Pentraxínom{0}}sprostredkovaná aktivácia komplementu u prasacieho modelu ischémie/reperfúzneho poškodenia obličiek

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Chiara Divella a kol

ABSTRAKT

Pentraxíny sú rodinou evolučne konzervovaných molekúl na rozpoznávanie vzorov s kľúčovými úlohami pri vrodenej imunite a zápale, ako je opsonizácia patogénov počas bakteriálnych a vírusových infekcií. Najmä sa ukázalo, že dlhý pentraxín 3 (PTX3) reguluje niekoľko aspektov zápalu ciev a tkanív počas transplantácie pevných orgánov.

Naša štúdia skúmala úlohu PTX3 ako možného modulátora aktivácie komplementu v prasacom modeli poškodenia renálnej ischémie/reperfúzie (I/R). Ukázali sme, že I/R poranením indukované skoré depozity PTX3 na peritubulárnych a glomerulárnych kapilárnych úrovniach. Konfokálna laserová skenovacia mikroskopia odhalila depozity PTX3, ktoré sa lokalizovali spolu s CD31 plus endotelovými bunkami. Okrem toho bol PTX3 spojený s infiltrujúcimi makrofágmi (CD163), dendritickými bunkami (SWC3a) a myofibroblastmi (FSP1). Konkrétne sme demonštrovali významnú PTX{10}}sprostredkovanú aktiváciu klasických (sprostredkovaných C1q) a lektínových (sprostredkovaných MBL) dráh komplementu. Je zaujímavé, že depozity PTX3 sa lokalizovali spolu s aktiváciou komplexu terminálneho komplementu (C5b-9) na endotelových bunkách, čo naznačuje, že aktivácia komplementu sprostredkovaná PTX3- sa vyskytla hlavne na renálnej vaskulárnej úrovni. Na záver tieto údaje naznačujú, že PTX3 môže byť potenciálnym terapeutickým cieľom na prevenciu I/R poranenia vyvolaného komplementom.

Korešpondencia s:Giuseppe Castellano

Kľúčové slová:ischemické/reperfúzne poškodenie, systém komplementu, pentraxín 3,obličky, klasická cesta

Cistanche tubulosa zabraňuje ochoreniu obličiek, kliknite sem a získajte vzorku

ÚVOD

Ischemicko-reperfúzne (I/R) poškodenie predstavuje hlavnú príčinu akútobličkyzraneniepo transplantácii a vyznačuje sa výraznou aktiváciou komplementového systému [1, 2]. V tomto scenári hrajú endotelové bunky (EC) kritickú úlohu pri maladaptívnej oprave po I/R, čo vedie k skorej fibróze endotelovým prechodom na mezenchymálny prechod (EndMT) [3]. Počas reperfúznej fázy komplement riadi imunologické a zápalové procesy, čo prispieva k rôznym imunitným a zápalovým ochoreniam [2–5]. Ďalšie základné zložky humorálneho ramena vrodeného imunitného systému predstavujú pentraxíny, o ktorých sa predpokladá, že zohrávajú kľúčovú úlohu vo vaskulárnej biológii [6].

Pentraxíny sú rodinou multimérnych rozpustných proteínov [6], ktoré sa na základe ich štruktúry delia na krátke a dlhé rodiny [7]. Tieto evolučne konzervované proteíny sú efektory akútnej fázy, ktoré slúžia ako senzory na spustenie zápalu a rýchleho nárastu v plazme počas infekcie [8]. Dlhý pentraxín 3 (PTX3) je rozpustná molekula rozpoznávajúca vzory, ktorá je rozhodujúca pri vrodenej imunitnej ochrane a môže aktivovať systém komplementu [9–11].

Najmä PTX3 indukoval aktiváciu klasickej a lektínovej dráhy väzbou s C1q, MBL, Ficolín-2 a je schopný ovplyvniť alternatívnu dráhu prostredníctvom CFH [10–12].

Na rozdiel od iných pentraxínov produkovaných pečeňou v krvnom riečisku (tj CRP) môže byť PTX3 uvoľňovaný rezidentnými bunkami v mieste zápalu, napríklad z mononukleárnych fagocytov, dendritických buniek, fibroblastov a EC [9], ktoré pôsobia parakrinným spôsobom [13]. PTX3 je tiež uložený v hotovej forme v neutrofiloch, lokalizovaný v špecifických granulách a vylučovaný v reakcii na rozpoznanie mikrobiálnych skupín [14]. V EC je expresia PTX3 ľahko indukovaná TNF- a IL-1, čím dochádza k prechodu z pokojového, protizápalového fenotypu do prokoagulačného a prozápalového stavu, čím sa silne reguluje mikrovaskulárna funkcia [7, 8 ]. Z tohto dôvodu boli úrovne PTX3 opísané akochronickýobličkychorobazvýšenie hladín proteínu PTX3 korelovalo s poklesom GFR a kardiovaskulárnymi komplikáciami, avšak stále je málo známe o úlohe PTX3 v skorých štádiách ako I/R-indukované akútneobličkyzranenie [15, 16].

