Fotosenzitívne proliečivové nanozostavy nesúce funkciu chemoterapeutickej dormancie potencuje imunoterapiu rakoviny

Abstraktné

Imunoterapia kombinovaná s účinnými terapeutikami, ako je chemoterapia a fotodynamická terapia, je úspešnou stratégiou na aktiváciu protinádorových imunitných odpovedí na zlepšenie protirakovinovej liečby. Vývoj multifunkčných biodegradovateľných, biokompatibilných, málo toxických, ale vysoko účinných a klinicky dostupných transformovaných nanoimunostimulantov však zostáva výzvou a je po ňom veľký dopyt. V tomto dokumente uvádzame a navrhujeme nový beznosičový fotochemoterapeutický nano-proliečivo COS-BA/Ce6 NP kombináciou troch multifunkčných komponentov samostatne zostavenej prírodnej kyseliny betulínovej s malou molekulou (BA), vo vode rozpustného chitosanového oligosacharidu (COS), a nízkotoxický fotosenzibilizátor chlór e6 (Ce6) na zvýšenie protinádorovej účinnosti imunitnej adjuvantnej anti-PD-L1-sprostredkovanej imunoterapie rakoviny. Ukázali sme, že navrhnuté nanoliečivá mali inteligentnú a výraznú „dormantnú“ charakteristiku v chemoterapeutickom účinku s požadovanou nižšou cytotoxicitou a viacerými priaznivými terapeutickými vlastnosťami vrátane zlepšenej tvorby 1 O2 vyvolanej zníženou energetickou medzerou Ce6, citlivosťou na pH, dobrou biologickou odbúrateľnosťou a biokompatibilita zaisťujúca vysoko účinnú, synergickú fotochemoterapiu. Navyše, v kombinácii s anti-PD-L1 terapiou by chemoterapia založená na nano-koassembly a chemoterapia/fotodynamická terapia (PDT) mohli účinne aktivovať protinádorovú imunitu pri liečbe primárnych alebo vzdialených nádorov, čím by sa otvorili potenciálne atraktívne možnosti pre klinickú imunoterapiu.

Výhody cistanche tubulosa-Protinádorové

KĽÚČOVÉ SLOVÁ

Imunoterapia rakoviny; Nano-imunostimulanty; Chemoterapeutická dormancia; proliečivo; Vlastná montáž; Prírodná malá molekula; kyselina betulínová; Fotodynamická terapia

1. Úvod

Imunoterapia rakoviny, ako je stratégia blokády imunitného kontrolného bodu pomocou PD-L1 alebo CTLA-4 na boj proti rakovine aktiváciou imunitného systému hostiteľa, nepochybne spôsobila revolúciu v liečbe rakoviny1,2. Žiaľ, slabá imunitná odpoveď a neúčinné terapeutické účinky značne obmedzili jej klinické vyhliadky3,4. Súčasné štúdie nedávno odhalili, že kombinácia imunoterapie s inými modalitami, ako je chemoterapia5, fotodynamická terapia (PDT)6, fototermálna terapia (PTT)7 a rádioterapia8, môže účinne spustiť protinádorovú imunogenicitu tým, že rakovinové bunky podstúpia imunogénnu bunkovú smrť ( ICD)9, čo naznačuje potenciál imunitnej modulácie aktivovať protinádorové imunitné reakcie. Množstvo inovatívnych návrhov nanomateriálov založených na týchto synergických kombináciách imunoterapeutických stratégií dosiahlo výrazne zlepšenú protirakovinovú aktivitu vrátane anorganických10, polymérnych11 a biomimetických12 nanočastíc (NP). Avšak vývoj multifunkčných biodegradovateľných, biokompatibilných, nízko toxických, ale vysoko účinných a klinicky dostupných transformovaných nanoimunostimulantov zostáva veľkou výzvou a obrovským dopytom. Prírodné biologické materiály, ako sú nukleové kyseliny13, proteíny12, peptidy14,15 a malé molekulárne prírodné produkty16,17 kvôli svojim prirodzeným výhodám (napr. biokompatibilita, netoxicita) vyvolali významný výskumný záujem pre medicínske aplikácie. Najmä v posledných rokoch boli postupne objavené protirakovinové bioaktívne terpenoidné prírodné malé molekuly (NSM), ktoré majú funkciu samousporiadania18,19. Napríklad kyselina betulínová (BA), ergosterol (ET) a kyselina abietová (AA) sa môžu samovoľne zostaviť do mikrónových alebo nanoštruktúrovaných častíc. Tieto NSM sú atraktívnymi stavebnými kameňmi na použitie na vývoj protinádorových činidiel pre synergickú chemoterapiu a PDT. Ukázalo sa, že vykazujú významné výhody ľahkej nano-výroby, lepšej biokompatibility a biologickej odbúrateľnosti, nižšej toxicity so zníženým poškodením pečene a vysokého synergizmu v protinádorovej terapii20e23. To poskytuje sľubné alternatívy pre vývoj klinicky dostupných preložiteľných nano-imunostimulantov pre synergickú imunoterapiu. Všeobecne silnejšia lipofilita týchto NSM však viedla k neefektívnej bunkovej endocytóze, ktorá oslabila ich protirakovinovú aktivitu a obmedzila ich klinickú hodnotu pri liečbe rakoviny24. Podobne ako bežne uvádzané nanokompozity, zodpovedajúce nanoformulácie NSM podporovali bunkovú absorpciu na zvýšenie chemoterapeutických účinkov, ale tiež neúmyselne zvýšili riziko nešpecifickej cytotoxicity pre normálne bunky22. Preto, ako maximalizovať protirakovinovú účinnosť terpenoidných NSM nano-agensov a zároveň minimalizovať ich toxicitu pre normálne tkanivo, stojí za to hlboko premýšľať ako o zásadnej otázke v procese synergickej imunoterapie.

cistanche výhody pre mužov - posilnenie imunitného systému

Prekurzorové stratégie sa vo veľkej miere aplikovali na zlepšenie bunkového vychytávania lipofilných malých molekúl zvýšením hydrofilnosti25. Vo všeobecnosti majú amfifilné lieky vyššiu účinnosť bunkovej absorpcie ako hydrofilné alebo lipofilné lieky26. Čím vyššia je bunková fagocytóza, tým lepšia je terapeutická účinnosť24. Vývoj amfifilných terpenoidných NSM proliečivových molekúl teda môže byť potenciálnou metódou na maximalizáciu ich terapeutických účinkov. Okrem toho nanoliečivá reagujúce na stimuly na špecifické mikroprostredie nádoru (napr. kyslá, redoxná citlivosť) sú veľkým prísľubom kontroly uvoľňovania liečiva, čo je výhodné pri potláčaní cytotoxicity chemoterapeutických liečiv27,28. Medzitým bola supramolekulárna koassembácia (napr. reprecipitačný prístup) účinnou stratégiou na prípravu vysoko vo vode rozpustných beznosičových nanoliečiv22,29, od ktorých by sa dalo očakávať, že do určitej miery mierne znížia účinnosť fagocytózy amfifilných NSM, čím sa oslabí ich pre- navrhnutá cytotoxicita. Predpokladáme, že na stimuly reagujúce a plne hydrofilné nanoliečivá boli ďalej založené na prekurzoroch amfifilných NSM a môžu účinne potlačiť jeho nešpecifickú cytotoxicitu voči normálnym bunkám a zároveň stimulovať uvoľňovanie vysoko toxických amfifilných NSM do nádorových buniek, čím sa uľahčuje ich dormancia v normálnych tkanivách a aktivácia v mieste nádoru. Je dôležité vybrať vhodný vo vode rozpustný a na stimuly reagujúci prekurzor na modifikáciu terpenoidných NSM na prípravu amfifilných proliečivových molekúl. Po celé roky majú chitosanové oligosacharidy (COS), ako degradované produkty chitosanu, nielen dobrú rozpustnosť vo vode a veľké množstvo eOH alebo NH2 skupín, ktoré vedú k dobrej pH reakcii, ale majú aj prospešné protinádorové aktivity tým, že posilňujú imunitnú funkciu hostiteľa reguláciou aktivity. imunitných buniek, ako sú monocytové makrofágy a lymfocyty30,31. Tie zaručujú obrovskú možnosť konštrukcie cieľových nanoimunostimulantov reagujúcich na stimuly pre synergickú imunoterapiu.

