Fenyletanoidové glykozidy indukujú apoptózu v bunkách Eca-109 cestou závislou od mitochondrií

Úvod

Rakovina pažeráka je jedným z najbežnejších typov rakoviny s 11. najvyššou morbiditou a 6. najvyššou mierou úmrtnosti na celom svete a v roku 2015 spôsobila ~439,{3}} úmrtnosť. Výskyt rakoviny pažeráka sa medzi rôznymi regiónmi výrazne líši, pričom východná Ázia a východná a južná Afrika vykazujú najvyššiu mieru incidencie a západná Afrika vykazuje najnižšiu mieru v roku 2012. V Číne boli odhadované prípady rakoviny pažeráka a úmrtnosť 477,000 a 375,000, v tomto poradí , v roku 2015. Hoci sa miera chorobnosti na rakovinu pažeráka v rokoch 2005 až 2015 v krajinách so stredným a vysokým stredným sociodemografickým indexom znížila, miera úmrtnosti zostáva vysoká kvôli zlej prognóze. Kombinácia chirurgickej resekcie s chemoterapiou alebo rádioterapiou sa používa na liečbu rakoviny pažeráka, avšak bolo hlásené, že medzi rokmi 2003 a 2014 zostala 5-ročná miera prežitia<20% in China, USA and Europe. For these reasons, it is urgent to develop novel therapeutic agents to treat esophageal cancer. used to treat various cancer types, including non Traditional Chinese herbal medicine (CHM) -small cell lung cancer, colorectal cancer, and hepatocellular carcinoma. Recently, clinical trials reported that the combination of CHM with chemotherapy or radiotherapy not only demonstrated several benefits on the quality of life and alleviating side effects induced by chemotherapy or radiotherapy but also improved the survival rate of patients with non-small cell lung, liver, gastric, colorectal, nasopharyngeal or cervical cancer. However, there is conflicting evidence regarding the efficacy of CHM treatment on esophageal cancer. Numerous studies determined that several herbal medicines or components could inhibit the growth of esophageal cancer cells in vitro and in vivo, including Andrographis paniculata, Daikenchuto, icariin, Rosa Roxburghii Tratt and Fagopyrum Cymosum, Jaridonin, Marsdenia tenacissima, OP16 (a novel ent-kaurene diterpenoid), Qigesan and Tonglian decoction. Cistanche is a type of CHM and exerts various biological functions, including anti‑oxidation, anti‑inflammation, and neuroprotection. Our previous studyto preukázalfenyletanoidové glykozidy Cistanche tubulosa(CTPG) by mohla potlačiť rast buniek melanómu B16-F10 in vitro a in vivo (24). Avšak slabá rozpustnosť predtým používaného CTPG vo vode obmedzuje vývoj liečiva. Preto sa použil vo vode rozpustný CTPG (CTPG-W) a skúmal sa protinádorový účinok na bunky rakoviny pažeráka (Eca-109). Zistilo sa, že CTPG-W môže v závislosti od dávky inhibovať životaschopnosť buniek Eca-109 prostredníctvom indukcie apoptózy prostredníctvom mitochondriálne závislej dráhy.

PRÍRODNÁ CISTANCHE TUBULOSA NA ZLEPŠENIE SEXUÁLNEJ FUNKCIE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Materiály a metódy

Zvieratá.

Samice myší C57BL/6 (6-8 týždňov, ~25 g) boli zakúpené od Beijing Laboratory Animal Research Center (Peking, Čína) a umiestnené v prostredí s kontrolovanou teplotou (25 °C) so svetelným cyklom (12/ 12) Zvieracie zariadenie univerzity Xinjiang (Urumqi, Čína). Všetky zvieratá dostali vodu a potravu bez patogénov.

Bunková línia a kultúra.