Úloha PTX3 pri obličkových zápalových ochoreniach je bivalentná, zo strany proteínu môže aktivovať klasické a lektínové dráhy podporujúce počiatočný zápal a poranenie [10–12]. Na druhej strane N-terminálna doména aktivácie komplementu modulovanej PTX3 zoslabila nábor leukocytov a inhibovala intersticiálnu fibrózu pri akútnom poškodení obličiek, čím podporila opravu tkaniva [17–20].

Komplement hrá kľúčovú úlohu v patofyziológii akútnych poranení vyvolaných I/Robličkyzranenie[21, 22]. Na prasacom modeli I/R poškodenia obličiek sme demonštrovali kľúčovú úlohu aktivácie komplementového systému pri indukcii EndMT a skorej fibrózy so zapojením klasickej aj lektínovej dráhy [23]. Okrem toho sme preukázali, že terapeutická inhibícia týchto dráh komplementu rekombinantným C1-INH (rhC1INH) spôsobila významné zníženie ukladania komplementu so zníženým náborom infiltrujúcich zápalových buniek a tubulointersticiálnym poškodením [23]. Tieto výsledky potvrdili aj Delpech PO et al [24]; významná modulácia glomerulárnej a tubulárnej depozície C1q, MASP a C4d bola hodnotená po 30 minútach po reperfúzii, čo naznačuje ústrednú úlohu C1-INH pri pôsobení proti klasickým a lektínovým dráham.

V tejto štúdii sme skúmali možné zapojenie PTX3 do sprostredkovania včasnej aktivácie komplementu pri poškodení I/R obličiek, čo charakterizuje rôzne bunkové zdroje PTX3.

VÝSLEDKY

PTX3 je exprimovaný endotelovými bunkami a bunkami infiltrujúcimi imunitu v prasacom modeli I/R poranenia

Najprv sme skúmali prítomnosť PTX3 v prasacom modeli teplého I/R-indukovaného poškodenia obličiek. Pozorovali sme veľmi obmedzené depozity PTX3 v normálnom tkanive (obrázok 1A). Poškodenie I/R spôsobilo difúzne ukladanie PTX3 už 15 minút po reperfúzii (obrázok 1B, 1C) v tubulointersticiálnej oblasti (obrázok 1E), v peritubulárnych kapilárach (obrázok 1D; šípka) a na glomerulárnych úrovniach (obrázok 1D). Depozity PTX3 boli stále detegovateľné 1 hodinu po reperfúzii na úrovni peritubulárnych kapilár (obrázok 1G). V našej predchádzajúcej práci [23] sme demonštrovali, že hlavnými znakmi I/R poškodenia sú apoptóza tubulárnych epitelových buniek a nábor infiltrujúcich zápalových buniek, ako sú monocyty, dendritické bunky a lymfocyty. Napriek tomu sme rutinným histologickým hodnotením (doplnkový obrázok 1) preukázali, že 30 minút teplej ischémie nasledovaných 15 minútami reperfúziou indukovaného skorého intersticiálneho poškodenia tubulov, ktoré sa vyznačuje väčšou kapilárnou kongesciou a fokálnou cytoplazmatickou vakuolizáciou epitelu renálnych tubulov v porovnaní s bazálnou stave.

Aby sme ďalej charakterizovali bunkovú lokalizáciu depozitov PTX3 a vyhodnotili jej potenciálny účinok na moduláciu zápalovej odpovede a poranenia, vykonali sme analýzu dvojitým imunofarbením a konfokálnou mikroskopiou. Expresia proteínu PTX3 bola detegovaná vo väčšine EC na peritubulárnych (obrázok 2A) a glomerulárnych (obrázok 2B) kapilárnych hladinách, 15 minút po reperfúzii.

Je dobre známe, že I/R poranenie je charakterizované zvýšenou aktiváciou vrodených a adaptívnych imunitných reakcií, vrátane prenosu zápalových buniek do chorého orgánu, čo ďalej zhoršuje poškodenie prostredníctvom imunitných buniek a komplementového systému [25]. V našom modeli ošípaných sme tiež pozorovali, už 15 minút po reperfúzii, hustý zápalový infiltrát zložený prevažne z makrofágov a dendritických buniek v tubulárno-intersticiálnej oblasti. Zistili sme, že obe tieto bunky prezentujúce antigén boli charakterizované zvýšenou expresiou PTX3 v porovnaní s T0, pretože sme pozorovali zvýšený počet CD163 plus /PTX3 plus (obrázok 2E, 2F, 2K) a SWC3a plus /PTX3 plus (Obrázok 2G, 2H, 2L) bunky na intersticiálnych hladinách tubulov v T15.

