvy na predtým aktívnej páke po 21 dňoch abstinencie - iba u myší SAL-Sired. Chybové stĺpce označujú štandardnú chybu priemeru (SEM), *P <>

Na ďalšie skúmanie potenciálnych rozdielov v skupinách pri kontrole variability počas počiatočnej fázy akvizície sa skúmal priemerný počet infúzií nikotínu počas posledných troch sedení, čo je čas, v ktorom subjekty vykazovali konzistentnejšie reakcie na nikotín (obrázok 3C). Skupiny sa významne nelíšili v priemernom počte infúzií nikotínu (P > 05). Potom boli myši prevedené na dávku nikotínu 0,1 mg/kg/infúziu, ktorá sa predtým ukázala ako preferovaná u dospelých myší C57BL6/J.44 Pri tejto dávke si myši NIC‐Sired samy podávali nižší počet infúzií (t{ {7}} 0,20, P < 0,05;="" obrázok="" 3d).="" pre="" inkubáciu="" túžobného="" správania,="" ktoré="" sa="" považuje="" za="" meradlo="" zvýšeného="" hľadania="" drog="" počas="" abstinencie,="" anova="" so="" zmiešaným="" dizajnom="" v="" dvoch="" smeroch="" s="" ošetrením="" sedenia="" a="" samca="" identifikovala="" hlavný="" účinok="" sedenia="" (f(1,17)="" {{16}="" },90,="" p="">< 0,001).="" zatiaľ="" čo="" zvieratá="" sal-sired="" vykazovali="" inkubačný="" účinok="" s="" väčšími="" odpoveďami="" na="" 21.="" deň="" abstinencie="" v="" porovnaní="" s="" 1.="" dňom,="" myši="" nic-sired="" nevykazovali="" zvýšenie="" správania="" pri="" hľadaní="" nikotínu="" (p=""><>

3.5 Expozícia nikotínu zo strany otca mení hipokampálnu cholinergnú väzbu a funkciu

Vysokoafinitná hipokampálna heteromérna väzba nAChR bola upregulovaná u NIC-Sired F1 myší (t28=2.14, P <.05; sal-sired="1.21" ±="" {{10}="" },043,="" nic-sired="1,34" ±="" 0,044).="" jeden="" subjekt="" (nic-sired)="" bol="" odstránený,="" pretože="" hodnoty="" väzby="" boli="" dve="" štandardné="" odchýlky="" nad="">

Amperometrické záznamy draslíkom a nikotínom vyvolaných ACh prúdov boli hodnotené v F1 dHPC a vHPC. Vzhľadom na nerovnomernú veľkosť vzorky podľa pohlavia nebolo pohlavie zahrnuté ako predbežný faktor v týchto analýzach. Cholinergné signály vyvolané depolarizáciou KCl sa nelíšili medzi myšami SAL‐ a NIC‐Sired v dHPC (P > 0,05; obrázok 4A); lokálna aplikácia nikotínu však viedla k významnému zníženiu amplitúd cholinergného signálu u myší NIC-Sired (t8=20,33, P < 0,05;="" obrázok="" 4c).="" vo="" vhpc="" sa="" uvoľňovanie="" ach="" znížilo="" u="" nic-sired="" myší="" po="" aplikácii="" kcl="" (t8="2,60," p="">< 0,05;="" obrázok="" 4b)="" alebo="" nikotínu="" (t8="2,98," p="">< 0,05="" obrázok="">

OBRÁZOK 4 Paternálny nikotín znižuje cholinergnú signalizáciu v hipokampe. Populačné cholínové signály dHPC vyvolané terminálnou depolarizáciou indukovanou KCl. Medzi zvieratami NIC- a SAL-Sired neboli zistené žiadne významné rozdiely (n=5 na skupinu). B, cholínové signály populácie vHPC vyvolané terminálnou depolarizáciou indukovanou KCl boli znížené u myší NIC-Sired. C, Nikotínom vyvolaná populácia dHPC cholínové signály boli znížené u NIC-Sired myší. D, nikotínom vyvolaná populácia vHPC cholínové signály boli znížené u myší NIC-Sired. Neboli pozorované žiadne účinky pohlavia na cholinergnú signalizáciu. Chybové stĺpce označujú štandardnú chybu priemeru (SEM), *P <>

3.6 Expozícia otcovského nikotínu odlišne mení dorzálnu a ventrálnu hipokampálnu génovú expresiu

Analýza hipokampálneho transkriptómu F1 prostredníctvom sekvenovania RNA odhalila 952 odlišne exprimovaných génov vo vHPC (FDR=0.05; tabuľka S2). Z týchto génov bolo 612 downregulovaných a 340 upregulovaných u NIC-Sired myší. V dHPC bolo iba 162 génov rozdielne exprimovaných u myší NIC-Sired v porovnaní s myšami SAL-Sired (FDR=0.05). Z týchto 162 génov bolo 86 downregulovaných a 76 bolo upregulovaných. 103 génov so zmenenou génovou expresiou sa prekrývalo medzi vHPC a dHPC.