Bunková línia ľudského karcinómu pažeráka (Eca{0}}) bola uchovaná kľúčovým laboratóriom biologických zdrojov a genetického inžinierstva Xinjiang (College of Life Science and Technology, Univerzita Xinjiang, Urumqi, Čína) a kultivovaná v RPMI{{1} } médium (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA) doplnené 10 % tepelne inaktivovaným fetálnym hovädzím sérom (FBS; MRC, EN MOASAI Biological Technology Co., Ltd, Jiangsu, Čína), 1 % L -glutamín (100 mM), 100 U/ml penicilínu a 100 ug/ml streptomycínu pri 37 °C vo vlhkej atmosfére obsahujúcej 5 % C02.

Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC).

CTPG-W (kat. č. SGJG20170410) bol zakúpený od Shanghai Upbio Tech Co., Ltd. (Shanghai, Čína). Hlavné zlúčeniny CTPG boli kvalifikované a kvantifikované pomocou HPLC podľa našej predchádzajúcej štúdie (24). V stručnosti, HPLC sa uskutočňovala na kolóne ZORBAX SB-C18 (250 x 4,6 mm; 5 um) pri 30 °C a eluovala sa 0,2 % roztokom kyseliny mravčej a gradientom metanolu začínajúceho na 23 %, pretože každú minútu sa pridával 1 ml. 45 minút, kým sa nedosiahne 31 %. Celkovo sa vstreklo 10 ul vzorky a detegovalo sa pri 330 nm. Echinakozidový štandard bol zakúpený od Shanghai Baoban Biotech Co., Ltd. (Shanghai, Čína) a akteozidový štandard bol zakúpený od Sigma-Aldrich (Merck KGaA, Darmstadt, Nemecko). Štandardy sa použili na analýzu zložiek CTPG-W.

MTT test.

Bunková proliferácia sa merala pomocou MTT testu. Bunky Eca{0}} boli naočkované do 96-jamkových platní v hustote 5x103 bunky v 100 µl RPMI{{5 }} médium/jamka a kultivované pri 37 °C počas 24 hodín, potom ošetrené rôznymi koncentráciami (0, 200, 400, 600 a 800 ug/ml) CTPG-W alebo 0,4 % dimetylsulfoxidu (DMSO) počas 24, 48 a 72 h. DMSO sa použil ako kontrola rozpúšťadla (800 ug/ml CTPG-W obsahujúci 0,4 % DMSO). Ako pozitívna kontrola sa použila cisplatina (20 ug/ml). Následne sa supernatant odstránil po odstredení pri 225 xg počas 5 minút pri teplote miestnosti a do každej jamky sa pridalo 100 ul roztoku MTT (0,5 mg/ml v RPMI-1640 médiu bez FBS) a inkubovalo sa pri 37 °C 3. h. Vytvorené kryštály formazanu sa rozpustili v 200 ul DMSO. Hodnoty optickej hustoty (OD) sa merali pri vlnovej dĺžke 490 nm pomocou 96-jamkovej čítačky mikrodoštičiek (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). Relatívna životaschopnosť buniek sa vypočítala podľa vzorca: Životaschopnosť buniek (%)=(OD ošetrené/ODneošetrené)x100 %. Morfológia buniek Eca-109 sa pozorovala pomocou invertovaného fluorescenčného mikroskopu (zväčšenie x 200) (Nikon Eclipse Ti-E; Nikon Corporation, Tokio, Japonsko).

Na proliferáciu splenocytov sa myši C57BL/6 usmrtili cervikálnou dislokáciou a izolovali sa sleziny. Vytvorila sa jednobunková suspenzia a splenocyty sa naočkovali na 96-jamkové platne v hustote 1x105 buniek/jamku v 100 ul RPMI-1640 média a potom sa ošetrili rôznymi koncentráciami (0, 200, 400, 600 a 800 ug/ml) CTPG-W počas 24, 48 a 72 hodín pri 37 °C s 5 % CO2. Proliferácia splenocytov sa merala MTT testom podľa vyššie uvedeného protokolu. Stimulačný index{20}}ODliečené/ODneliečené.