Expresia PTX3 môže prispieť k EndMT pri poranení I/R

V predchádzajúcich pozorovaniach sme demonštrovali, že I/R poranenie bolo zodpovedné za EndMT [26, 27], charakterizované získaním mezenchymálneho fenotypu pomocou EC so stratou špecifických endotelových markerov a ziskom mezenchymálnych markerov, ako sú fibroblastovo špecifické proteín 1 (FSP-1), neurónový kadherín (N-kadherín) a alfa-aktín hladkého svalstva (alfa-SMA). Skúmali sme teda, či expresia PTX3 pomocou EC môže ovplyvniť tento proces. Ako sa očakávalo, keď sme skúmali expresiu alfa-SMA ako markery aktivovaného myofibroblastu, nenašli sme žiadnu spoločnú lokalizáciu medzi alfa-SMA a PTX3 (obrázok 2C, 2D). Naopak, počas pozorovacieho obdobia sme pozorovali nárast tubulointersticiálnych FSP1 plus / PTX3 plus myofibroblastov (obrázok 2K–2M).

Depozity PTX3 sú spojené s aktiváciou komplementového systému

Nakoniec sme skúmali, či vklady PTX3 boli spojené s aktiváciou komplementu. V skutočnosti, rovnako ako iné zložky pentraxínovej rodiny, PTX3 môže regulovať aktiváciu klasickej dráhy komplementu [7]. Aby sme definovali vzťah medzi PTX3 a aktiváciou komplementu, vykonali sme dvojitú imunofluorescenciu na vyhodnotenie expresie PTX3 a terminálu Komplex komplementu, C5b{7}}, využívajúci protilátku namierenú proti C9-neoepitopu. Pozorovali sme významnú spoločnú lokalizáciu depozitov PTX3 a C5b-9 (obrázok 3A, 3B). Koncový komplex komplementu bol lokalizovaný na peritubulárnej úrovni, ako aj v peritubulárnych kapilárach spolu s vrstvou endotelových buniek, ako sme už predtým preukázali [23, 28]. Keďže PTX3 môže aktivovať komplementový systém prostredníctvom klasickej a lektínovej dráhy, hodnotili sme ukladanie C1q a MBL v renálnom parenchýme. Je zaujímavé, že depozity C1q (obrázok 3E, 3F) a MBL (obrázok 3C, 3D) sa našli hlavne na intersticiálnej a kapilárnej úrovni (obrázok 3C až 3F), ako už bolo opísané [23] a kolokalizované s depozitmi PTX3.

C1-inhibítor interferuje s väzbou PTX3 na endotelové bunky

V našej predchádzajúcej práci [23] sme preukázali, že podávanie C1-inhibítora viedlo k významnému zníženiu ukladania komplementu, so zníženým náborom infiltrujúcich zápalových buniek a tubulointersticiálnym poškodením. Preto sme skúmali hladinu expresie PTX3 u zvierat liečených rhC1-INH. Zistili sme, že infúzia C1-inhibítora znížila depozity PTX3 v peritubulárnych kapilárach a intersticiálnej úrovni po 15 minútach po reperfúzii (obrázok 4A).

Okrem toho, aby sme podporili hypotézu, že zníženie depozitov PTX3 u zvierat liečených rhC1-INH bolo spojené s inhibíciou poškodenia endotelu, vykonali sme experimenty in vitro a vyhodnotili sme väzbu rhC1-INH a PTX3 na kultivované EC za normálnych podmienok alebo v prítomnosti bunkového stresu (obrázok 4B). Analýza FACS ukázala, že EC za normálnych podmienok neviaže rhC1-INH ani PTX3. V súlade s našou predchádzajúcou štúdiou [26] sme pozorovali zvýšenú bunkovú väzbu rhC1-INH na H2O2-stimulovanú EC v porovnaní s bazálnymi podmienkami. Okrem toho v neprítomnosti rhC1-INH by PTX3 mohol viazať aktivovaný EC. Je zaujímavé, že keď H2O2-aktivovaný EC bol inkubovaný s PTX3 a rhC1-INH, pozorovali sme, že C1INH bol schopný chrániť EC po blokovaní väzby PTX3.

DISKUSIA

V tejto štúdii sme demonštrovali depozíciu PTX3 v skorej fáze I/R poškodenia obličiek a jej možný príspevok k rozvoju EndMT. Je zaujímavé, že sme zistili, že aktivácia komplementu sprostredkovaná PTX{1}} sa vyskytuje hlavne na vaskulárnej úrovni, pričom sa lokalizuje spolu s C1q a MBL, rozpoznávacími molekulami klasických a lektínových dráh kaskády komplementu.