Na základe vyššie uvedených úvah sa v našom experimentálnom dizajne používa pentacyklický triterpén NSM kyseliny betulínovej (BA) ako silné protirakovinové činidlo32, COS bol zavedený na syntézu amfifilnej molekuly COS-BA na zlepšenie chemoterapeutického účinku. Chlór e6 (Ce6), široko používaný fotosenzibilizátor s veľmi nízkou/žiadnou toxicitou v tme33, sa použil na konštrukciu úplne vo vode rozpustného fotosenzitívneho proliečiva COS-BA/Ce6 NPs bez nosiča pomocou priamej stratégie spoločného zostavovania. COS-BA/Ce6 NP kombinovali dve terapeutické modality, chemoterapiu a fotodynamickú terapiu (PDT), ktoré môžu účinne zvýšiť prezentáciu antigénov odvodených od nádoru T bunkám, čím sa vytvárajú silné imunologické reakcie s pomocou imunitného adjuvans anti-PD-L1 spôsobiť vysoko účinnú a synergickú protinádorovú chemoterapiu/PDT/imunoterapiu (schéma 1). Skonštruované COS-BA/Ce6 NP vykazovali inteligentnú dormančnú funkciu so zákernými chemoterapeutickými účinkami, tj neožiarené spoločne zostavené NP vykazovali pozoruhodne inhibovanú in vitro cytotoxicitu v porovnaní s amfifilnými COS-BA, či už proti rakovinovým alebo normálnym bunkám. Pripisujúc sa výraznému správaniu reagujúceho na pH, vykazuje nízku toxicitu a biologickú bezpečnosť pre normálne tkanivo in vivo, ale je vysoko toxický pre nádorové tkanivo v dôsledku stimulujúceho uvoľňovania hyperaktívneho COS-BA v slabo kyslom nádorovom mikroprostredí34. Pokiaľ je nám známe, v súčasnosti sú navrhnuté nano liečivá nesúce túto funkciu chemoterapeutického pokoja stále zriedkavo uvádzané. Medzitým má nanoliečivo viacero priaznivých terapeutických vlastností, ako je zlepšená tvorba 1 O2 znížením energetickej medzery (DEST) Ce6, rýchly biologický metabolizmus a zvýšená akumulácia nádoru, čo viedlo k účinnej a bezpečnej protinádorovej kombinácii chemoterapie a liečby PDT. Ešte dôležitejšie je, že chemoterapia založená na NP aj chemoterapia / PDT systémy by mohli účinne aktivovať protinádorovú imunitu uľahčením proliferácie CD8+ T buniek produkujúcich TNF-a a IFN-g v primárnych alebo vzdialených nádoroch. Nami navrhovaný biodegradovateľný, biokompatibilný, jedinečne spiaci, biologicky bezpečný a vysoko účinný fotochemoterapeutický nano-liečivo dosahuje významné systémové imunitné terapeutické reakcie, čím otvára atraktívne možnosti pre klinickú aplikáciu pri liečbe vzdialenej alebo metastatickej liečby rakoviny.

Schéma 1 PDT a chemoterapia spoločne zostavených NP COS-BA/Ce6 potencovali anti-PD-L1 na vyvolanie systémovej protinádorovej imunoterapie. Zavedenie vo vode rozpustného COS môže účinne zvýšiť chemoterapeutickú aktivitu BA (zobrazený ako polovičný meč), čo vedie k hyperaktívnemu COS-BA amfifilnému prekurzoru (dlhý meč). Pri spoločnom zostavení s fotosenzibilizátorom Ce6 (pochva) mali nanozostavy so štruktúrou škrupiny a citlivé na pH inteligentnú a výraznú funkciu „dormancie“ s inhibovanou chemoterapeutickou toxicitou pre normálne tkanivá. Keď však príde a bude stimulovaný kyslým (Hþ) nádorovým mikroprostredím, uvoľní sa vysoko aktívne amfifilné proliečivo COS-BA, čo vedie k významnej chemoterapii. Okrem toho skonštruované kozostavy vykazovali vynikajúcu aktivitu PDT so zvýšenou tvorbou singletového kyslíka (102) vyvolanou zníženou energetickou medzerou medzi singletovými a tripletovými excitovanými stavmi (DEST) Ce6. V kombinácii s blokádou kontrolného bodu anti-PD-L1 môže uvoľnenie antigénov spojených s nádorom po liečbe chemoterapiou/PDT účinne aktivovať systémovú protinádorovú imunitnú odpoveď na vzdialenú imunoterapiu rakoviny.

2. Materiály a metódy

2.1. Syntéza COS-BA

Kyselina betulínová (40 mg, 0,1 mmol), EDC (38 mg, 0,2 mmol) a NHS (17 mg, 0,15 mmol) ) sa rozpustili v 3 ml N,N-dimetylformamidu (DMF). Po miešaní pri teplote miestnosti počas 30 minút sa do zmesi jemne po kvapkách pridalo 96 mg COS vodného roztoku (1 ml) a zmes sa miešala počas 24 hodín. Potom sa reakčná zmes zriedila CH2CI2 a opakovane extrahovala. CH2CI2 vrstva sa odparila a čistila na silikagélovej kolóne. Nezreagovaný BA sa najskôr odstránil použitím petroléteru a acetónu (5:1, obj./obj.) ako eluenta a potom sa zmenil na 3:1, čím sa získal biely COS-BA (výťažok: 42 %), kde bol COS identifikovaný ako dimér ( n Z 2). 1H NMR (40{{70}} MHz, CDCI3) d: 8,98 (1H, s, BA-280] CeNH), 4,73 (1H, s, H -29a), 4,60 (1H, s, H-29b), 3,18 (1H, dd, JZ 4,8, 10,8 Hz, H-3), 2,95 e3,93 (8H, m, COS), 2,64 (3H, s, CH3eCOS), 0,76 (3H, s, H-24), 0,83 (3H, s, H-25), 0,90 (3H, s, H{ {69}}), 0,97 (3H, s, H-26), 0,98 (3H, s, H-27), 1,70 (3H, s, H-30). 13C NMR (100 MHz, CDC13) d: 179,18 (CO, COS), 156,43 (C- 28), 150,97 (C-20), 109,03 (C-29), 78,74, 77,04 69,32; 69,22; 65,25; 58,14; 55,62; 55,21; 53,65; 53,22; 50,52; 45,96; 44,32; 04, 36,39, 35,31, 34,21, 31,81, 31,54, 31,17, 30,28 , 29,09, 27,80, 27,22, 25,74, 25,53, 20,91, 19,48, 18,12, 16,02, 15,87, 15,17, 14,65, 14,62. ESieMS m/z: 814,5871 [M-6H] (C44H72N2012).

2.2. Príprava COS-BA/Ce6 NP

Spoločne zostavené COS-BA/Ce6 NP boli pripravené jednostupňovou metódou reprecipitácie. Typicky sa najprv zmiešalo 5 ml Ce6 (33 mmol/l) a 40 ml COS-BA (33 mmol/l) DMSO roztokov. Následne sa zmes rýchlo vstrekla do 1 ml vody obsahujúcej 10 ml NaOH (50 mmol/l) pod ultrazvukom (KQ-250E, ShuMei, Kunshan, Čína). Po sonikácii počas 10 minút sa COS-BA/Ce6 NP získali centrifugáciou pri 13,000 ot./min (TGL-16G, Xiangyi, Changsha, Čína) počas 25 minút. Ďalšie formulácie s rôznymi pomermi COS-BA k Ce6 sa pripravili rovnakým postupom s konštantným molárnym pomerom NaOH k Ce6 3:1.