Meranie apoptózy a bunkového cyklu. Bunky Eca{{0}} boli kultivované v 60 mm miskách pri hustote 2,5x105 buniek/misku počas 24 hodín a ošetrené rôznymi koncentráciami ({{31} }, 200, 400, 600 a 800 ug/ml) CTPG-W alebo 0,4 % DMSO počas 24 hodín pri 37 °C s 5 % CO2. Bunky boli zozbierané a zafarbené pomocou súpravy Annexin V-fluoresceín izotiokyanát (FITC)/propídium jodid (PI) na detekciu apoptózy (Shanghai Shengsheng Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, Čína), podľa protokolov výrobcu. Vzorky sa odobrali prietokovou cytometriou (BD FACSCalibur; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) a analyzovali sa pomocou FlowJo 7.6 (Tree Star, Inc., Ashland, OR, USA). Na analýzu účinku CTPG-W na bunkový cyklus sa 2,5 x 105 Eca{24}} buniek vysialo do 60 mm kultivačných misiek a ošetrilo sa CTPG-W (0, 100, 200 a 400 ug/ml) alebo 0,4 % DMSO počas 24 hodín pri 37 °C s 5 % C02. Všetky bunky boli zozbierané a dvakrát premyté ľadovo studeným PBS (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), potom fixované v 70% ľadovo studenom etanole pri 4 °C počas 30 minút. Po dvojnásobnom premytí ľadovo studeným PBS boli bunky resuspendované v 300 ul PI/RNázového farbiaceho pufra (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) počas 10 minút pri teplote miestnosti. Distribúcia bunkového cyklu sa analyzovala pomocou softvéru ModFit LT 3.0 prietokovou cytometriou (BD FACSCalibur).

PRÍRODNÁ CISTANCHE TUBULOSAProti únaveChráňte pečeň PHGS 75 % ECH 30 % ACT 12 %

Analýza mitochondriálneho membránového potenciálu (Δψm) a reaktívnych foriem kyslíka (ROS).Na analýzu Δψm sa bunky Eca{{0}} ošetrili CTPG-W (0, 400, 600 a 800 µg/ml) alebo 0,4 % DMSO pre 24 hodín pri 37 °C s 5 % CO2 a zafarbené súpravou na test mitochondriálneho membránového potenciálu s JC-1 (Beyotime Institute of Biotechnology, Shanghai, Čína), podľa protokolu výrobcu, počas 20 minút pri 37˚ C. Po dvojnásobnom premytí JC-1 premývacím pufrom (Beyotime Institute of Biotechnology) boli vzorky resuspendované s 300 ul JC-1 premývacieho pufra a analyzované prietokovou cytometriou (BD FACSCalibur). Fluorescencia farbiva JC-1 v bunkách Eca-109 bola tiež pozorovaná pomocou invertovaného fluorescenčného mikroskopu (zväčšenie x 200; Nikon Eclipse Ti-E). Na analýzu ROS sa bunky Eca{21}} ošetrili CTPG-W (0, 400, 600 a 800 ug/ml) počas 2, 4, 6, 12 a 24 hodín a zafarbili sa testom reaktívnych druhov kyslíka (Beyotime Institute of Biotechnology), podľa protokolu výrobcu, 20 minút pri 37 °C. Po trojnásobnom premytí ľadovo studeným PBS sa vzorky odobrali prietokovou cytometriou (BD FACSCalibur) a analyzovali sa pomocou softvéru FlowJo 7.6.

Obrázok 1. Kvalifikovaná kontrola CTPG-W. Zložky CTPG-W boli kvalitatívne a kvantitatívne analyzované pomocou vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie a porovnané so štandardmi echinakozidu a akteozidu. CTPG-W, vo vode rozpustné fenyletanoidové glykozidy zC. tubulosa.