Poškodenie I/R spúšťa výraznú zápalovú odpoveď charakterizovanú aktiváciou komplementu, voľnými kyslíkovými radikálmi a produkciou prozápalových cytokínov, čo vedie k aktivácii vaskulárneho endotelu a periférnych leukocytov [29, 30]. Počas I/R poranenia vedie aktivácia komplementu k ukladaniu komponentov komplementu na povrchovú membránu poškodeného a dysfunkčného EC so súčasnou tvorbou anafylatoxínov a amplifikáciou zápalového procesu [31]. Počas zápalu sa PTX3 rýchlo zvyšuje a mohol by zohrávať ústrednú úlohu pri modulácii endotelovej odpovede. PTX3 bol skutočne indikovaný ako potenciálny biomarker vaskulárnej endoteliálnej dysfunkcie pri niekoľkých ochoreniach, vrátane chronickýchobličkyochorenie, preeklampsia a viaceré cievne ochorenia [7, 16, 17, 32]. Ukázali sme tiež, že PTX3 sa podieľa na iných vaskulárnych komplikáciách, ako je zlyhanie arteriovenóznej fistuly u hemodialyzovaných pacientov [33]. Tieto pozorovania naznačujú, že PTX3 by mohol byť mostom medzi zápalovou odpoveďou a endoteliálnou dysfunkciou [34]. V súlade s týmito štúdiami sme pozorovali depozity PTX3 na endoteliálnej úrovni už po 15 minútach po reperfúzii (obrázok 2A, 2B). Naše výsledky tiež ukázali, že v skorej fáze I/R poranenia sa PTX3 kolokalizoval s myofibroblastovým markerom, FSP-1 (obrázok 2I, 2J), ale nie s alfa-SMA, markerom exprimovaným aktivovaným myofibroblastom (obrázok 2C, 2D). Celkovo by tieto údaje mohli naznačovať, že endoteliálna dysfunkcia a proces EndMT [35], pozorované u I/R zvierat [26], sa prvýkrát vyskytli v EC exprimujúcom PTX3.

Spojenie medzi PTX3 a zápalovými bunkami je široko uznávané. V tomto článku sme sa špecificky zamerali na inherentné účinky PTX3 na intersticiálnu infiltráciu leukocytov, ktoré sú hlavným zdrojom PTX3 [36]. Konkrétne sme zistili, že makrofágy a dendritické bunky po 15 minútach po reperfúzii exprimujú vyššie hladiny PTX3 (obrázok 2E až 2H). Tieto údaje sú v súlade s narastajúcim množstvom dôkazov, ktoré naznačujú významnú úlohu vrodenej imunity pri sprostredkovaní skorého poškodenia pri poranení I/R [23]. Včasná aktivácia komplementu v obličkovom tkanive po I/R poranení vedie k vytvoreniu niekoľkých zápalových mediátorov, ktoré zvyšujú nábor imunitných buniek [21, 23, 37, 38]. Nedávne štúdie identifikovali PTX3 ako jednu z hlavných zložiek siete, ktorá riadi zápalovú odpoveď vyvolanú I/R poranením [39]. V rôznych experimentálnych modeloch I/R poškodenia môže PTX3 vykonávať dvojité opačné úlohy na špecifické tkanivá [40, 41]. Včasná produkcia PTX3 je spojená s poškodením obličiek, pretože indukuje skorú expresiu endotelových adhéznych molekúl a chemokínov, ktoré urýchľujú lokálnu maladaptívnu zápalovú odpoveď.

Naopak, predĺžená lokálna produkcia PTX3 zabraňuje nadmernému zápalu orgánov a dysfunkcii [41].

PTX3 je komplementový kaskádový modulátor [9, 42]; to je v súlade s pleiotropnými vlastnosťami PTX3, čo naznačuje dvojitú úlohu PTX3 ako modulátora alebo zosilňovača vrodenej imunitnej odpovede [39]. Spočiatku PTX3 aktivuje komplement väzbou C1q a MBL [43]; skorý zvýšený zápal je však potrebné obmedziť na cieľovú oblasť. Preto by PTX3, náborom faktora H alebo inhibíciou angiogenézy, mohol tiež znížiť zápalovú odpoveď a aktiváciu komplementu, čím by sa zachoval parenchým obličiek pred zápalovým poškodením [43]. Hoci aktivácia komplementu v I/R u hlodavcov je lokalizovaná hlavne na tubulárnej úrovni [44], počas reperfúznej fázy je endotel primárnym cieľom rôznych prozápalových látok vrátane mediátorov komplementu [2]. Už sme predtým demonštrovali, že na prasacom modeli poranenia I/R, ako aj u pacientov s DGF, k aktivácii komplementového systému dochádza v skorej fáze, na peritubulárnych kapilárach, v interstíciu a na glomerulárnom endoteli [23]. Naše údaje ukázali jasnú spoločnú lokalizáciu depozitov C5b-9 na PTX3 plus EC po 15 minútach po reperfúzii (obrázok 3A, 3B). Preto sa zdá, že endotel obličiek je prevládajúcim miestom aktivácie komplementu sprostredkovanej PTX{22}} v skorej fáze I/R poškodenia v predklinických aj klinických podmienkach.