3.7 Expozícia nikotínu zo strany otca mení transkripčné dráhy zapojené do vývoja nervového systému

Vo vHPC analýza IPA identifikovala najvyššiu sieť „Neurologické ochorenia, poranenia a abnormality, bunková smrť a prežitie“ (skóre=41, tabuľka S3) a druhú najvyššiu sieť „Vývoj a funkcia nervového systému, morfológia tkaniva, neurologické Choroba“ (skóre=23). Prvých päť kategórií molekulárnych a bunkových funkcií bolo: „morfológia buniek“ (88 molekúl), „bunkové usporiadanie a organizácia“ (79 molekúl), „bunkový vývoj“ (96 molekúl), „bunková funkcia a údržba“ (79 molekúl), a "Celular Growth and Proliferation" (87 molekúl). Popredné funkcie vývoja a funkcie fyziologického systému boli „Vývoj a funkcia nervového systému“ (175 molekúl) a niektoré z hlavných funkcií chorôb a porúch zahŕňajú „Neurologické ochorenie“ (druhá, 191 molekúl) a „Psychologické poruchy“ (štvrtá, 90 molekúl). ) (tabuľka S4).

Ako doplnok k výsledkom IPA poskytla analýza obohatenia pomocou Enrichr ďalšie dôkazy o zmenách v bunkovom raste a vývoji vo vHPC, s najlepšími biologickými termínmi GO vrátane „zostrihu RNA“, „reakcie na rozvinutý proteín“ a „regulácie bunkového rastu“ a „ stabilizácia proteínov“ (tabuľka S5). V súlade s tým bol "spliceozomálny komplex" identifikovaný ako hlavný GO bunkový termín. Analýza KEGG dráhy prostredníctvom Enrichr ďalej poukázala na fungovanie spliceozómu a signalizáciu MAPK ako potenciálne ovplyvnené dráhy.

Napriek podstatne kratšiemu zoznamu odlišne exprimovaných génov v dHPC v porovnaní s vHPC boli identifikované podobné dráhy a termíny obohatené o dHPC (tabuľky S3 a S4). Analýza IPA identifikovala najvyššiu sieť „Správanie, neurologické choroby, organizmy a abnormality“ (skóre=24) a druhú najčastejšiu sieť „Neurologické choroby, organické poškodenia a abnormality a psychologické poruchy (skóre=20) .

Prvými piatimi kategóriami molekulárnych a bunkových funkcií v dHPC boli „bunkový vývoj“ (29 molekúl), „bunkový rast a proliferácia“ (29 molekúl), „morfológia buniek“ (27 molekúl), „bunkové usporiadanie a organizácia“ (23 molekúl). a "Celular Function and Maintenance" (25 molekúl). „Vývoj a funkcia nervového systému“ bol opäť identifikovaný ako najvyšší obohatený pojem v rámci klasifikácie vývoja a funkcie fyziologického systému (druhá, 44 molekúl). Najlepšie obohatené výrazy v rámci klasifikácie funkcií chorôb a porúch zahŕňali „neurologické ochorenie“ (1., 51 molekúl) a „psychologické poruchy“ (piata, 31 molekúl). Analýza obohatenia pomocou Enrichr identifikovala viacero rôznych biologických termínov GO pre dHPC v porovnaní s vHPC, vrátane „regulácie smrti neurónov“ a „vývoja mozgu“ (tabuľka S5), ktoré dopĺňajú molekulárnu a bunkovú funkciu IPA „Smrť a prežitie buniek“.

Aby sa ďalej preskúmala funkčná úloha rozdielne exprimovaných transkriptov prekrývajúcich sa medzi dHPC a vHPC, vyhodnotili sa rozdielne exprimované gény spoločné pre obe oblasti (celkom 103). Prekrývajúce sa rozdielne exprimované transkripty medzi týmito dvoma oblasťami boli všetky downregulované alebo upregulované v rovnakom smere, čo naznačuje spoločné zmeny v transkripčných dráhach v oblastiach mozgu u myší s NIC. Prvých päť kategórií molekulárnych a bunkových funkcií identifikovaných pomocou IPA bolo „Smrť a prežitie buniek“ (17 molekúl), „Celular Movement“ (10 molekúl), „Signalizácia a interakcia medzi bunkami“ (17 molekúl), „Celular Growth“ a proliferácia" (18 molekúl) a "Morfológia buniek" (17 molekúl) (tabuľka S4)

Diferenciálne exprimované gény jedinečné pre dHPC a vHPC sa následne analyzovali oddelene v IPA, aby sa otestovali odlišné neurobiologické adaptácie medzi týmito dvoma oblasťami (tabuľka S6). Medzi unikátnymi vHPC unikátnymi analýzami dHPC sa neprekrývali žiadne obohatené kanonické dráhy. Najlepšie obohatené kanonické dráhy jedinečné pre vHPC (celkom 44) zahŕňali „vápnikovú signalizáciu“ a „signalizáciu glukokortikoidného receptora“, zatiaľ čo top kanonické dráhy dHPC (celkom osem) zahŕňali „metabolizmus hormónov štítnej žľazy“ a „signalizáciu apoptózy sprostredkovanú kyselinou retinovou“. Obohatené choroby a funkcie jedinečné pre vHPC (celkom 295) zahŕňali „vznik [hipocampu] Ammon's Roh“ a „množstvo bunkových výbežkov“, zatiaľ čo jedinečné výrazy chorôb a funkcií obohatené o dHPC (celkom 111) zahŕňali „zápal bielej hmoty“ a „demyelinizácia“. ."