Aktivita zachytávania 2,2-difenyl-1-pikrylhydrazylových (DPPH) radikálov. Aktivita zachytávania voľných radikálov CTPG-W bola stanovená pomocou testu voľných radikálov DPPH podľa publikovaného protokolu s menšou modifikáciou, pretože metanol bol nahradený etanolom, aby sa rozpustil DPPH (25, 26). Na meranie v ustálenom stave sa 150 µl DPPH (100 mmol/l) v etanole zmiešalo s rôznymi koncentráciami CTPG-W (25, 50, 75, 100, 250, 300, 400, 500 a 600 ug/ml) v 50 ul PBS a inkubovali sa v tme počas 30 minút pri teplote miestnosti. Absorbancia pri 517 nm bola detegovaná v prítomnosti a neprítomnosti CTPG-W. Ako pozitívna kontrola sa použilo celkovo 50 ul vitamínu C. Aktivita zachytávania radikálov DPPH sa vypočítala pomocou vzorca: zachytávanie (%)=[1-(Asample-Ablank)/A0] x100, kde Ablank je absorbancia kontroly (bez DPPH), vzorka je absorbancia vzorky a A0 je absorbancia PBS s DPPH.

Western blot analýza. Bunky Eca{{0}} boli ošetrené CTPG-W (0, 200, 600 ug/ml) alebo 0,4 % DMSO počas 24 hodín pri 37 °C s 5 % CO2. Nasledujúce premytie dvakrát PBS, bunky 

Obrázok 2. Účinok CTPG-W na rast Eca-109 buniek a splenocytov. (A) Bunky Eca-109 boli ošetrené rôznymi koncentráciami CTPG-W počas 24, 48 a 72 hodín a potom bola pomocou testu MTT detegovaná životaschopnosť buniek. (B) Morfologické zmeny buniek Eca-109 po ošetrení CTPG-W po 24 hodinách. (C) Splenocyty myší C57BL/6 sa ošetrili rôznymi koncentráciami CTPG-W počas 24, 48 a 72 hodín a potom sa proliferácia analyzovala testom MTT.**P<0.01 and ***P<0.001, compared with the control. CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. Búrlivé.

sa lýzovali v rádioimunoprecipitačnom lyzickom pufri (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd., Peking, Čína) počas 20 minút na ľade. Po centrifugácii pri 10, 000 x g počas 10 minút pri 4 °C sa supernatanty zozbierali a koncentrácie proteínov sa detegovali pomocou súpravy bicinchonínovej kyseliny (Thermo Fisher Scientific, Inc.) podľa protokolov výrobcu. Analýza Western blot sa uskutočnila podľa nášho predchádzajúceho opisu (24). Protilátky proti kaspáze-7 (kat. č. D120077), kaspáze-8 (kat. č. D155240), kaspáze-9 (kat. č. D220078), B-bunkovému lymfómu{ {13}} (Bcl-2) asociovaný X (Bax) (kat. č. D220073) a Bcl-2 (kat. č. D260117) a anti-myšia IgG-chrenová peroxidáza (HRP ) (kat. č. D111050) a anti-králičí IgG-HRP (kat. č. D110058) boli zakúpené od BBI Life Sciences (Shanghai, Čína). Protilátky proti kaspáze-3 (kat. č. E-AB-10050) a aktívnej kaspáze-3 (kat. č. E-AB-22115) boli zakúpené od spoločnosti Elabscience ( Wuhan, Čína). Ďalšie protilátky proti kaspáze -7 (kat. č. 9492), poly (ADP-ribóza) polymeráze (PARP) (kat. č. 9542), cytochrómu c (kat. č. AC909), c-Jun NH{ {37}}terminálna kináza (JNK) (kat. č. 9252S) a -aktín (kat. č. 58169) boli získané od Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA). Všetky primárne a sekundárne protilátky boli nariedené v pomere 1:1,000. Primárne protilátky boli inkubované pri 4 °C cez noc a sekundárne protilátky boli inkubované pri 37 °C počas 1 hodiny.

Obrázok 3. Apoptóza Eca-109 buniek indukovaná CTPG-W. Bunky boli ošetrené rôznymi koncentráciami CTPG-W počas 24 hodín. (A) Apoptotické a nekrotické bunky Eca-109 boli analyzované prietokovou cytometriou. Horný panel zobrazuje jednotlivé bodové grafy a dolný panel zobrazuje súhrnné údaje. * P<0.05 and ***P<0.001, compared with the control. (B) Total protein was isolated and the expression levels of Bax and Bcl-2 were detected with western blot analysis. Bcl-2, B-cell lymphoma-2; Bax, Bcl-2-associated X; DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. Búrlivé.