Interakcia pentraxínov s C1q a jej úloha pri aktivácii klasickej komplementovej dráhy sú dobre opísané [45–47]. V kontexte vrodených imunitných odpovedí môže PTX3 viazať rôzne zložky komplementu a modulovať aktiváciu komplementu [43, 48]. PTX3 aktivuje komplement väzbou C1q [49]. Naše výsledky na zvieracom modeli jasne ukázali, že PTX3 môže sprostredkovať aktiváciu klasickej dráhy interakciou s C1q (obrázok 3E, 3F). Okrem toho PTX3 tiež moduluje lektínovú dráhu komplementu, ako je znázornené na obrázku 3C, 3D. MBL viaže PTX3 cez svoju kolagénu podobnú doménu [45] a komplexy MBL/PTX3 získavajú C1q a vyvolávajú ukladanie C3 a C4 na povrchy cieľových buniek.

Celkovo tieto výsledky naznačujú ústrednú úlohu PTX3 pri sprostredkovaníobličkypoškodenie pri poškodení I/R, čo by mohlo mať dôležité dôsledky pre terapie zamerané na komplement pri poškodení I/R obličiek.

V našej predchádzajúcej štúdii [26] sme skúmali zapojenie komplementu do sprostredkovania aktivácie EC pomocou rekombinantnej formy C1-INH, silného inhibítora proteáz klasickej a lektínovej dráhy komplementu (C1r, C1s, a MASP2). Na rovnakom zvieracom modeli sme ukázali (obrázok 4A), že terapeutická inhibícia oboch dráh pomocou rhC1INH znížila depozity PTX3 v peritubulárnych kapilárach a intersticiálnej úrovni po 15 minútach po reperfúzii. Tieto údaje potvrdené výsledkami in vitro na EC (obrázok 4B) nás viedli k hypotéze, že rhC1INH môže chrániť poškodený EC po blokovaní väzby PTX3. V literatúre existujú dôkazy o väzbe C1-INH na endotelové adhézne molekuly, exprimované na aktivovanom endoteli, nazývané selektíny, najmä P a E-selektíny [50, 51]. Táto väzba na EC môže interferovať s interakciou endotel-leukocyty počas zápalu a predstavuje ďalší dôležitý protizápalový mechanizmus [50, 51]. Preto sme predpokladali, že rh-C1INH môže viazať aktivovaný EC a sprostredkovávať lokálnu reguláciu aktivácie komplementu a zápalového procesu. V našich predchádzajúcich štúdiách sme preukázali zapojenie komplementu do I/R poranenia a iných imunitne sprostredkovaných renálnych ochorení [38, 52–54]. Mechanizmy aktivácie komplementu v tomto zvieracom modeli by mohli mať dôležité dôsledky pre interpretáciu údajov očakávaných v ľudskom prostredí. Na úspešný vývoj terapeutických zásahov zameraných na aktiváciu komplementu [36, 54] je nevyhnutné stanoviť platnosť údajov o prasatách vo vzťahu k tomu, čo sa vyskytuje za klinických okolností. Keďže tento výskum je obmedzený na pozorovacie štúdie, sú potrebné ďalšie experimenty na vymedzenie vzájomne prepojených mechanizmov medzi PTX3 a doplnkom, ktoré by mohli zvýrazniť nové terapeutické stratégie. Z vyššie uvedených výsledkov naše údaje podporujú hypotézu, že PTX3 môže regulovať viaceré aspekty I/R poškodenia sprostredkovaného komplementom, čím predstavuje potenciálny terapeutický cieľ.

MATERIÁLY A METÓDY

Model poškodenia obličiek I/R ošípaných

Zvierací model I/R poškodenia obličiek bol vyvinutý, ako už bolo opísané [23]. Po schválení etickou komisiou Ministerstva zdravotníctva sa 4-mesačná samica veľkých bielych ošípaných (n=8, n{3}} v skupine, 20 kg) experimentálny otvorený chirurgický zákrok v celkovej anestézii. Pred zavedením anestézie zvieratá hladovali 24 hodín. Elektrokardiogram, srdcová frekvencia, saturácia hemoglobínu kyslíkom, zloženie dýchacích plynov, dychová frekvencia, dychový objem, tlak v dýchacích cestách, systolický arteriálny krvný tlak a centrálny venózny tlak boli nepretržite monitorované a zaznamenávané automaticky (Ohmeda Modulus CD; DatexOhmeda, Helsinki, Fínsko) . Ľavá renálna artéria a žila boli izolované a cievna slučka bola umiestnená okolo renálnej artérie pomocou pravouhlej svorky. Pred ischémiou (T0) bola vykonaná renálna biopsia. Potom sa vyvolala ischemická fáza (30 minút) potiahnutím cievnej slučky. Potom sa uskutočnili viaceré biopsie 15, 30 a 60 minút po reperfúzii; zvieratá boli usmrtené 24 hodín po chirurgickom zákroku. Časť každej bioptickej vzorky bola okamžite zmrazená v médiu s optimálnou teplotou rezania (Tissuetek, Pittsburgh, PA) a uložená v tekutom dusíku. Ďalšia časť sa fixovala v pufrovanom formalíne (4 percentá) počas 12 hodín a zaliala sa do parafínu použitím štandardných postupov.