2.3. Bunkové línie

Ľudské bunkové línie MCF-7, HepG2, LO2 a myšie 4T1, L929 poskytuje Ústav biochémie a bunkovej biológie, SIBS, CAS (Čína). MCF-7, HepG2 a LO2 sa kultivovali v médiu DMEM s 10 % fetálnym hovädzím sérom (FBS, Gibco) a 1 % antibiotikom penicilín-streptomycín (Life Technology, USA) pri 37 °C. 4T1 a L929 sa kultivovali v médium RMPI{16}} s rovnakým pomerom ako vyššie.

2.4. Štúdie bunkového vychytávania a endocytických dráh

Na skúmanie bunkovej absorpcie boli bunky 4T1 alebo LO2 inkubované s voľnými Ce6 alebo COS-BA/Ce6 NP (ekvivalentná koncentrácia Ce6: 1,7 mg/ml, COS-BA: 19,5 mg/ml, BA: 10 0,8 mg/ml) pre rôzne časy. Po premytí, fixácii a farbení DIPA (#D9542, Sigma) sa bunky zobrazili pod fluorescenčným invertovaným mikroskopom (FIM) (DSY-2000X, UP Optotech, Changchun, Čína). Intenzita fluorescencie bola stanovená pomocou prietokovej cytometrie s použitím minisystému Guava EasyCyte (Merck Millipore, Nemecko). Na kvantifikáciu účinnosti vychytávania sa merala bunková akumulácia BA a COS-BA pomocou HPLC (Agilent 1200, USA). Typicky boli bunky 4T1 ošetrené voľným COS-BA alebo BA (ekvivalent BA: 25 mg/ml) počas 0,5 a 3 hodín. Po premytí PBS boli bunkové pelety zozbierané a podrobené ultrazvukovej homogenizácii (JY92-IIN, Scientz Biotechnology, Ningbo, Čína) na lýzu buniek. Potom sa COS-BA alebo BA extrahovali chloroformom na HPLC analýzu po lyofilizácii vzoriek. Mobilnou fázou bola voda (0,2 % kyselina fosforečná) a acetonitril pri prietokovej rýchlosti 1,0 ml/min a zodpovedajúce objemové pomery boli 60:40 a 15:85 (obj./obj.) pre analýzu COS-BA a BA. . Detekčná vlnová dĺžka bola 213 nm. Na skúmanie endocytických dráh COS-BA/Ce6 NP sa bunky 4T1 naočkovali na 6-jamkové platne a inkubovali sa 24 hodín predtým, ako sa 30 minút vopred ošetrili rôznymi inhibítormi endocytózy, vrátane inhibítora mikropinocytózy [50 mmol/l , etylizopropylamilorid (EIPA) (#N132356, Aladdin)], inhibítor endocytózy sprostredkovaný klatrínom [20 mmol/l, chlórpromazín (#C7010, Solarbio)], inhibítor endocytózy sprostredkovaný kaverolami [25 mmol/l, nystatín ( #IN0260, Solarbio)] a inhibítor acidifikácie lyzozómov [50 mmol/l, chlorochín fosfát (#C9720, Solarbio)]35. Ďalej sa bunky ďalej kultivovali s 2 ml COS-BA/Ce6 NP (Ce6: 1,7 mg/ml, COS-BA: 19,5 mg/ml) počas 2 hodín a zobrazili sa pod FIM (UP Optotech). Bunky inkubované bez endocytického inhibítora pri 37 °C boli nastavené ako kontrola a pri nízkej teplote (4 °C) na vyhodnotenie energeticky závislej endocytózy. Medzitým sa prietokovou cytometriou stanovila aj priemerná intenzita fluorescencie buniek.

cistanche tubulosa - zlepšenie imunitného systému

Kliknite sem pre zobrazenie produktov Cistanche Enhance Immunity

【Požiadať o viac】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.5. Test cytotoxicity

4T1 bunky boli nasadené na 96-jamkovú doštičku. Potom boli bunky ošetrené rôznymi koncentráciami COS-BA NP počas 24 hodín. Potom sa do jamky pridalo 10 ml farbiva MTT (#M158055, Aladdin) (5 mg/ml) a inkubovalo sa ďalšie 4 hodiny a potom sa pridalo 150 ml DMSO na rozpustenie kryštálov formazanu. . Absorbancia každej jamky pri 492 nm bola zaznamenaná čítačkou mikrodoštičiek. V skupine s ožiarením boli bunky ošetrené liekmi počas 4 hodín, potom boli ožiarené počas 10 minút svetlom 675  10 nm a inkubované ďalších 20 hodín. Cytotoxicita COS-BA/Ce6 NP (1 mg/ml Ce6 zodpovedá 11,5 mg/ml COS-BA a 6,4 mg/ml BA) voči iným bunkám (MCF-7, HepG2, LO2 a L929) boli tiež stanovené rovnakým MTT testom len s iným médiom. Medzitým sa kombinačný index vypočítal pomocou softvéru CompuSyn 2.0 pomocou výpočtu teorému Chou Talalay36.

2.6. Zvieracie modely

Všetky experimentálne postupy sa uskutočňovali podľa protokolov schválených Výborom pre starostlivosť a používanie zvierat Harbin Medical University. Bunky 4T1 boli suspendované v RMPI-1640 médiu a subkutánne injikované do pravej zadnej časti každej samičky BALB/c myši (18e22 g, 6e7 týždňov staré).

2.7. In/ex vivo fluorescenčné zobrazovanie

20}0 ml COS-BA/Ce6 NPs 5% roztoku glukózy (ekvivalent Ce6: 0,35 mg/ml, COS-BA: 4,02 mg/ml) sa injikovalo cez chvostovú žilu myšiam s nádorom. Potom sa uskutočnilo fluorescenčné zobrazenie nádorových miest vo vopred určenom čase s použitím multimodelového in vivo zvieracieho zobrazovacieho systému AniView 100/600 (Guangzhou Biolight Biotechnology Co., Ltd., Čína) s excitáciou pri 630 nm. Po 24 hodinách po injekcii sa hlavné orgány (srdce, pečeň, slezina, pľúca a obličky) a nádor odobrali na ex vivo fluorescenčné zobrazovanie. Okrem toho sa hodnotili aj fluorescenčné obrazy ex vivo nádorov a hlavných orgánov v rôznych časoch po iv injekciách Ce6 alebo COS-BA/Ce6 NP.

2.8. In vivo chemoterapia/PDT

4T1-nosné myši (75e100 mm3) sú náhodne rozdelené do šiestich skupín (n Z 5): 1) 5 % roztok glukózy; 2) Ce6; 3) Ce6 s ožiarením; 4) COS-BA (40,2 mg/kg, kde BA: 22,3 mg/kg); 5) COS-BA/Ce6 NP; 6) COS-BA/Ce6 NP s ožiarením. Pre každú skupinu sa myšiam injekčne podá 200 ml COS-BA/Ce6 NP (ekvivalent Ce6: 3,5 mg/kg tela) cez chvostovú žilu v dňoch 0, 2 a 4. Pre skupiny s ožarovaním po 4 hodinách po injekcii po každom podaní boli všetky myši anestetizované izofluránom a miesta nádoru boli ožiarené svetlom 675  10 nm (150 mW/cm2) počas 15 minút. Objemy nádorov a telesná hmotnosť myší sa zaznamenávajú aj každý druhý deň. Objemy nádorov sa vypočítajú podľa vzorca: šírka VZ2 dĺžka/2. Po 14 dňoch liečby sa nádory vyrezali a zvážili, aby sa vypočítal pomer inhibície nádoru (TIR) ​​podľa bežne používanej rovnice: TIRZ (1 vzorka/kontrola) 100 %. Vzorka a kontrola boli priemernou hmotnosťou nádoru každej liečenej skupiny a skupiny s 5 % vodným roztokom glukózy.