Cieľové proteíny sa detegovali pomocou súpravy na vylepšený chemiluminiscenčný test (Beyotime Institute of Biotechnology) podľa protokolu výrobcu.

Štatistická analýza. Štatistická významnosť sa vypočítala jednosmernou analýzou rozptylu s Tukeyho post hoc testom a výsledky sa analyzovali pomocou softvéru GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) medzi liečenými a kontrolnými skupinami. Všetky údaje boli prezentované ako priemer ± štandardná odchýlka. P<0.05 was considered to indicate a statistically significant difference.

EXTRAKT CISTANCHE TUBULOSA NA ZLEPŠENIE FUNKCIE OBLIČIEK PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Výsledky

CTPG-W potláča rast buniek Eca-109.

Zložky CTPG-W boli kvalifikované a kvantifikované pomocou HPLC (obr. 1), ktoré boli porovnané so štandardmi echinakozidu a akteozidu. Podľa retenčných časov píkov a plôch píkov obsahoval CTPG-W 39,16 % echinakozidu a 2,44 % akteozidu. Po prvé, účinok CTPG-W na životaschopnosť buniek Eca{8}} sa stanovil pomocou testu MTT. CTPG-W bol rozpustený v DMSO na 200 mg/ml a zriedený médiom RPMI-1640 obsahujúcim 10 % tepelne inaktivovaného FBS na uvedené koncentrácie. Bunky Eca{14}} boli ošetrené CTPG-W a životaschopnosť buniek bola analyzovaná pomocou MTT testu v uvedených časových bodoch. Liečba CTPG‑W významne znížila životaschopnosť buniek Eca{16}} spôsobom závislým od dávky a času (P<0.001; Fig. 2A). The morphology of Eca-109 cells was observed with an inverted fluorescence microscope (magnification, x200) following CTPG‑W treatment for 24 h, which changed notably in a dose-dependent manner, with the cells shrinking and becoming round following CTPG-W treatment (Fig. 2B). These results indicate that CTPG-W suppresses the growth of Eca-109 cells. The effect of CTPG-W on the proliferation of splenocytes was also detected with an MTT assay. CTPG-W significantly promoted the proliferation of splenocytes in a dose-dependent manner (Fig. 2C), indicating that it has no cytotoxic effect on splenocytes. 

Obrázok 4. Účinok CTPG-W na distribúciu bunkového cyklu v Eca-109 bunkách. Na ošetrenie buniek Eca-109 počas 24 hodín sa použili rôzne koncentrácie CTPG-W a distribúcia bunkového cyklu sa analyzovala prietokovou cytometriou. * P<0.05 and **P<0.01, compared with the control. DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. Búrlivé.

CTPG-W indukuje apoptózu v bunkách Eca-109. Aby sa zistilo, či CTPG-W potláča rast buniek Eca-109 prostredníctvom indukcie apoptózy alebo nekrózy, bunky sa ošetrili rôznymi koncentráciami CTPG-W. Po 24 hodinách sa apoptóza a nekróza Eca{5}} buniek detegovala farbením Annexin V/PI. Ako je znázornené na obr. 3A, bunky annexinu V-/PI+ boli uzavreté ako nekrotické bunky a bunky Annexin V+/PI+ a Annexin V+/PI- boli uzavreté ako apoptotické bunky. CTPG-W primárne indukoval apoptózu Eca{14}} buniek spôsobom závislým od dávky, hoci nekrotické Eca{16}} bunky sa tiež významne zvýšili pri liečbe 600 a 800 ug/ml CTPG-W (P<0.001 at 600 µg/ml and P<0.05 at 800 µg/ml). Consistently, the levels of pro-apoptotic Bax and anti-apoptotic Bcl-2 in Eca-109 cells were upregulated and downregulated, respectively, upon CTPG-W treatment (Fig. 3B). The results indicated that CTPG-W primarily inhibited the growth of Eca-109 cells through the induction of apoptosis.