Mikroskopická štúdia

Vzorky obličiek z obličkových biopsií zaliate v parafíne sa použili na konvenčné histologické farbenie (H&E, kyselina jodistá-Schiff). Obrázky boli získané zariadením Aperio ScanScope CS2 (Aperio Technologies, Vista, CA, USA). Tubulárne intersticiálne a glomerulárne lézie boli hodnotené pomocou kvalitatívnej analýzy dvoma pozorovateľmi (CD, MR), ktorí nevedeli o pôvode

Protilátky

Primárne protilátky použité v tejto štúdii rozpoznávali nasledujúce antigény: PTX3 (MNB4: priamo proti PTX3 N-terminálnej doméne, Exira Life Sciences In., Larsen, Švajčiarsko); CD163 (monocyty/makrofágy, US Biological, Swampscott, MA); SWC3a (dendritické bunky, [55] 74-22-15A, BD Biosciences); FSP1 (fibroblastový špecifický proteín 1, Abcam, Cambridge, UK); alfa-aktín hladkého svalstva (Santa Cruz Biotechnology Inc.; Santa Cruz, CA, USA); C1q (R9/2, AbDSerotec; Kidlington, Spojené kráľovstvo); MBL (3E7: priamo proti doméne rozpoznávania sacharidov MBL, biotechnológia Hycult, Uden, Holandsko) a neoantigén C9 (aE11, biotechnológia Hycult). Krížová reaktivita bola overená preinkubáciou špecifických protilátok pred ich použitím s ľudskými peptidmi použitými na ich získanie. Predinkubácia zrušila špecifické farbenie na tkanive ošípaných.

Tkanivová imunofluorescencia a konfokálna laserová skenovacia mikroskopia

Charakterizácia a lokalizácia signálu PTX3 sa skúmala na zmrazenom tkanive obsiahnutom v médiu OCT (Tissue-Tek). Sklíčka sa inkubovali s 5 percentným králičím sérom počas 1 hodiny pri 37 °C. Sklíčka sa potom inkubovali počas 1 hodiny pri teplote miestnosti so špecifickými protilátkami. Po troch premytiach v PBS boli sklíčka potom inkubované s príslušnými sekundárnymi protilátkami (Alexa Flour 488 a 555, Molecular Probes, Eugene, OR). Všetky rezy boli kontrastne zafarbené TO-PRO-3 (Molecular Probes). Negatívne kontroly boli pripravené s irelevantnými protilátkami. Rezy sa analyzovali pomocou konfokálneho laserového skenovacieho mikroskopu Leica TCS SP2 (Leica, Wetzlar, Nemecko). Počet infiltrujúcich buniek bol meraný v najmenej 10 vysokovýkonných (x630) poliach/reze dvoma nezávislými pozorovateľmi, ktorí neboli zaslepení k pôvodu sklíčok. Konečné počty boli priemerom týchto dvoch meraní. V žiadnom prípade nebola variabilita medzi pozorovateľmi vyššia ako 20 percent.

Bunková kultúra a analýza prietokovou cytometriou

Endotelové bunky ľudskej pupočníkovej žily (HUVEC, EC) boli zakúpené od American Type Culture Collection (ATCC-LGC Standards, Sesto San Giovanni, Taliansko). EC bol pestovaný v ich odporúčanom médiu, EndoGro (Merck Millipore, Darmstadt, Nemecko). EC bola nanesená na platne s hustotou 1{{10}},000 buniek/cm2 a bola stimulovaná pôsobením H202 (3 percentá, 1 hodina). Potom sa bazálne a stimulované EC premyli dvakrát PBS a odstránili sa s PBS-EDTA 2 mM a trypsínom 0,001x. Potom sa bunky resuspendovali v PBS a inkubovali sa s PTX3 (rekombinantný ľudský PTX3, Sigma-Aldrich, Merck, Nemecko) (1 ug/ml) alebo/a s rhC1-INH (Ruconest®, Pharming) (2,5 ug /ml) počas 60 minút. Po trojnásobnom premytí PBS 1X sa bunky resuspendovali v pufri prietokovej cytometrie (FACS) (fyziologický roztok pufrovaný fosfátom, pH 7,2, 0,2 percenta hovädzieho sérového albumínu a 0,02 percenta azidu sodného) a inkubovali sa s blokujúcim činidlom FCR (Miltenyi Biotec) 10 min pri izbovej teplote. Po blokovaní sa EC inkubovali s králičím anti-humánnym C1-INH (poskytol prof. M. Daha, University of Leiden, riedenie 1//100) alebo/a s potkaním anti-PTX3 (MNB4, Exira Life Sciences In., riedenie 1/20) pri teplote miestnosti počas 30 minút a premyté FACS pufrom. Potom sa bunky inkubovali s kozím anti-králičím IgG PE (Molecular Probes, riedenie 1/100) alebo/s anti-potkaním IgG FITC (Molecular Probes, 1/100 riedenie) pri teplote miestnosti počas 30 minút a trikrát sa premyli. Bunky sa analyzovali pomocou FC500 (Beckman Coulter, Brea, CA, USA) a softvéru Kaluza. Oblasť pozitivity sa určila pomocou izotypovo zhodnej mAb a celkovo sa získalo 104 udalostí pre každú vzorku. Boli uskutočnené tri nezávislé experimenty.