3.8 Expozícia nikotínu zo strany otca mení metyláciu hipokampálnej DNA

Uskutočnila sa cielená analýza metylácie DNA, aby sa určilo, či zmenená metylácia DNA v zodpovedajúcich regulačných oblastiach zodpovedá za rozdielnu génovú expresiu u potomkov NIC-Sired F1. Ciele zahŕňali 1114 odlišne exprimovaných génov identifikovaných buď v dHPC alebo vHPC. Vo vHPC sa detegovalo 11 rozdielne metylovaných oblastí (DMR), pričom osem vykazovalo zvýšenú metyláciu a tri vykazovali zníženú metyláciu (tabuľka 1). Z 11 DMR sa 10 nachádzalo v oblastiach spojených s génom, ktorý vykazoval zmenenú expresiu vo vHPC. V dHPC sa detegovalo 30 DMR, pričom 15 vykazovalo zvýšenú metyláciu a 15 vykazovalo zníženú metyláciu. Z 30 DMR sa 29 nachádzalo v oblastiach spojených s génom, ktorý vykazoval zmenenú expresiu v dHPC.

Benúčinok cistanche echinakozidu

4. DISKUSIA

Lepšie pochopenie epigenetických procesov v spojení s najnovšími údajmi, vrátane súčasných zistení, spochybnilo tradičné chápanie dedičnosti. Faktory nad rámec samotného genotypu môžu určovať fenotypy v nasledujúcich generáciách a expozície v rámci generácie nemusia byť sekvestrované z potomstva. Táto štúdia naznačuje, že škodlivé účinky expozície nikotínu na zdravie môžu prekročiť individuálnu expozíciu a ovplyvniť nasledujúce generácie. Identifikovali sme multigeneračné a transgeneračné účinky predkoncepčnej expozície otcovského nikotínu u myší C57BL / 6J na pavlovovské podmieňovanie strachu, čo malo za následok silnejšie spomienky na strach u potomkov F1 a F2. Expozícia nikotínu zo strany otca tiež viedla k zníženiu samopodávania nikotínu a zmierneniu správania súvisiaceho s relapsom, čo naznačuje väčšiu averzívnu odpoveď na nikotín. Na podporu týchto rozdielov v správaní sa pozorovali viacgeneračné zmeny v hipokampálnej cholinergnej funkcii a epigenetických procesoch. Tieto výsledky spolu poukazujú na zmeny vo funkcii nervového systému u potomkov myší vystavených nikotínu, čo vedie k zmeneným fenotypom správania.

Potomkovia F1 a F2 samcov myší vystavených nikotínu vykazovali vylepšené kontextové podmieňovanie strachu. Napriek žiadnym rozdielom v kontextovom vymieraní strachu medzi myšami NIC‐ a SAL‐Sired F1, myši NIC‐Sired vykazovali zlepšenú spontánnu obnovu kontextových spomienok na strach. Dôležité je, že sa nezistili žiadne rozdiely v citlivosti na šok medzi myšami NIC‐ a SAL‐Sired, ktoré by mohli zodpovedať za zvýšené kondicionovanie strachu. Zlepšené podmieňovanie strachu môže naznačovať všeobecné zlepšenie procesov učenia na rozdiel od modulácie procesov špecifickejších pre strach z učenia. U myší NIC-Sired sa však nepozorovali žiadne zmeny v rozpoznávaní nových objektov, operatívnom tréningu potravy alebo pohybe v otvorenom poli, hoci bol identifikovaný pohlavne špecifický účinok zvýšeného času otvoreného ramena EPM u samíc myší NIC-Sired. Aj keď to nevylučuje potenciálne modifikácie iných vzdelávacích systémov alebo kognitívnych procesov, tieto zistenia spolu naznačujú, že učenie sa strachom môže byť citlivejšie na viacgeneračné a transgeneračné účinky vystavenia otcovskému nikotínu. Okrem toho tieto zistenia naznačujú zmenenú cholinergnú funkciu u zvierat NIC-Sired. Nikotín moduluje kontextové podmieňovanie strachu. Zatiaľ čo akútny nikotín zvyšuje kontextové podmieňovanie strachu,15,45 odvykanie od chronického nikotínu narúša kontextové podmieňovanie strachu.16,21 V tejto štúdii akútny nikotín zosilnil kontextové podmieňovanie strachu u myší F1 a F2 z myší liečených fyziologickým roztokom. Naopak, akútne nikotínom prerušené kontextové podmieňovanie strachu u NIC-Sired myší a nemalo žiadny účinok u NIC-starých myší, čo môže poukazovať na zmenené cholinergné fungovanie v hipokampe.