CTPG‑W indukuje zastavenie bunkového cyklu vo fáze S v bunkách Eca‑10}9. Narušenie cyklu rakovinových buniek potlačí rast buniek a podporí apoptózu (27). Distribúcia bunkového cyklu v Eca-109 bunkách sa detegovala farbením PI po ošetrení CTPG-W počas 24 hodín. Pozorovalo sa, že bunky vo fáze S sa zvýšili a bunky vo fázach G0/G1 indikovali celkový významný pokles po liečbe CTPG-W (P<0.05;Fig. 4), indicating that CTPG-W arrests the Eca-109 cell cycle at the S phase.

CTPG‑W znižuje Δψm a indukuje uvoľňovanie cytochrómu c. Apoptóza môže byť indukovaná mitochondriálne závislou cestou (28, 29). Pro- a antiapoptotické členy rodiny proteínov BCL-2 zohrávajú dôležitú úlohu pri regulácii integrity mitochondriálnej membrány (30, 31). Po ošetrení CTPG-W počas 24 hodín sa Δψm vyhodnotil pomocou farbenia JC-1. Agregát JC‑1 (červená fluorescencia zistená v FL‑2) sa rozpadne na monomér (zelená fluorescencia zistená v FL-1), keď sa Δψm zníži (32). Ako je znázornené na obr. 5A, frekvencie buniek FL-1+FL-2-/+ sa významne zvýšili v závislosti od dávky, čo naznačuje, že Δψm buniek Eca-109 sa znížil. Fluorescenčné zmeny v bunkách Eca-109 boli tiež pozorované pomocou inverzného fluorescenčného mikroskopu (obr. 5B). So zvyšujúcimi sa koncentráciami CTPG-W sa červená fluorescencia znížila a zelená fluorescencia sa zvýšila, čo je v súlade s údajmi z prietokovej cytometrie. Tiež sa pozorovalo, že hladina cytochrómu c v cytosóle sa výrazne zvýšila (obr. 5C), čo je výsledkom zníženia Δψm. To posilňuje záver vyvodený zo zvýšeného počtu FL-1+ FL-2-/+ buniek, že Δψm sa znížil v dôsledku liečby CTPG-W. Uvádza sa, že JNK môže regulovať aktiváciu rodiny proteínov BCL-2 spôsobujúcich uvoľňovanie cytochrómu c (33-35). Tiež sa zistilo, že hladina JNK bola výrazne zvýšená po liečbe CTPG-W (obr. 5C). Výsledky ukázali, že CTPG-W môže indukovať apoptózu buniek Eca{32}} prostredníctvom mitochondriálne závislej dráhy.

Obrázok 5. Zníženie Δψm a upregulácia cytochrómu c a JNK. Bunky Eca-109 boli ošetrené rôznymi koncentráciami CTPG-W počas 24 hodín. (A) Δψm sa detegoval farbením JC-1 a vzorky sa analyzovali prietokovou cytometriou. Jednotlivé bodové grafy zobrazujú zmeny vo fluorescencii JC-1. Frekvencie buniek FL-1+ FL-2-/+ sú znázornené na spodnom paneli. ***P<0.001, compared with the control. (B) The changes in JC‑1 fluorescence were observed with an inverted fluorescence microscope. (C) The levels of cytochrome c and JNK were detected with western blot analysis. The different bands of JNK represent 54 and 46 kDa proteins. DMSO, dimethyl sulfoxide; CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa; JNK, c-Jun NH2-terminal kinase.

Obrázok 6. Hladiny ROS v Eca-109 bunkách po ošetrení CTPG-W a antioxidačná aktivita CTPG-W. (A) Bunky Eca{4}} boli ošetrené rôznymi koncentráciami CTPG-W a hladiny ROS boli analyzované prietokovou cytometriou v uvedených časových bodoch. * P<0.05, **P<0.01 and ***P<0.001, compared with the control. (B) The free radical scavenging activity of CTPG-W was determined with a 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl assay. CTPG-W, water-soluble phenylethanoid glycosides of C. tubulosa; ROS, reactive oxygen species; MFI, mean fluorescence intensity.