Štatistická analýza

Dáta sú prezentované ako priemer ± štandardná odchýlka (SD) a sú porovnávané pomocou analýzy rozptylu alebo párového Studentovho t-testu, podľa potreby. Rozdiely sa považovali za štatisticky významné, keď hodnoty p boli nižšie ako 0.05. Dáta sa analyzovali pomocou softvérového balíka Statview (verzia 5.0) (SAS Inc. Co., Cary, NC, USA). Grafy boli zobrazené pomocou softvéru GraphPad Prism Software 5.

Skratky

I/R: ischémia/reperfúzia; EC: endotelové bunky; PTX3: pentraxín 3; FSP-1: fibroblast-špecifický proteín 1; N-kadherín: neurónový kadherín; alfa-SMA: alfa-aktín hladkého svalstva.

AUTORSKÉ PRÍSPEVKY

CD koordinoval štúdiu, podieľal sa na imunoznačení a konfokálnej mikroskopii obličkových rezov a vypracoval rukopis. AS a RF sa podieľali na návrhu štúdie, prispeli k analýze údajov, vykonali in vitro experimenty a kriticky revidovali rukopis. MR a GSN vykonali histopatologickú analýzu obrazu. LL, FS, AMC vykonali zvierací model ischemicko-reperfúzneho poškodenia a pomohli revidovať rukopis. GL, PD a MB vykonali všetky chirurgické zákroky na modeli ošípaných a pomohli revidovať rukopis. MRD, P.vdP., C.vK., a FS rukopis prepracovali.

PP, ER, GG, GS a LG rukopis kriticky revidovali. GC poskytla nové analytické nástroje, navrhla a dohliadala na výskum. CD, AS a RF rovnako prispeli k tejto štúdii. Všetci autori prispeli k článku a schválili predloženú verziu.

POĎAKOVANIE

Ďakujeme Claudii Curci z Renálnej, dialyzačnej a transplantačnej jednotky Kliniky urgentného príjmu a orgánových transplantácií,

Univerzite v Bari za vynikajúcu technickú pomoc.

KONFLIKT ZÁUJMOV

Autori vyhlasujú, že nie sú v konflikte záujmov.

FINANCOVANIE

Túto štúdiu podporila Univerzita v Bari „Aldo Moro“, talianske ministerstvo zdravotníctva (GR 2016- 02362239 „Prístup založený na transkriptomii na identifikáciu prediktívnych faktorov a terapeutických cieľov pre oneskorenú funkciu štepu vobličkypríjemcovia transplantátu“, Bando di Ricerca Finalizzata 2016, CD získalo štipendium na tento projekt) a Fondo Sociale Europeo, Azione I.2 „Attrazione e Mobilità Internazionale dei Ricercatori“- AIM-1810057-aktivita 2 udelená AS

LITERATÚRA

1. Bonventre JV, Yang L. Bunková patofyziológia ischemickej akútnejobličkyzranenie. J Clin Invest. 2011; 121:4210–21.

2. Jang HR, Rabb H. Vrodená imunitná odpoveď pri ischemickej akútnejobličkyzranenie. Clin Immunol. 2009; 130:41–50.

3. Ricklin D, Hajishengallis G, Yang K, Lambris JD. Doplnok: kľúčový systém pre imunitný dohľad a homeostázu. Nat Immunol. 2010; 11:785-97.

4. Thurman JM, Holers VM. Ústredná úloha alternatívnej komplementovej dráhy pri ľudských chorobách. J Immunol. 2006; 176:1305–10. PMID: 16424154

5. Franzin R, Stasi A, Fiorentino M, Stallone G, Cantaluppi V, Gesualdo L, Castellano G. Zápalový a komplementárny systém: prepojenie medzi akútnymObličkyZranenie a chronické poškodenie štepu. Front Immunol.