Účinky expozície nikotínu zo strany otca na následné samopodávanie nikotínu v generácii F1 tiež poukazujú na narušenú cholinergnú funkciu. Počas získania IV samoaplikácie nikotínu v nižšej dávke sa skupiny nelíšili v počte infúzií nikotínu, hoci v skupine NIC-Sired sa zistilo zvýšenie počtu aktívnych stlačení páky. To naznačuje, že myši NIC-Sired mohli vykazovať vytrvalosť v reakcii na odmenu za jedlo a / alebo zníženú kognitívnu flexibilitu pri prechode reakcie z jedla na liek. Je však tiež potrebné poznamenať, že skupiny sa nelíšili v deň 1 inkubácie túžby, čo predstavuje reláciu vyhasnutia (napr. žiadne infúzie nikotínu počas relácie), a preto sa zdá, že tento účinok bol prítomný, keď sú posilňovače prepnuté, ale nie v neprítomnosti posilňovača počas relácie zániku. Myši NIC-Sired tiež vykazovali znížené samopodávanie nikotínu v strednej dávke, čo je v súlade s nedávnymi prácami identifikujúcimi zníženie podávania alkoholu, kokaínu a opioidov spojené s rodičovskou expozíciou alkoholu, kokaínu a morfínu (napr. Vassoler et al, 46 ako preskúmané v Goldberg a Gould47). Pozorované zníženie samoaplikácie nikotínu možno pripísať buď zníženej citlivosti na odmeňujúce účinky nikotínu a/alebo zvýšenej citlivosti na averzívne účinky nikotínu. V skutočnosti sa skupiny líšili v strednej dávke nikotínu, ale nie v nižšej dávke nikotínu, čo podporuje predstavu o zvýšenej averzívnej reakcii pri vyššej dávke. Je zaujímavé, že sme tiež zistili nedostatok inkubácie túžby v deň 21 u myší NIC-Sired po samopodávaní miernej dávky, čo naznačuje, že znížené správanie pri hľadaní nikotínu by mohlo súvisieť s averziou spojenou s pamäťou na nikotín. Hoci rôzne nervové substráty môžu byť základom týchto účinkov na príjem nikotínu a reakciu súvisiacu s relapsom, nedávna štúdia zistila, že znížená hladina DNA metyltransferázy v hipokampálnej CA1 oblasti znížila samopodávanie morfínu.48 Toto zistenie spolu so známou funkciou cholinergnej hipokampálnej funkcie v procesy učenia a pamäte, ďalej podporuje myšlienku narušeného spracovania sprostredkovaného nikotínom v hipokampe myší NIC-Sired.

V súlade s týmito líniami myši NIC-Sired vykazovali zvýšenú hipokampálnu väzbu nAChR s vysokou afinitou. Zistili sme tiež zníženie uvoľňovania ACh vyvolaného draslíkom vo vHPC, ako aj uvoľňovania ACh vyvolaného nikotínom u dHPC aj vHPC zvierat NIC-Sired. Zmeny v uvoľňovaní ACh vyvolanom depolarizáciou odrážajú zmenenú cholinergnú funkciu v smere väzby k receptoru, zatiaľ čo zmeny uvoľňovania ACh vyvolaného nikotínom odrážajú zmenenú funkciu nAChR. Tieto údaje sú v súlade s predchádzajúcimi zisteniami o upregulovanej vysokoafinitnej väzbe nAChR po zníženej funkcii nAChR.49 Pretože uvoľňovanie ACh vyvolané draslíkom aj nikotínom bolo zmenené vo vHPC myší NIC-Sired, vHPC môže byť citlivejšie na viacgeneračné účinky vystavenia otcovskému nikotínu. Je známe, že DHPC moduluje kontextové podmieňovanie strachu.31,50 Inhibícia vHPC narúša stav vyvolaný aj kontextovým strachom51,52 a cholinergné lézie vHPC zhoršujú podmieňovanie vyvolaného strachu.53

Bylina cistanche

Ukázali sme tiež, že priama infúzia nikotínu do dHPC zvyšuje kontextové podmieňovanie strachu, zatiaľ čo infúzia do vHPC narúša kontextové podmieňovanie strachu.15 vHPC môže tiež modulovať spontánne obnovenie kontextových spomienok na strach, pretože inaktivácia vHPC-prelimbických obvodov znižuje spontánne zotavenie kontextových spomienok na strach. 54 Zatiaľ čo iné oblasti mozgu zapojené do podmieňovania strachu, ako je amygdala,55 môžu byť tiež ovplyvnené expozíciou otcovského nikotínu, tieto zistenia spolu so súčasnými údajmi naznačujú, že zmeny vo funkcii vHPC môžu byť zodpovedné za zmenené kondicionovanie strachu u myší NIC-Sired. . Predpokladali sme, že viacgeneračné účinky expozície otcovského nikotínu môžu súvisieť so zmenami v transkripčných efektoroch pôsobiacich proti prúdu týchto nervových systémov. Transkripčné sekvenovanie v celom genóme vo vHPC a dHPC myší generácie F1 identifikovalo 1114 rozdielne exprimovaných génov medzi myšami NIC- a SAL-Sired. Tento rozdiel bol väčší vo vHPC (952) oproti dHPC (162), v súlade s väčšou zmenou vHPC v porovnaní s cholinergnou funkciou dHPC a zmenami v kontextovom aj cudnom podmieňovaní strachu. Následná analýza dráh naznačila široké zmeny transkripčných dráh spojených so signalizáciou glukokortikoidov a neurálnym vývojom/plasticitou v oboch hipokampálnych oblastiach.