Účinok CTPG-W na intracelulárnu tvorbu ROS.ROS by mohol znížiť Δψm na vyvolanie apoptózy (36). Aby sa zistilo, či CTPG-W môže zvýšiť produkciu ROS, bunky Eca-109 boli ošetrené rôznymi koncentráciami CTPG-W. Bunky boli zozbierané v uvedených časových bodoch a zafarbené DCFH-DA. Produkcia intracelulárnych ROS v bunkách Eca{5}} bola stanovená prietokovou cytometriou. Ako je znázornené na obr. 6A, 800 ug/ml CTPG-W významne zvýšilo produkciu ROS od 2-6 h a znížilo od 12-24 h. Okrem toho 400 µg/ml CTPG‑W významne zvýšilo produkciu ROS od 12-24 h. Okrem toho 200 ug/ml CTPG-W výrazne nezmenilo produkciu ROS. Dynamické zmeny v produkcii ROS môžu súvisieť s apoptózou buniek Eca{15}}. Tiež sa zistilo, že CTPG-W má aktivitu zachytávania voľných radikálov (obr. 6B), čo môže súvisieť so zníženou produkciou ROS v Eca-109 bunkách ošetrených 800 ug/ml CTPG-W po 12 hodinách.

Obrázok 7. Hladiny štiepených kaspáz a štiepených PARP po liečbe CTPG-W. Proteíny sa izolovali z buniek Eca{4}} ošetrených CTPG-W počas 24 hodín a hladiny štiepených kaspáz a štiepených PARP sa detegovali pomocou analýzy Western blot. DMSO, dimetylsulfoxid; CTPG-W, vo vode rozpustné fenyletanoidové glykozidy zC. Búrlivé; PARP, poly (ADP-ribóza) polymeráza.

CTPG-W upreguluje aktivitu kaspázy-3, kaspázy-7, kaspázy-9 a PARP. Uvoľnenie cytochrómu c v dôsledku redukcie Δψm by mohlo aktivovať kaspázové proteázy na vyvolanie apoptózy (29, 30, 37). Po ošetrení CTPG-W počas 24 hodín bola aktivácia kaspázy-3, 7, 8, 9 a PARP detegovaná analýzou Western blot. V porovnaní s kontrolnou skupinou sú hladiny štiepenej kaspázy-9, štiepenej kaspázy-7, štiepenej kaspázy-3 a štiepenej-PARP, ale nie úrovne štiepenej kaspázy{{20 }}, boli upregulované liečbou CTPG spôsobom závislým od dávky (obr. 7). Tieto výsledky ukázali, že CTPG-W redukoval Δψm a podporoval uvoľňovanie cytochrómu c na aktiváciu kaspáz, ktoré indukujú apoptózu Eca{24}} buniek.