2.9. In vivo chemoterapia/PDT/imunoterapia

Aby sa demonštroval potenciál COS-BA/Ce6 NP v kombinácii s imunoterapiou, bol navrhnutý bilaterálny model nádoru prostredníctvom subkutánnej injekcie buniek 4T1 do ľavého a pravého boku. Keď sa nádory priblížili k 75e100 mm3, myši boli rozdelené do piatich skupín. (1) kontrola; (2) COS-BA/Ce6 NP (COS-BA Z 40,2 mg/kg, kde BAZ 22,3 mg/kg); (3) COS-BA/Ce6 NPs þ ľahké; (4) COS-BA/Ce6 NP - anti-PDL1; (5) COS-BA/Ce6 NP þ anti-PD-L1 þ svetlo. V deň 0 sa myšiam iv injikovalo 200 ml 5 % roztoku glukózy (skupina 1) alebo COS-BA/Ce6 NP (Ce6 Z 3,5 mg/kg) (skupina 2, 3, 4, 5). Po 4 hodinách po injekcii sa pravé nádory skupín 3 a 4 ožarovali 15 minút. Myši boli anestetizované izofluránom a prevrátené na jednu stranu, aby sa predišlo odhaleniu ľavých nádorov. Potom sa anti-PD-L1 protilátka (BioXcell, číslo produktu: BE0101, číslo klonu: 10F.9G2) iv injikovala myšiam pre skupiny 4 a 5 v dňoch 2, 4 a 6 (15 mg na myš na injekciu). Dĺžka a šírka každého nádoru sa monitorovala každý druhý deň. Po 14 dňoch liečby sa odobralo krvné sérum myší na vyhodnotenie interferónu-gama (IFN-g) (#KMC4021) a faktora nekrózy nádorov (TNF-a) (#BMS607-3) pomocou testu ELISA (eBioscience ). Nádory boli zozbierané, disociované, ošetrené pufrom na lýzu červených krviniek a premyté PBS centrifugáciou. Potom bola bunková suspenzia zafarbená anti-CD3-FITC (#MA1-10187, klon 145-2C11, eBioscience) a anti-CD8a-PE (#12-0081-85, klon 53-6.7, eBioscience). Potom sa prietokovou cytometriou vyhodnotila infiltrácia cytotoxických T lymfocytov (CTL) do pravého a ľavého nádoru po rôznych ošetreniach.

3. Výsledky a diskusia

3.1. Syntéza, výroba a charakterizácia COS-BA/Ce6 NP

V tejto štúdii navrhujeme nový prekurzor s malou molekulou COS-BA založený na vo vode rozpustnom chitosanovom oligosacharide (COS), ktorý môže zvýšiť chemoterapeutickú aktivitu kyseliny pentacyklickej triterpén betulínovej (BA) zlepšením absorpcie buniek zvýšením hydrofilnosti. Tu použitý COS (stupeň polymerizácie, DP: 2e6) bol pripravený našou vyššie opísanou metódou30. Potom sa COS-BA syntetizoval prostredníctvom dehydratačnej kondenzačnej reakcie. V kombinácii s analýzou hlavnej zložky COS sa chemická štruktúra COS-BA považovala za disacharidom (DP:2) modifikovaný BA (podporné informácie obr. S1), čo bolo potvrdené pomocou1H NMR, 13C NMR a ESIeMS (Podporné informácie Obr. S2eS4). Analýza reprezentatívnej1H NMR ukázala zreteľný protónový signál COS okolo 2,64 e 3,93 ppm a vrcholy C]CH2 (4,60, 4,73 ppm) BA, čo demonštruje úspešnú syntézu COS-BA (obr. 1A). Na prípravu spoločne zostaveného synergického protinádorového činidla COS-BA/Ce6 NP sa použil všestranný reprecipitačný prístup v spolupráci s vysoko účinným fotosenzibilizátorom Ce6. Zmenou počiatočných molárnych pomerov by obe formulácie COS-BA/Ce6 mohli tvoriť sférické nanoštruktúry s modulovanými veľkosťami (obr. 1B a podporné informácie obr. S5). Naprieč rôznymi vstupnými pomermi COS-BA/Ce6 boli hydrofilné priemery COS-BA/Ce6 NP blízko 200 e 300 nm s negatívnym z-potenciálom. Vzhľadom na to, že NP pripravené vo formulácii 8:1 vykazovali nižší index polydisperzity (PDI, 0,143) s relatívne menšou veľkosťou (249 nm), na kombinačnú liečbu bolo potrebné aj dostatočné množstvo chemoterapeutickej látky COS-BA. Preto sme pre nasledujúcu štúdiu zvolili formulácie COS-BA/Ce6 (8:1). Pri tejto optimalizácii vykazovali COS-BA/Ce6 NP úzku distribúciu veľkosti (obr. 1C) a dobrú rozpustnosť vo vode, čo naznačuje jeho koloidnú povahu (obr. 1D). Aby sa preskúmali dôvody tohto úspešného spoločného zostavovania, primárne správanie voľného COS-BA pri samozostavovaní sa skúmalo pomocou skenovacej elektrónovej mikroskopie (SEM) (obr. 1E), čo naznačuje, že COS-BA by mohol tvoriť vysoko jednotný nano- guľa w168 nm, čo znamená, že chemická modifikácia COS nemení schopnosť samoskladania samotného BA (podporné informácie obr. S6). Je to vlastnosť, ktorá nakoniec podnieti úspešnú konštrukciu spoločných zostáv. Je pozoruhodné, že okrem pevnej nanoštruktúry potvrdenej transmisnou elektrónovou mikroskopiou (TEM), COS-BA / Ce6 NP vykazovali zreteľnú štruktúru škrupiny bez COS-BA NP a priemerná hrúbka škrupiny bola približne 2, 35 nm. Ďalšia fyzikálno-chemická charakterizácia je zhrnutá na obr. 1F. Okrem toho COS-BA/Ce6 NP vykazovali negatívny z-potenciál 5,38 mV a hydrodynamickú veľkosť w249 nm, vyššiu ako tá, ktorá sa získala zo SEM (w182 nm). Súčasne bola účinnosť naplnenia Ce6 a účinnosti enkapsulácie 8,1 a 96 %, ako sa stanovilo pomocou vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (HPLC). Tiež údaje FT-IR (obr. 1G) ďalej potvrdili toto spoločné zostavenie, pretože NP COS-BA/Ce6 vykazovali charakteristické vrcholy C]N, CeN a C]CH Ce6 objavujúce sa pri 1633, 1078 a 633 cm1. , resp.