Aby sa identifikovali potenciálne adaptácie špecifické pre vHPC, analýza dráhy sa uskutočnila s použitím iba transkriptov špecifických pre každú hipokampálnu podoblasť. Žiadne obohatené kanonické dráhy IPA sa neprekrývali medzi vHPC a dHPC, čo sú funkčne odlišné podoblasti hipokampu.31 Keď boli odstránené gény, ktoré sa prekrývali medzi dHPC a vHPC, najlepšie obohatené kanonické dráhy jedinečné pre vHPC zahŕňali „signalizáciu glukokortikoidných receptorov“, čo naznačuje jedinečnú , ďalšia zmena fungovania glukokortikoidov v tejto oblasti v porovnaní s dHPC. S cieľom identifikovať upstream epigenetické regulátory, ktoré môžu pôsobiť na génovú expresiu, sme vykonali cielené sekvenovanie metylácie DNA pomocou zostaveného zoznamu dHPC a vHPC odlišne exprimovaných génov identifikovaných zo sekvenovania RNA. Prekvapivo sme našli iba 11 DMR vo vHPC a 30 DMR v dHPC medzi zvieratami NIC- a SAL-Sired. Hoci je to neočakávané vzhľadom na oveľa vyšší počet odlišne exprimovaných transkriptov vo vHPC, metylácia DNA je len jedným z niekoľkých regulačných faktorov, ktoré môžu ovplyvniť génovú expresiu, a metylácia DNA sa nepremieta do zmenenej génovej expresie.56 Z 11 vHPC DMR je sedem vykazovali metylačné vzory v súlade so smerom diferenciálnej transkripcie (znížená transkripcia so zvýšenou metyláciou DNA a zvýšená transkripcia so zníženou metyláciou). Diferenciálne metylované gény vo vHPC zahŕňali Fkbp5, Ksr1 a Pnpla2. Je zaujímavé, že transkripcia Fkbp5 a Ksr1 bola narušená v jednom behaviorálnom myšom modeli PTSD, 57 kde boli myši vystavené elektrickému šoku do nôh a potom boli prezentované situačné pripomienky. Fkbp5 kóduje chaperón glukokortikoidového receptora, ktorého fungovanie je spojené s maladaptívnou predĺženou stresovou reakciou u jedincov s PTSD a inými úzkostnými poruchami.58

Štúdie na ľuďoch konkrétne ukazujú, že metylácia a transkripcia Fkbp5 koreluje so závažnosťou symptómov PTSD, takže zvýšená metylácia a znížená transkripcia predpovedajú závažnejšiu symptomológiu PTSD.59,60 Expresia Fkbp5 moduluje fungovanie osi HPA, o ktorej sa predpokladá, že sprostredkuje jej zapojenie do PTSD.59,61 Naše zistenie zvýšenej spontánnej obnovy pamäte strachu v spojení s dysreguláciou transkripčných dráh spojených so signalizáciou glukokortikoidov u zvierat NIC-Sired môže poukazovať na zvýšenú zraniteľnosť voči fenotypom podobným PTSD. V dHPC boli vzory DMR do značnej miery nekonzistentné so smerom expresie diferenciálneho transkriptu zisteným sekvenovaním RNA, čo naznačuje, že zmeny v metylácii DNA vHPC produkovanej expozíciou otcovského nikotínu sú dôslednejšie z hľadiska ovplyvnenia génovej expresie ako zmeny v dHPC. To je v súlade s našou identifikáciou väčšieho počtu odlišne exprimovaných transkriptov a prehnanejších zmien v cholinergnom prenose v NIC-Sired vHPC v porovnaní s dHPC. Náš prístup cieleného sekvenovania mohol obmedziť schopnosť detegovať potenciálnu transkripčnú reguláciu distálnymi metylovanými sekvenciami. Budúce výskumy vrátane analýzy metylácie DNA v celom genóme, modifikácií histónov a expresie malej RNA poskytnú úplnejšiu interpretáciu týchto zistení.

Potenciálnym obmedzením nášho dizajnu expozície nikotínu je zameranie sa na otcovskú expozíciu nikotínu s cieľom preskúmať viacgeneračný a transgeneračný vplyv expozície nikotínu. Hoci iné štúdie, ktoré zistili multi/transgeneračné fenotypy po expozícii otcovským drogám, vrátane kokaínu46 a morfínu,62 nezistili žiadne rozdiely v starostlivosti o matku, je možné, že expozícia nikotínu zo strany otca môže mať vplyv na starostlivosť o matku. Budúce štúdie skúmajúce vplyv na starostlivosť o matku sú opodstatnené. Keďže sme sa v súčasnosti zamerali na expozíciu otca, budúca práca by mala porovnať aj vplyvy expozície otca a matky. Celkovo tieto zistenia poskytujú nové chápanie viacgeneračných a transgeneračných účinkov expozície nikotínu, ktoré podporuje rastúca literatúra charakterizujúca viacgeneračné a transgeneračné účinky expozície drogám (ako je uvedené v Goldberg a Gould47). Táto štúdia bola prvou, ktorá testovala kontextové podmieňovanie strachu u potomkov F1 a F2 mužov vystavených nikotínu a identifikovala zvýšenú tvorbu pamäte strachu a spontánne obnovenie spomienok na strach. Táto štúdia bola tiež prvou, ktorá identifikovala zmenené samopodávanie nikotínu a inkubáciu túžby u potomkov F1 vystavených nikotínu.

U NIC-Sired myší sa našla diferenciálna metylácia v génoch spojených s PTSD a dysreguláciou osi HPA, ako aj súbežné prerušenia v transkripčných dráhach súvisiacich so stresom. Otcovský nikotín bol tiež spojený so zníženou hipokampálnou cholinergnou funkciou a zvýšenou hipokampálnou väzbou nAChR. Je zaujímavé, že pacienti s PTSD, ktorí nefajčili, vykazujú významne vyššiu medzičasovú kortikálnu vysokoafinitnú väzbu nAChR63 a PTSD je spojená s väčším podmieňovaním strachu a spontánnou obnovou vyhasnutých spomienok na strach.64 Naše zistenia spoločne naznačujú, že expozícia nikotínu môže mať viacgeneračný dopad zvýšená náchylnosť potomkov na symptómy podobné PTSD. Toto zistenie spolu s ďalšími nedávnymi zisteniami, ktoré ukazujú viacgeneračné účinky expozície nikotínu na kognitívnu flexibilitu2, naznačujú, že negatívne zdravotné výsledky expozície nikotínu vrhajú širšiu sieť, než sa pôvodne predpokladalo.