2020; 11:734.PMID:32457738

6. Deban L, Jaillon S, Garlanda C, Bottazzi B, Mantovani A. Pentraxíny vo vrodenej imunite: lekcie z PTX3. Cell Tissue Res. 2011; 343:237–49.PMID:20683616

7. Cieślik P, Hrycek A. Dlhý pentraxín 3 (PTX3) vo svetle jeho štruktúry, mechanizmu účinku a klinických dôsledkov. Autoimunita. 2012; 45:119–28.PMID:21988562

8. Kunes P, Holubcová Z, Koláčková M, Krejsek J. Pentraxín 3(PTX 3): endogénny modulátor zápalovej odpovede. Mediátory zápalu. 2012; 2012:920517.PMID:22577258

9. Garlanda C, Bottazzi B, Bastone A, Mantovani A. Pentraxíny na križovatke medzi vrodenou imunitou, zápalom, ukladaním matrice a ženskou plodnosťou. Annu Rev Immunol. 2005; 23:337–66,115756PMID:15771574

10. Bottazzi B, Garlanda C, Cotena A, Moalli F, Jaillon S, Deban L, Mantovani A. Dlhý pentraxín PTX3 ako prototypový receptor na rozpoznávanie humorálneho vzoru: súhra s bunkovou vrodenou imunitou. Immunol Rev. 2009; 227:9–18.PMID:19120471

11. Ma YJ, Doni A, Hummelshøj T, Honoré C, Bastone A, Mantovani A, Thielens NM, Garred P. Synergia medzi fikolinom-2 a pentraxínom 3 zvyšuje vrodené rozpoznávanie imunity a ukladanie komplementu. J Biol Chem. 2009; 284:28263–75.PMID:19632990

12. Netti GS, Lucarelli G, Spadaccino F, Castellano G, Gigante M, Divella C, Rocchetti MT, Rascio F, Mancini V, Stallone G, Carrieri G, Gesualdo L, Battaglia M, Ranieri E. PTX3 moduluje imunoflogózu v nádore mikroprostredia a je prognostickým faktorom pre pacientov s jasnobunkovým karcinómom obličky. Starnutie (Albany NY). 2020; 12:7585–602.PMID:32345771

13. Souza DG, Amaral FA, Fagundes CT, Coelho FM, Arantes RM, Sousa LP, Matzuk MM, Garlanda C, Mantovani A, Dias AA, Teixeira MM. Dlhý pentraxín PTX3 je rozhodujúci pre zápal tkaniva po

intestinálna ischémia a reperfúzia u myší. Am J Pathol. 2009; 174:1309–18.PMID:19286566

14. Jaillon S, Peri G, Delneste Y, Frémaux I, Doni A, Moalli F, Garlanda C, Romani L, Gascan H, Bellocchio S, Bozza S, Cassatella MA, Jeannin P, Mantovani A. Humorálny receptor rozpoznávania vzoru PTX3 je uložený v neutrofilných granulách a lokalizuje sa v extracelulárnych pasciach. J Exp Med. 2007; 204:793–804.PMID:17389238

15. Tong M, Carrero JJ, Qureshi AR, Anderstam B, Heimbürger O, Bárány P, Axelsson J, Alvestrand A, Stenvinkel P, Lindholm B, Suliman ME. Plazmatický pentraxín 3 u pacientov s chronicobličkyochorenie: asociácie s renálnou funkciou, proteínovou energiou, chradnutím, kardiovaskulárnym ochorením a úmrtnosťou. Clin J Am Soc Nephrol. 2007; 2:889–97.PMID:17702732

16. Witasp A, Rydén M, Carrero JJ, Qureshi AR, Nordfors L, Näslund E, Hammarqvist F, Arefin S, Kublickiene K, Stenvinkel P. Zvýšené hladiny v obehu a tkanivová expresia pentraxínu 3 pri uremii: odraz endotelovej dysfunkcie. PLoS One. 2013; 8: e63493.PMID:23658833

17. Presta M, Camozzi M, Salvatori G, Rusnati M. Úloha rozpustného receptora rozpoznávania vzoru PTX3 vo vaskulárnej biológii. J Cell Mol Med. 2007; 11:723–38.PMID:17760835

18. Bottazzi B, Inforzato A, Messa M, Barbagallo M, Magrini E, Garlanda C, Mantovani A. Pentraxíny PTX3 a SAP vo vrodenej imunite, regulácii zápalu a prestavbe tkaniva. J Hepatol. 2016; 64:1416–27.

19. Xiao Y, Yang N, Zhang Q, Wang Y, Yang S, Liu Z. Pentraxín 3 inhibuje intersticiálnu fibrózu vyvolanú akútnym poškodením obličiek prostredníctvom supresie dráhy IL-6/Stat3. Zápal. 2014; 37:1895–901.PMID:24854162

20. Inforzato A, Reading PC, Barbati E, Bottazzi B, Garlanda C, Mantovani A. „Sladká“ stránka dlhého pentraxínu: ako glykozylácia ovplyvňuje funkcie PTX3 pri vrodenej imunite a zápale. Front Immunol. 2013; 3:407. PMID: 23316195