cistanche tubulosa - zlepšenie imunitného systému

3.2. Spoločne zostavený mechanizmus a vytvorenie štruktúry plášťa

Následne, aby sme lepšie pochopili mechanizmus spoločného zostavovania, sme najprv skúmali primárny proces tvorby NP. Zistili sme, že spoločné zostavenie COS-BA s Ce6 môže byť spontánne, pretože tieto dva druhy môžu tiež tvoriť sférickú nanoštruktúru, aj keď bez sonikácie (podporné informácie obr. S7), čo môže byť spôsobené negatívnou Gibbsovou zmenou voľnej energie (DG ) v spoluzostavách37. Toto spontánne zostavenie tiež naznačovalo silnejšiu intermolekulárnu interakciu medzi COS-BA a Ce6. Vo všeobecnosti sú medzimolekulárne interakcie v supramolekulárnych vlastných (alebo ko-)zostavách nekovalentné p‒p-stohovanie, vodíkové väzby a van der Waalsove sily 38,39. Pre túto analýzu sme potom skúmali UV absorpciu COS-BA/Ce6 NP (obr. 1H a F), čo naznačuje červené posunuté Soretove (410 nm) a Qy (667 nm) pásy v porovnaní s voľný Ce6 (405 a 665 nm, v tomto poradí). Medzitým možno nájsť aj výraznú červenú posunutú charakteristickú absorpciu COS-BA, čo naznačuje možné intermolekulárne pp stohovanie medzi COS-BA a Ce640. Navyše, po inkubácii s povrchovo aktívnou látkou dodecylsulfát sodný (SDS, 0,2 % hmotn./obj.) (podporné informácie obr. S8), COS-BA/Ce6 NP vykazovali novo modrý pás Qy pri 641 nm a dramaticky obnovenú fluorescenciu, čo dokazuje že k spoločnému zostaveniu prispeli aj hydrofóbne interakcie28. Pretože tieto asociatívne nekovalentné interakcie, kozostavy vykazovali pozoruhodné zhášanie fluorescencie (98,2 %) vo vode (obr. 11). Súhrnne je rozumné veriť, že p‒p stohovanie a hydrofóbne interakcie môžu byť hlavnými hnacími silami pre konštrukciu spoločných zostáv. Potom, aby sme intuitívnejšie vizualizovali proces montáže a odhalili základné dôvody, prečo sa môžu vytvoriť NP so štruktúrou škrupiny, vykonali sme zjednodušený simulačný model molekulárnej dynamiky (MD) obsahujúci 16 optimalizovaných molekúl COS-BA a ďalšie dve Ce6 vo vodnom boxe. . Najprv sme vyhodnotili možnú interakciu/naviazanie samozostáv COS-BA do 5 ns času simulácie (obr. 2A a podporné informácie obr. S9). Zistili sme, že okrem početných intramolekulárnych vodíkových väzieb vo frakcii COS bolo možné pozorovať aj niekoľko párov intermolekulárnych H-väzieb medzi COS-BA (obr. 2B a podporné informácie obr. S10), čo naznačuje, že vodíková väzba môže byť jedna hlavných hnacích síl pre vznik COS-BA NP. Zvlášť zaujímavé je, že v COS-BA samozostaveniach tvoria všetky COS-BA molekuly zjavne symetrickú štruktúru (obr. 2C). Tento fascinujúci fenomén nás motivoval preskúmať možný vzťah medzi touto vlastnosťou a tvorbou škrupinovo štruktúrovaných COSBA NP. Potom sme sa pokúsili rozšíriť jednotky krabice. Prekvapivo boli spojené boxy pozostávajúce z molekúl COS-BA usporiadané pravidelným spôsobom, čo viedlo k "ortogonálnym" dutým sieťovým štruktúram (podporné informácie obr. S11). Ešte dôležitejšie je, že sme náhodne vypočítali hrúbku molekúl obalu a zistili sme, že sú v súlade s TEM (w2,35 nm) (obr. 2D). Táto tendencia vytvárať duté sieťové štruktúry môže byť zodpovedná za tvorbu NP so štruktúrou plášťa. Na otestovanie tejto myšlienky bola simulovaná MD štruktúra kozostav COS-BA/Ce6 (obr. 2E a podporné informácie obr. S12). Podobne ako pri samozostavách COS-BA sa v kozostavách našiel aj veľký počet intramolekulárnych a intermolekulárnych H-väzieb (obr. 2F a podporné informácie obr. S13). Okrem toho, možné pp stohovanie medzi C] C COS-BA a aromatickým kruhom Ce6 bolo pozorované v spoločných zostavách (obr. 2G), čo je v súlade s údajmi z predchádzajúcich UV skúmaní. Po rozšírení počtu políčok možno stále nájsť podobné štruktúry dutej siete, len so zníženou pravidelnosťou a ortogonalitou (podporné informácie Obr. S14). To môže byť možný dôvod pre nehomogénnu morfológiu NP COS-BA / Ce6 v porovnaní s NP COSBA. Okrem toho je vzdialenosť molekulárnej škrupiny a vrstvy tiež blízka hrúbke škrupiny (w2,35 nm) NP, ako je vidieť pomocou TEM (obr. 2H). Spoločne sme špekulovali, že tvorba NP COS-BA / Ce6 alebo COS-BA NP so štruktúrou škrupiny môže byť do značnej miery pripísaná tejto tendencii molekúl zhromažďovať sa do sieťových štruktúr dutých škrupín.

Obrázok 1 Príprava a charakterizácia chitosanových oligosacharidmi modifikovaných nanozostáv COS-BA/Ce6 NP sprostredkovaných proliečivom kyseliny betulínovej (COS-BA). (A) Amplifikované kľúčové polohy1H NMR COS-BA. (B) Príprava spoločne zostavených NP COS-BA/Ce6 s rôznymi pomermi COS-BA/Ce6. (C) Distribúcia veľkosti COS-BA/Ce6 NP s použitím COS-BA a Ce6 (molárny pomer, 8:1) ako stavebných blokov. (D) Rozpustnosť vo vode a Tyndallov efekt kozostáv indikujú koloidný charakter. (E) SEM a TEM snímky voľných samozostavieb COS-BA a spoločne zostavených NP COS-BA/Ce6. (F) Súhrn fyzikálno-chemických vlastností COS-BA/Ce6 NP. (G) FT-IR spektrá, (H) UV Vis spektrá a (I) fluorescenčné emisné spektrá voľných Ce6, COS-BA a spoločne zostavených COS-BA/Ce6 NP vo vode.

Obrázok 2 Štruktúry (A) COS-BA samozostáv a (E) spoločne zostavených COS-BA/Ce6 NP po simulácii molekulárnej dynamiky (MD) pre 5 ns s molárnym pomerom štruktúrnych jednotiek 8:1 (COS-BA /Ce6, vypočítané na základe účinnosti zaťaženia Ce6). Čiarový model sa použil pre H2O a tyčinkové modely predstavujú molekuly COS-BA alebo Ce6, kde sú atómy C Ce6 označené fialovou farbou. Informácia o vodíkovej väzbe medzi molekulami COS-BA v (B) jeho samozostavách a (F) COS-BA/Ce6 NPs kozostavách. (C) Zjavne symetrická štruktúra molekulárneho usporiadania COS-BA po simulácii MD. (G) Možné molekulárne interakcie medzi COS-BA a Ce6 ukazujú potenciálne pp stohovanie. Uvedená hrúbka obalových molekúl v "ortogonálnej" dutej sieťovej štruktúre po predĺžení zodpovedajúcich MD boxov (D) voľných COSBA samozostáv a (H) COS-BA/Ce6 NP kozostáv.

3.3. Energetický mechanizmus zvýšenej 1 generácie O2

Ďalej sme ďalej skúmali tvorbu singletového kyslíka (1 O2), jednej z kritických reaktívnych foriem kyslíka (ROS) výkonu PDT pomocou DPBF (1,3-difenylizobenzofurán) ako sondy. Po trvalom ožarovaní zmesových roztokov COS-BA/Ce6 NP s DPBF sa intenzita UV absorpcie DPBF znížila, čo ukazuje na 1 tvorbu O2 (obr. 3A). Po porovnaní s referenčnou metylénovou modrou (MB) bol F ( 1 O2) COS-BA/Ce6 NP vypočítaný ako 0.26, o niečo vyšší ako voľný Ce6 (FZ0.19). (Obr. 3B). Vo všeobecnosti energia absorbovaná fotosenzibilizátormi podstúpi tri relaxačné dráhy zahŕňajúce fluorescenciu, zahrievací účinok prostredníctvom vibračnej relaxácie a generovanie ROS prostredníctvom medzisystémového kríženia (ISC)41. V súlade s výrazne zhášanou fluorescenčnou emisiou COS-BA / Ce6 NP tiež nepodporovali žiadny zahrievací účinok vo vode (podporné informácie Obr. S15), čo znamenalo vylepšený proces ISC po spoločnej montáži Ce6 s COS-BA, čo viedlo k do vylepšenej generácie 1 O2. Aby sme ďalej objasnili molekulárny mechanizmus takéhoto účinku, pokúsili sme sa optimalizovať a vypočítať možný model jednej molekuly COS-BA/Ce6 pozostávajúci z potenciálneho pp stohovania získaného z MD simulácie teóriou funkčnej hustoty (DFT) (obr. 3C). . Úžasne, COS-BA/Ce6 vykazoval pozorovateľnú červenú UV absorpciu 581,24 nm ako voľný Ce6 (579,30 nm), čo naznačuje výskyt pp stohovania (obr. 3D). Hoci energeticky minimalizovaná geometria COS-BA/Ce6 vykazovala mierne štrukturálne rozdiely so zadanou MD konfiguráciou, stále bolo možné pozorovať charakteristické pstacking medzi C]C alebo C]O väzbami COS-BA s porfínovým kruhom Ce6, čo ďalej potvrdzuje, že nad p‒p je možné stohovanie. Medzitým sa nedávno preukázalo, že zvýšená účinnosť darovania elektrónov pomocou stohovania p‒p by mohla uľahčiť proces ISC42, zatiaľ čo rýchlosť ISC (KISC) je úmerná (1/DEST) 2,43. To znamená, že nižšia energetická medzera (DEST) fotosenzibilizátora zlepší proces ISC podporujúci efektívnu tvorbu ROS. Následne vypočítame najnižší excitovaný singletový stav (S1) a tripletový stav (T1) Ce6 a COS-BA/Ce6 (obr. 3E). Výsledky ukázali, že COS-BA/Ce6 vykazoval znížený DEST o 1,1892 eV v porovnaní s voľným Ce6 (1,2001 eV), čo potvrdzuje vylepšený proces ISC. Zníženie DEST je užitočné pre produkciu 1 O2, čo bolo overené aj u iných nanofotosenzibilizátorov44. Celkovo sa zdá, že p-stacking znižuje DEST Ce6 po spoločnej montáži s COS-BA, čo vedie k zlepšeniu 1 generácie O2.