Extrakt z cistanche

LITERATÚRA

1 Dai J, Wang Z, Xu W, a kol. Expozícia nikotínu zo strany otca definuje odlišné správanie v nasledujúcej generácii prostredníctvom hypermetylácie mmu‐miR‐ 15b. Sci Rep. 2017;7(1):7286.

2. McCarthy DM, Morgan TJ Jr, Lowe SE, a kol. Expozícia nikotínu u samcov myší spôsobuje poruchu správania u viacerých generácií potomkov. PLoS Biol. 2018;16(10):e2006497.

3. Zhu J, Lee KP, Spencer TJ, Biederman J, Bhide PG. Transgeneračný prenos hyperaktivity v myšom modeli ADHD. J Neurosci. 2014;34(8):2768‐2773.

4. Cummings KM, Proctor RN. Meniaci sa verejný obraz fajčenia v Spojených štátoch: 1964-2014. Biomarkery epidemiolu rakoviny Predch. 2014;23(1):32‐36.

5. Huang LL, Kowitt SD, Sutfin EL, Patel T, Ranney LM, Goldstein AO. Užívanie elektronických cigariet medzi stredoškolákmi a jeho spojenie s užívaním cigariet a odvykaním od fajčenia, North Carolina Youth Tobacco Surveys, 2011 a 2013. Prev Chronic Dis. 2016;13:E103.

6. Holliday ED, Nucero P, Kutlu MG, a kol. Dlhodobé účinky chronického nikotínu na emocionálne a kognitívne správanie a morfológiu hipokampových buniek u myší: porovnanie expozície nikotínu u dospelých a dospievajúcich. Eur J Neurosci. 2016;44:2818‐2828.

7. Johnson JG, Cohen P, Pine DS, Klein DF, Kasen S, Brook JS. Spojenie medzi fajčením cigariet a úzkostnými poruchami počas dospievania a ranej dospelosti. JAMA. 2000;284:2348-2351.

8. Jung Y, Hsieh LS, Lee AM, a kol. Epigenetický mechanizmus sprostredkováva vývojové účinky nikotínu na štruktúru a správanie neurónov. Nat Neurosci. 2016;19(7):905‐914.

9. Gitik M, Holliday ED, Leung M, a kol. Cholín zlepšuje deficity učenia dospelých a zvráti epigenetickú modifikáciu faktorov remodelácie chromatínu súvisiacich s expozíciou dospievajúceho nikotínu. Neurobiol Learn Mem. 2018;155:239‐248.

10. Vták A. Vnímanie epigenetiky. Príroda. 2007;447:396-398.

11. Skinner MK. Environmentálna epigenetická transgeneračná dedičnosť a somatická epigenetická mitotická stabilita. Epigenetika. 2011;6:838‐842.

12. Davis JA, Gould TJ. Asociatívne učenie, hipokampus a závislosť od nikotínu. Curr Drug Abuse Rev. 2008;1:9‐19.

13. Kutlu MG, Parikh V, Gould TJ. Závislosť na nikotíne a psychické poruchy. Int Rev Neurobiol. 2015;124:171‐208.

14. Parikh V, Kutlu MG, Gould TJ. Dysfunkcia nAChR ako bežný substrát pre schizofréniu a komorbidnú závislosť od nikotínu: súčasné trendy a perspektívy. Schizophr Res. 2016;171:1‐15.

15. Kenney JW, Raybuck JD, Gould TJ. Nikotínové receptory v dorzálnom a ventrálnom hipokampe odlišne modulujú kontextové podmieňovanie strachu. Hippocampus. 2012;22:1681-1690.

16. Wilkinson DS, Turner JR, Blendy JA, Gould TJ. Genetické pozadie ovplyvňuje účinky odvykania od chronického nikotínu na učenie a vysokoafinitnú väzbu nikotínového acetylcholínového receptora v dorzálnom a ventrálnom hipokampe. Psychofarmakológia (Berl). 2013;225(1): 201‐208.

17. Davis JA, Gould TJ. Účinky DHBE a MLA na nikotínom indukované zlepšenie kontextového podmieňovania strachu u myší C57BL/6. Psychofarmakológia (Berl). 2006;184:345‐352.

18. Kutlu MG, Zeid D, Tumolo JM, Gould TJ. Predpubertálne a dospievajúce myši sú menej citlivé na účinky akútneho nikotínu na vyhynutie a spontánne zotavenie. Brain Res Bull. 2018;138:50‐55.

19. Kutlu MG, Gould TJ. Akútny nikotín oneskoruje zánik kontextového strachu u myší. Behav Brain Res. 2014;263:133‐137.

20. Benowitz NL, Hukkanen J, Jacob P 3. Nikotínová chémia, metabolizmus, kinetika a biomarkery. In: Nikotínová psychofarmakológia. Berlín, Heidelberg: Springer; 2009: 29-60.

21. Davis JA, James JR, Siegel SJ, Gould TJ. Odstúpenie od chronického podávania nikotínu zhoršuje kontextové kondicionovanie strachu u myší C57BL/6. J Neurosci. 2005;25:8708-8713.