Diskusia

Tradičná CHM by mohla vyvolať apoptózu rakovinových buniek pažeráka prostredníctvom rôznych dráh, vrátane vonkajšieho receptora smrti a vnútorných mitochondriálnych a endoplazmatických retikulových stresových dráh (29). Naša predchádzajúca štúdia preukázala, že CTPG, ako hlavná zložka C. tubulosa, inhibuje rast buniek melanómu B16-F10 prostredníctvom indukcie apoptózy prostredníctvom mitochondriálne závislej dráhy (24). V tejto štúdii sa skúmal protinádorový účinok CTPG-W na bunky Eca{6}} a zistilo sa, že CTPG-W potláčal rast buniek Eca{8}}, indukoval apoptózu a zastavenie bunkového cyklu, znížil Δψm, zvýšil uvoľňovanie cytochrómu c a aktivovaných kaspáz. CTPG a CTPG-W by mohli indukovať apoptózu a zastavenie bunkového cyklu v rakovinových bunkách. Presné mechanizmy sa však líšia v dôsledku rôznych zložiek CTPG (26,64 % echinakozidu, 10,19 % akteozidu a 1,71 % izoakteozidu) a CTPG-W (39,16 % echinakozidu a 2,44 % akteozidu). CTPG zastavil B16-F10 bunky vo fázach G0/G1, ale CTPG-W zastavil Eca{26}} bunky vo fáze S (24). Produkcia ROS bola zvýšená v závislosti od dávky CTPG, ale indikovala zmenu v závislosti od času vysokou dávkou CTPG-W, ktorá sa výrazne zvýšila na začiatku liečby CTPG-W (2-6 h) a významne klesli po 12 hodinách v porovnaní s kontrolou. Možným dôvodom je, že hlavnou zložkou CTPG-W je echinakozid. Niekoľko štúdií uvádza, že echinakozid by mohol inhibovať produkciu ROS a apoptózu indukovanú ROS, aby uplatnil svoje neuroprotektívne účinky a účinky proti starnutiu (38-40). Podobne bola v tejto štúdii pozorovaná aktivita zachytávania voľných radikálov. Preto sa špekulovalo, že niektoré zložky, vrátane verbascozidu, izo-verbaskozidu a salidrozidu vo vysokej dávke CTPG-W, môžu okamžite vyvolať tvorbu ROS, ktorá spôsobí apoptózu Eca{39}} buniek (41,42) a potom ROS bol vyčistený echinakozid. Ďalším možným dôvodom rozdielov v produkcii ROS pomocou CTPG a CTPG-W je, že v tejto štúdii a predchádzajúcej štúdii boli použité rôzne bunkové línie (24). Dong a kol. (43) uviedli, že echinakozid by mohol indukovať apoptózu ľudských buniek kolorektálneho karcinómu SW480 prostredníctvom generovania oxidačného poškodenia DNA bez zvýšených hladín ROS.

Liečba CTPG-W znížila Δψm a spôsobila uvoľnenie cytochrómu c, ktorý podporuje štiepenie kaspázy-9 (28). Hladiny štiepenej kaspázy-9 boli dôsledne regulované liečbou CTPG-W. Následne môže aktívna kaspáza-9 aktivovať kaspázu-3 na vyvolanie apoptózy (44). Hladiny štiepenej kaspázy{10}} boli tiež regulované CTPG-W. Kaspáza-8 však nebola aktivovaná CTPG-W, čo naznačuje, že vonkajšia dráha receptora smrti nebola zapojená do apoptózy indukovanej CTPG-W. Tieto pozorovania naznačujú, že CTPG-W indukuje apoptózu buniek Eca{16}} prostredníctvom aktivácie mitochondriálne závislej dráhy.

PARP zohráva dôležitú úlohu pri stabilite genómu a môže byť štiepená aktívnymi kaspázami, najmä kaspázou{0}} a -7 (45). Zistilo sa, že liečba CTPG-W aktivovala kaspázu-3 a -7, ktoré môžu štiepiť PARP, aby sa inhibovala oprava DNA a spôsobila apoptóza.

CTPG-W tiež v závislosti od dávky a času potláča rast buniek ľudského hepatocelulárneho karcinómu BEL-7404 (nepublikované údaje). Hoci CTPG-W inhibuje rast buniek Eca{5}} a BEL{6}}, podporuje proliferáciu splenocytov, čo môže byť spôsobené obsahom polysacharidov (~50 %) v CTPG-W (46 ). Podobne niekoľko štúdií uvádza, že polysacharidy môžu podporovať proliferáciu splenocytov (46-49). Na myšacom modeli sa zistilo, že CTPG‑W významne zvýšil index sleziny v porovnaní s kontrolnou skupinou, ale neovplyvnil telesnú hmotnosť a iné indexy orgánov vrátane srdca, pečene, obličiek a pľúc (nepublikované údaje), čo naznačuje, že CTPG-W nemá žiadny cytotoxický účinok na normálne bunky.

Súhrnne údaje naznačujú, že CTPG-W inhibuje rast buniek Eca{1}} indukciou apoptózy prostredníctvom mitochondriálne závislej dráhy

PRÍRODNÁ CISTANCHE TUBULOSA NA ZLEPŠENIE SEXUÁLNEJ FUNKCIE PHGS75% ECH 30% ACT 12%