Obrázok 3 Energetický mechanizmus zlepšenej tvorby 102 indukovanej COS-BA/Ce6 NP. (A) UV Vis spektrá fotorozkladu 1,3-difenylizobenzofuránu (DPBF) po dlhšom ožiarení COS-BA/Ce6 NP. (B) V grafoch prvého poriadku zmien absorpcie UV DPBF (DOD) bol výťažok 102 hodnotený použitím metylénovej modrej (MB) (FZ 0.52) v DMSO ako referenčnej zlúčeniny. (C) Energeticky minimalizované štruktúry možného modelu COS-BA/Ce6 s jednou molekulou pri pohľade zboku a spredu, ktorý sa získal podľa počiatočnej molekulárnej konfigurácie medzi Ce6 a COS-BA po simulácii MD a po výpočtoch DFT. (D) Predpokladané prechody UV Vis absorpčného spektra (vertikálne stĺpce) voľného Ce6 a optimalizovaný model COS-BA/Ce6. (E) Vypočítané energetické hladiny ich najnižšieho excitovaného singletového stavu (S1) a najnižšieho tripletového stavu (T1), v tomto poradí, [Gaussian 09/B3LYP/6-31G (d, p)]. Kde DEST bol vypočítaný ako ES1 ET1.

3.4. Charakteristika pokoja chemoterapie

Potom, aby sa potvrdil koncept dizajnu v tejto štúdii, že vývoj amfifilnej molekuly COS-BA by mohol účinne zvýšiť terapeutický účinok BA zlepšením absorpcie buniek zvýšením hydrofility a medzitým ďalšou konštrukciou na stimuly reagujúcej a plne hydrofilnej COS-BA/Ce6. NP uľahčili jeho dormanciu v normálnych tkanivách a aktiváciu v miestach nádoru. Aby sme otestovali túto hypotézu, najprv sme skúmali správanie COS-BA/Ce6 NP pri uvoľňovaní liečiva v rôznych roztokoch pufrov (obr. 4A). Výsledky ukázali, že COS-BA/Ce6 NP vykazovali správanie sa reagujúce na pH s kumulatívnym uvoľňovaním Ce6 88 % pri pH 5,6 a 57 % pri pH 7,4 po 24 hodinách. Táto vlastnosť pravdepodobne vznikla deštrukciou mnohých vodíkových väzieb, ktoré existovali v COS-BA/Ce6 NP po zavedení kyslého Hþ45, čo viedlo k zvýšenému uvoľňovaniu Ce6 (obr. 4B). Toto bolo ďalej potvrdené rozobratím COS-BA/Ce6 NP po priamej inkubácii v kyslom prostredí (obr. 4C). Táto vlastnosť reagujúca na pH môže byť prospešná pre účinnú protinádorovú terapiu v dôsledku slabo kyslého mikroprostredia nádoru34. Medzitým COS-BA/Ce6 NP mali lepšiu stabilitu, pretože po inkubácii v PBS a 1640-RMPI kultivačnom médiu buniek počas 10 dní nebolo možné pozorovať žiadne významné zmeny veľkosti alebo PDI (podporné informácie obr. S16), čo by bolo dôležité pre ich potenciálne využitie pre ďalšie biomedicínske aplikácie. Následne sa uskutočnili ďalšie výskumy vyhodnotením cytotoxicity voľného lipofilného BA (kontaktný uhol q: 133,3°) a amfifilného COS-BA (q: 52°) (obr. 4D) pomocou štandardných testov na metyltiazolyl-difenyltetrazoliumbromid (MTT). Ako sa predpokladalo, či už pre rakovinové bunky 4T1, alebo pre normálne hepatocyty LO2, jednotlivé COS nemajú v podstate žiadnu protirakovinovú aktivitu pri relatívne nízkych dávkach. Môže to byť spôsobené antiproliferačnými účinkami COS, ktoré sa aktivujú prostredníctvom indukcie NF-kB signálnej dráhy iba pri vysokých koncentráciách (približne na úrovni miligramov)30. Zatiaľ čo COS-BA vykazuje pozoruhodne zvýšenú cytotoxicitu s extrémne nízkymi hodnotami IC50 (6,03 mg/ml pre 4T1 a 9,92 mg/ml pre LO2) v porovnaní s hodnotami BA (17,63 mg/ml pre 4T1 a 20,53 mg/ml pre LO2). pri rovnakých hmotnostných koncentráciách (obr. 4E a J). Vyvolané výsledky naznačujú, že modifikácia vo vode rozpustného COS výrazne zvyšuje účinnosť bunkovej absorpcie lipofilného BA, čo vedie k silnej protirakovinovej aktivite COS-BA. Na kvantifikáciu účinnosti vychytávania sa akumulácia BA alebo COS-BA v bunkách 4T1 priamo určila pomocou HPLC (podporné informácie obr. S17). Výsledky jasne podporujú, že amfifilný COS-BA vykazuje významne vyššiu absorpciu ako voľný BA (približne 3,{70}}krát po 3 hodinách inkubácie), čo dokazuje zvýšenú chemoterapeutickú aktivitu COS-BA. Vyššie uvedený záver bol ďalej podporený výrazne zlepšenou cytotoxicitou amfifilnej COSBA proti rakovinovým bunkám HepG2 a MCF-7 (podporné informácie obr. S18), ktoré sú v súlade s koncepciou dizajnu. Po spoločnej montáži s Ce6 sme zistili, že COS-BA/Ce6 NP bez ožiarenia vykazujú pozoruhodne inhibovanú cytotoxicitu proti rakovinovým bunkám 4T1 v porovnaní s ekvivalentným COS-BA, najmä pri 11,5 mg/ml, ale základná aktivita PDT nebola ovplyvnená ( Obr. 4F). Aby sme tento jav úplnejšie potvrdili, ďalej sme skúmali in vitro cytotoxicitu COS-BA / Ce6 NP proti iným rakovinovým bunkám vrátane MCF-7 a HepG2. Je zaujímavé, že amfifilný COS-BA vykazoval veľmi silnejšiu cytotoxicitu voči bunkám MCF-7 (obr. 4G), ale chemoterapeutická aktivita sa významne znížila po spoločnej montáži s Ce6, tj neožiarenými COS-BA/Ce6 NP. Podobné výsledky boli tiež pozorované v bunkách HepG2 len s miernym poklesom (obr. 4H). Na ďalšiu podporu vyššie uvedených záverov sme tiež vyhodnotili chemoterapeutické účinky nanozostáv a COS-BA proti normálnym bunkám myších fibroblastov L929 a ľudským hepatocytom LO2 (obr. 4I). Výsledky ukázali, že zostavené NP COS-BA / Ce6 významne znížili pôvodné vysoko toxické amfifilné liečivo COS-BA, čo vykazovalo vynikajúcu biokompatibilitu. Analýzou cytotoxicity boli hodnoty IC50 amfifilného COS-BA významne nižšie ako hodnoty spoločne zostavených COS-BA/Ce6 NP bez ohľadu na rakovinové alebo normálne bunky (obr. 4J). To znamená, že konštrukcia úplne hydrofilných a na podnety reagujúcich nanokozostav môže vopred účinne potlačiť vysokú cytotoxicitu amfifilného liečiva COS-BA. Vzhľadom na charakteristický rys reagujúci na pH sa zdá, že COS-BA/Ce6 NP budú nečinné v normálnych tkanivách s požadovanou nízkou toxicitou chemoterapie, ale aktívne v nádorových tkanivách vďaka ich stimulácii uvoľňovania vysoko toxického COS-BA v slabo kyslom nádore. mikroprostredie. Súhrnne povedané, na rozdiel od široko uvádzanej neofunkcionalizácie chemoterapeutických činidiel, ktoré majú zvýšenú protirakovinovú aktivitu22,23, amfifilné nanozostavy sprostredkované COS-BA nielenže vykazujú inteligentnú „dormanciu“ so zákernými chemoterapeutickými účinkami, ale zachovávajú si aj špecializovanú aktivitu PDT, čo ukazuje obrovský potenciál. pre inteligentnú protinádorovú terapiu.