22. Petersen DR, Norris KJ, Thompson JA. Porovnávacia štúdia dispozície nikotínu a jeho metabolitov u troch inbredných kmeňov myší. Drug Metab Dispos. 1984;12:725-731.

23. Gould TJ, Portugalsko GS, Andre JM, et al. Trvanie deficitov súvisiacich s vysadením nikotínu v kontextovom kondicionovaní strachu paralelne so zmenami v upregulácii hipokampálneho vysokoafinitného nikotínového acetylcholínového receptora. Neurofarmakológia. 2012;62:2118‐2125.

24. Kutlu MG, Oliver C, Huang P, Liu‐Chen LY, Gould TJ. Zhoršenie kontextového zániku strachu chronickým nikotínom a odvykanie od chronického nikotínu je spojené s upreguláciou hipokampálneho nAChR. Neurofarmakológia. 2016;109:341‐348. 25. Damaj MI, Kao W, Martin BR. Charakterizácia spontánneho a precipitovaného odňatia nikotínu u myši. J Pharmacol Exp Ther. 2003;307:526-534.

26. Fowler CD, Lu Q, Johnson PM, Marks MJ, Kenny PJ. Habenulárna signalizácia podjednotky alfa5 nikotínového receptora kontroluje príjem nikotínu. Príroda. 2011;471:597‐601.

27. Lomazzo E, MacArthur L, Yasuda RP, Wolfe BB, Kellar KJ. Kvantitatívna analýza heteromérnych neuronálnych nikotínových receptorov v hipokampe potkanov. J Neurochem. 2010;115:625‐634.

28. Turner JR, Castellano LM, Blendy JA. Paralelné anxiolytické účinky a upregulácia neuronálnych nikotínových acetylcholínových receptorov po chronickom nikotíne a vareniklíne. Nikotín Tob Res. 2011;13:41‐46.

29. Parikh V, Ji J, Decker MW, Starter M. Prefrontálne beta2 podjednotky obsahujúce a alfa7 nikotínové acetylcholínové receptory rozdielne riadia glutamátergickú a cholinergnú signalizáciu. J Neurosci. 2010;30: 3518‐3530.

30. Parikh V, Starter M. Predný mozog cholinergné systémy a poznanie: nové poznatky založené na rýchlej detekcii cholínových špičiek pomocou enzýmových biosenzorov. In: Mikroelektródové biosenzory. Totowa, NJ: Humana Press; 2013: 257-277.

31. Fanselow MS, Dong HW. Sú dorzálny a ventrálny hipokampus funkčne odlišné štruktúry? Neuron. 2010;65(1):7‐19.

32. Kim D, Pertea G, Trapnell C, Pimentel H, Kelley R, Salzberg SL. TopHat2: presné zarovnanie transkriptómov v prítomnosti inzercií, delécií a génových fúzií. Genome Biol. 2013;14(4): R36.

33. Afgan E, Baker D, van den Beek M, et al. Platforma Galaxy pre dostupné, reprodukovateľné a kolaboratívne biomedicínske analýzy: aktualizácia z roku 2016. Nucleic Acids Res. 2016;44:W3-w10.

34. Trapnell C, Williams BA, Pertea G, a kol. Zostavenie a kvantifikácia transkriptov pomocou RNA-Seq odhaľuje neanotované transkripty a prepínanie izoforiem počas bunkovej diferenciácie. Nat Biotechnol. 2010;28(5): 511‐515.

35. Benjamini Y, Drai D, Elmer G, Kafkafi N, Golani I. Kontrola miery falošných objavov vo výskume genetiky správania. Behav Brain Res. 2001; 125(1-2):279-284.

36. Kramer A, Green J, Pollard J Jr, Tugendreich S. Prístupy kauzálnej analýzy v Ingenuity Pathway Analysis. Bioinformatika. 2014;30(4): 523‐530.

37. Kuleshov MV, Jones MR, Rouillard AD, a kol. Enrichr: aktualizácia komplexného webového servera na analýzu obohatenia génovej sady z roku 2016. Nucleic Acids Res. 2016;44(W1): W90‐W97.

38. Wendt J, Rosenbaum H, Richmond TA, Jeddeloh JA, Burgess DL. Cielené bisulfitové sekvenovanie pomocou systému obohatenia SeqCap epi. Metódy Mol Biol. 2018;1708:383‐405.

39. Bolger AM, Lohse M, Usadel B. Trimmomatic: flexibilný trimmer pre sekvenčné údaje Illumina. Bioinformatika. 2014;30(15):2114‐2120.

40. Langmead B, Salzberg SL. Rýchle zarovnanie s medzerami pomocou metódy Bowtie 2. Nat. 2012;9(4):357‐359.

41. Krueger F, Andrews SR. Bismark: flexibilný zarovnávač a metylačný vyvolávač pre aplikácie Bisulfite-Seq. Bioinformatika. 2011;27(11):1571‐1572.

42. Akalin A, Kormaksson M, Li S, a kol. methylKit: komplexný balík R na analýzu profilov metylácie DNA v celom genóme. Genome Biol. 2012;13(10): R87.

43. Gould TJ, Lommock JA. Nikotín zvyšuje kontextové podmieňovanie strachu a zlepšuje deficity vyvolané etanolom v kontextovom podmieňovaní strachu. Behav Neurosci. 2003;117(6):1276-1282.