Obrázok 4 (A) In vitro profily uvoľňovania Ce6 z COS-BA/Ce6 NP v PBS (pH 7,4, 6,5 alebo 5,6) obsahujúcom Tween 80 (0,5 %, obj./obj.) pri 37 C. (B) Možný mechanizmus reagujúci na pH, ktorý Hþ spúšťa demontáž NP. (C) Demontáž COS-BA/Ce6 NP po priamej inkubácii vo vode s približne pH 4.{45}} (D) Kontaktný uhol voľných NP BA, Ce6, COS-BA a COS-BA/Ce6. (E) Bunková cytotoxicita voľného BA, COS a amfifilného COS-BA proti reprezentatívnym rakovinovým 4T1 a normálnym bunkám LO2. Životaschopnosť buniek (F) 4T1, (G) MCF-7, (H) HepG2 rakovinových buniek po inkubácii s voľnými COS-BA, COS-BA/Ce6 NP s/bez ožiarenia pri uvedenej ekvivalentnej koncentrácii COS-BA počas 24 hodín. (I) Bunková cytotoxicita voľných COS-BA, neožiarených COS-BA/Ce6 NP proti normálnym bunkám LO2 a L929. (J) Analýza IC50 COS-BA proti rakovinovým a normálnym bunkám. Dáta sú vyjadrené ako priemer SD (nZ6). *P ˂ 0,05, **P ˂ 0,01 a ***P ˂ 0,001 ukazujú významné rozdiely.

Aby sa preskúmali možné dôvody tejto charakteristiky dormancie chemoterapie, časovo závislé správanie bunkovej absorpcie NP COS-BA / Ce6 sa vyhodnotilo postupne inkubáciou s rakovinovými bunkami 4T1. Výsledky ukázali, že hoci COS-BA/Ce6 NP vykazovali pozoruhodné zhášanie fluorescencie, stále vykazovali zvýšenú fagocytárnu účinnosť v porovnaní s voľným Ce6 v dôsledku silnejšej cytoplazmatickej červenej fluorescencie, ako bolo stanovené kvantitatívnou analýzou prietokovou cytometriou (obr. 5A). Túto zlepšenú bunkovú internalizáciu NP možno pripísať endocytóze21. Celkovo sme špekulovali, že hoci vysoko vo vode rozpustné kozostavy COS-BA/Ce6 NP (kontaktný uhol q: 36,7 ) vykazovali zlepšenú bunkovú endocytózu ako lipofilný Ce6 (q: 132,6, blízko BA), znížená účinnosť fagocytózy NP sa môžu objaviť v porovnaní s amfifilnou molekulou COS-BA, čím sa zdá, že potláčajú chemoterapeutickú cytotoxicitu NP COS-BA/Ce6. To znamená, že účinnosť bunkovej absorpcie od vysokej po nízku ako taká sekvencia: amfifilné COS-BA, hydrofilné COS-BA/Ce6 NP, lipofilné BA alebo Ce6. Ešte dôležitejšie je, že neadekvátna demontáž bunkových NP môže byť ďalším dôležitým dôvodom oslabeného chemoterapeutického účinku, z ktorých všetky môžu súvisieť s inteligentnou chemoterapeutickou nečinnosťou COS-BA / Ce6 NP. Okrem toho, pretože demontáž NP bola špecificky vykonaná v kyslom prostredí nádorových buniek, aby sme demonštrovali vlastnosť reagujúcu na pH, ďalej sme sa pokúsili porovnať účinky absorpcie COS-BA/Ce6 NP v normálnych LO2 bunkách (obr. 5B). . COS-BA/Ce6 NP však nevykazovali významne inhibovanú Ce6 červenú fluorescenciu v LO2 bunkách. Na rozdiel od toho, správanie sa vychytávania pomocou LO2 bolo podobné ako pri rakovinových bunkách 4T1, čo naznačuje, že COS-BA/Ce6 NP sa môžu rozložiť aj v normálnych bunkách, čo môže byť výsledkom slabo kyslého pH vnútrobunkových kompartmentov (endozómov/lyzozómov) existujúcich vo vnútri. rakovinové aj normálne bunky46. Pretože bunkové vychytávanie NP závisí od procesu endocytózy, priama inkubácia lieku nemusí zvýrazniť citlivosť COS-BA / Ce6 NP na pH na bunkovej úrovni. Nádorové mikroprostredie (TME) je však v porovnaní s normálnymi tkanivami vysoko kyslé47. Bez ohľadu na intracelulárnu rakovinu alebo TME, COS-BA / Ce6 NP môžu reagovať na pH a rozobrať, aby spustili uvoľňovanie vysoko toxického COS-BA. Zatiaľ čo v normálnych tkanivách bolo možné COS-BA / Ce6 NP rozobrať až po vstupe do normálneho bunkového prostredia, čím sa znížila pravdepodobnosť uvoľnenia COSBA. Preto usudzujeme, že chemoterapeutická dormancia charakteristika COS-BA / Ce6 NP pre mikroprostredie nádoru je platná a spoľahlivá a myšlienka dizajnu v tejto štúdii je uskutočniteľná.