44. Fowler CD, Kenny PJ. Intravenózne samopodávanie nikotínu a obnovenie vyvolané podnetom u myší: účinky dávky nikotínu, rýchlosť infúzie lieku a predchádzajúci inštrumentálny tréning. Neurofarmakológia. 2011;61(4):687‐698.

45. Gould TJ, Wehner JM. Nikotínové zlepšenie kontextového podmieňovania strachu. Behav Brain Res. 1999;102(1‐2):31‐39.

46. ​​Vassoler FM, White SL, Schmidt HD, Sadri‐Vakili G, Pierce RC. Epigenetická dedičnosť fenotypu rezistencie na kokaín. Nat Neurosci. 2013;16(1):42‐47.

47. Goldberg LR, Gould TJ. Multigeneračné a transgeneračné účinky vystavenia otca zneužívaným drogám na behaviorálnu a nervovú funkciu. Eur J Neurosci. 2018;50(3):2453‐2466.

48. Zhang JJ, Jiang FZ, Zheng W, a kol. DNMT3a v hipokampálnej CA1 je rozhodujúca pri získavaní samoaplikácie morfínu u potkanov. Addict Biol. 2019; ▪: ▪‐ ▪.

49. Schwartz RD, Kellar KJ. Väzbové miesta pre nikotínový cholinergný receptor v mozgu: regulácia in vivo. Veda. 1983;220(4593):214-216.

50. Logue SF, Paylor R, Wehner JM. Hipokampálne lézie spôsobujú u inbredných myší v Morrisovom vodnom bludisku poruchy učenia a úlohu podmieneného strachu. Behav Neurosci. 1997;111(1):104-113.

51. Zhang WN, Bast T, Feldon J. Ventrálny hipokampus a podmieňovanie strachu u potkanov: rôzne anterográdne amnézie strachu po infúzii N-metyl-D-aspartátu alebo jeho nekompetitívneho antagonistu MK-801 do ventrálneho hipokampu. Behav Brain Res. 2001;126(1‐2):159‐174.

52. Maren S, Holt WG. Kondicionovanie hippocampu a Pavlovovho strachu u potkanov: infúzie muscimolu do ventrálneho, ale nie dorzálneho hipokampu zhoršujú získanie podmieneného zmrazenia na sluchový podmienený stimul. Behav Neurosci. 2004;118(1):97-110.

53. Staib JM, Della Valle R, Knox DK. Narušenie mediálneho septa a diagonálnych pásov Brocových cholinergných projekcií do ventrálneho hipokampu narúšajú pamäť sluchového strachu. Neurobiol Learn Mem. 2018;152:71‐79.

54. Vasquez JH, Leong KC, Gagliardi CM, Harland B, Apicella AJ, Muzzio IA. Aktivácia ventrálnych hipokampálnych buniek vyčnievajúcich do prelimbickej kôry obmedzuje obnovu strachu. Neurobiol Learn Mem. 2019;161:63‐71.

55. LeDoux JE, Cicchetti P, Xagoraris A, Romanski LM. Laterálne amygdaloidné jadro: senzorické rozhranie amygdaly pri podmieňovaní strachu. J Neurosci. 1990;10(4):1062-1069.

56. Jones PA. Funkcie metylácie DNA: ostrovy, štartovacie miesta, telá génov a ďalšie. Nat Rev Genet. 2012;13(7):484‐492.

57. Tanaka M, Li H, Zhang X, a kol. Regiónovo a časovo závislá génová regulácia v amygdale a prednej cingulárnej kôre myšacieho modelu podobného PTSD. Mol Brain. 2019;12(1):25.

58. Binder EB. Úloha FKBP5, ko-chaperónu glukokortikoidného receptora v patogenéze a terapii afektívnych a úzkostných porúch. Psychoneuroendokrinológia. 2009;34 (Suppl 1): S186-S195.

59. Sarapis C, Cai G, Bierer LM, a kol. Genetické markery pre riziko PTSD a odolnosť medzi tými, ktorí prežili útoky na Svetové obchodné centrum. Dis Markers. 2011;30(2‐3):101‐110.

60. Yehuda R, Daskalakis NP, Desarnaud F, a kol. Epigenetické biomarkery ako prediktory a koreláty zlepšenia symptómov po psychoterapii u bojových veteránov s PTSD. Predná Psych. 2013;4:118.

61. Yehuda R, Cai G, Grolier JA, et al. Vzorce génovej expresie spojené s posttraumatickou stresovou poruchou po vystavení útokom Svetového obchodného centra. Biol Psychiatry. 2009;66:708-711.

62. Li CQ, Luo YW, Bi FF a kol. Vývoj správania podobného úzkosti prostredníctvom hipokampálnej signalizácie IGF-2 u potomkov vystavených rodičovskému morfínu: účinok obohateného prostredia. Neuropsychofarmakológia. 2014;39(12):2777‐2787.

63. Czermak C, Staley JK, Kasserman S, a kol. Dostupnosť nikotínového acetylcholínového receptora beta2 pri posttraumatickej stresovej poruche. Int J Neuropsychopharmacol. 2008;11(3):419‐424.

64. Milad MR, Pitman RK, Ellis CB, a kol. Neurobiologický základ zlyhania vybavovania si extinkčnej pamäte pri posttraumatickej stresovej poruche. Biol Psychiatry. 2009;66(12):1075‐1082.