3.5. In vitro chemoterapia/PDT protirakovinová účinnosť COS-BA/Ce6 NP

Okrem toho, pred podrobnou in vitro chemoterapiou/PDT protirakovinovou účinnosťou COS-BA/Ce6 NP a na ďalšie odhalenie mechanizmu endocytózy, študujeme štyri hlavné endocytózové dráhy pridaním zodpovedajúcich endocytických inhibítorov vrátane chlórpromazínu (sprostredkovaného klatrínom), chlorochínfosfátu ( inhibítor acidifikácie lyzozómov), nystatín (sprostredkovaný kaveolami) a inhibítor makropinocytózy EIPA (etylizopropylamilorid) (obr. 5C a D). Pozorujeme, že zavedenie nystatínu a chlórpromazínu by mohlo účinnejšie inhibovať fagocytárnu účinnosť ako EIPA a chlorochín fosfát, čo ukazuje výrazne zníženú bunkovú fluorescenciu v porovnaní s normálnym 37 C. Tieto výsledky ukázali, že COS-BA/Ce6 NP boli internalizované viacerými mechanizmami, najmä prostredníctvom endocytózové dráhy sprostredkované klatrínom a caveolae. Vzhľadom na zvýšenú tvorbu 1 O2 prostredníctvom intermolekulových interakcií vykazujú COS-BA/Ce6 NP významne zvýšený medzibunkový výťažok ROS ako Ce6, ako naznačuje silnejšia zelená fluorescencia DCFH sondy (obr. 5E), čo znamená vyššiu fotodynamickú účinnosť. Testy MTT demonštrujú, že COS-BA/Ce6 NP pri ožiarení majú pozoruhodne zvýšený inhibičný účinok na 4T1 bunky ako ekvivalentný Ce6, zatiaľ čo s relatívne miernou cytotoxicitou bez ožiarenia (obr. 5F). Významné je, že IC50 Ce6 ​​(0,53 mg/ml) v COS-BA/Ce6 NP bola oveľa nižšia ako vo voľnom Ce6 (1,39 mg/ml) (obr. 5G), čo naznačuje výrazne zlepšenú účinnosť PDT, ktorá bola ďalej dokonale demonštrovaná cytotoxicitou COSBA/Ce6 NP proti ľudským rakovinovým bunkám MCF-7 a HepG2 (podporná informácia obr. S19). Podobne, v porovnaní s voľným Ce6, relatívne nižšie hodnoty IC25, IC50 a IC75 boli tiež pozorované v spoločných zostavách (obr. 5G). Medzitým, v porovnaní so samotnou Ce6 PDT a jednou chemoterapiou NP v tme, COS-BA/Ce6 NP pod ožiarením dosiahli účinnejšiu kombinovanú chemoterapiu/PDT proti vyššie uvedeným trom rakovinovým bunkám, čo ukazuje synergizmus (kombinačný index: CI ˂ 1) ( Obr. 5I). Okrem toho, duálne farbenie fluorescencie živých/mŕtvych buniek pomocou kalceín-acetoxymetylesteru (kalceín-AM) a propídiumjodidu (PI) ďalej potvrdilo, že COS-BA/Ce6 NP môžu účinne indukovať bunkovú apoptózu a nekrózu, pretože ošetrené bunky boli takmer zafarbené s červeným PI fluorescenčným signálom pri kultivácii počas ďalších 10 hodín po ožiarení (obr. 5H). Medzitým neožiarené COS-BA / Ce6 NP (vyššia dávka Ce6: 3, 2 mg / ml) tiež mali určitú chemoterapeutickú aktivitu, ako je vidieť súčasne zo signálov AM a PI. Táto pozoruhodne zlepšená PDT aktivita COS-BA/Ce6 NP bola ďalej potvrdená AM/PI farbením po ošetrení počas ďalších 20 hodín (podporné informácie obr. S20). Okrem toho, keď sa k bunkám 4T1 ošetreným COS-BA/Ce6 NPs-PDT pridal azid sodný (SA) a D-manitol (DM), osobitne špeciálny tlmič 102 a $OH48, zjavne zvýšená životaschopnosť buniek znamenala, že Fotoreakcie typu I ($OH) a typu II (102) sa vyskytli súčasne v procese PDT sprostredkovanom COSBA/Ce6 NPs (obr. 5J). Okrem toho COS-BA/Ce6 NP majú najmä lepšiu krvnú kompatibilitu, ako naznačuje zanedbateľná hemolýza červených krviniek (obr. 5K), čo naznačuje potenciál pre biomedicínske aplikácie prostredníctvom intravenózneho podávania.

3.6. In vivo biodistribúcia COS-BA/Ce6 NP

Následne, pred výskumom distribúcie in vivo, sme ďalej hodnotili farmakokinetiku NP COS-BA / Ce6 monitorovaním koncentrácie Ce6 v krvi po intravenóznej injekcii ekvivalentných NP Ce6 alebo COS-BA / Ce6. Profily koncentrácie Ce6-čas v krvi (obr. 6A) a porovnávacie farmakokinetické parametre (podporná informačná tabuľka S1) jasne podporujú, že COS-BA/Ce6 NP majú predĺženú cirkuláciu v krvnom obehu, čo môže umožniť väčšiu akumuláciu v nádore stránky. Najmä COS-BA / Ce6 NP vykazovali rýchlu elimináciu krvi do 2 hodín, čo znamená priaznivú biologickú odbúrateľnosť. V súlade s tým sme potom skúmali in vivo biodistribúciu a schopnosť akumulácie nádorov COS-BA/Ce6 NP (obr. 6B a C). Podobne ako všeobecne uvádzané nanokompozity Ce633, COS-BA/Ce6 NP sa môžu rýchlo distribuovať do celého tela. Najmä počas prvých 4 hodín vykazovali zostavy očividne silnejšiu fluorescenčnú emisiu v miestach nádoru ako voľný Ce6, čo naznačuje zlepšenú retenčnú a na nádor cielenú akumulačnú schopnosť NP COS-BA/Ce6, pravdepodobne pripisovanú efektu pasívnej zvýšenej retencie permeability (EPR). ktoré umožňujú nanočastice14. Po 6 hodinách po injekcii intenzita fluorescencie v miestach nádoru postupne rýchlo klesala. Pozoruhodné je, že na rozdiel od bežne uvádzaných nanokompozitov s výrazne zvýšenou akumuláciou v nádore v porovnaní s voľným pozitívnym liekom29, COS-BA/Ce6 NP nevykazovali veľmi výraznú akumuláciu v nádore 24 hodín po injekcii ako voľný Ce6 (obr. 6C), ktorý bol ďalej podporované zobrazením vyrezaného nádoru (obr. 6D a E). Vynikajúca biologická odbúrateľnosť NP môže byť zodpovedná za zavedenie prírodných malých organických molekúl. Toto sa pozorovalo aj pri iných nanozostavách sprostredkovaných malými molekulami terpenoidov49. Okrem toho COS-BA/Ce6 NP tiež vykazovali podobnú tkanivovú distribúciu ako voľný Ce6 (obr. 6E) a ex vivo priemerná intenzita fluorescencie bola vo všeobecnosti nižšia ako in vivo, čo ďalej znamená dobrú biologickú odbúrateľnosť. Okrem toho, berúc do úvahy tesný rozdiel v hladine fluorescencie medzi 2 a 4 hodinami po injekcii NP a Ce6, ako aj experimentálnu operatívnosť umožňujúcu dostatočné intervaly na ožarovanie, boli 4 hodiny po podaní zvolené ako svetelný časový bod pre následnú terapiu PDT.

Vzhľadom na nie príliš výraznú akumuláciu nádoru po 24 hodinách ako voľný Ce6, aby sme ďalej potvrdili zvýšený účinok EPR, ktorý majú NP COS-BA / Ce6, okamžite sme monitorovali fluorescenčné obrazy nádorov ex vivo v rôznych časoch po intravenóznej injekcii nanoliečiva ( Obr. 6F a G). Je pozoruhodné, že buď 20 minút alebo 12 hodín po injekcii, COS-BA / Ce6 NP skutočne vykazovali silnejšiu fluorescenčnú emisiu v miestach nádoru ako voľný Ce6, čo demonštruje vynikajúcu a zvýšenú schopnosť akumulácie nádoru. Medzitým, ako čas plynul, intenzita fluorescencie zadržaná v nádorovom tkanive postupne slabla (obr. 6G), čo je úplne v súlade s výsledkami fluorescenčného zobrazovania zvierat in vivo. Je zrejmé, že tento rýchly biologický metabolizmus a zvýšená akumulácia nádoru zabránili potenciálnej dlhodobej akumulačnej toxicite, čo zaručuje vysoko účinnú protinádorovú terapiu s lepšou biologickou bezpečnosťou.

Obrázok 5 In vitro protirakovinová účinnosť COS-BA/Ce6 NP. Bunková internalizácia (A) 4T1 rakovinových buniek a (B) LO2 normálnych buniek inkubovaných vo voľných Ce6 alebo COS-BA/Ce6 NP počas 0,5 a 3 h, a zodpovedajúca prietoková cytometrická analýza intenzity fluorescencie. (C) Inhibícia absorpcie v štúdiách špecifických endocytických dráh a (D) zodpovedajúca intenzita fluorescencie buniek meraná prietokovou cytometriou po inkubácii s COSBA/Ce6 NP s/bez endocytických inhibítorov vrátane chlórpromazínu, chlorochínu, nystatínu a etylizopropylamiloridu (EIPA). Mierka Z 20 mm. (E) Bunková tvorba ROS indukovaná voľnými Ce6 alebo COS-BA/Ce6 NP (ekvivalent Ce6: 1,6 mg/ml). Mierka Z 20 mm. (F) Životaschopnosť buniek 4T1 po rôznych ošetreniach počas 24 hodín. (G) Analýza IC25, IC50, IC75 voľných NP Ce6 a COS-BA/Ce6 proti bunkám 4T1, MCF-7 a HepG2. (H) Calcein-AM/propidium jodid (PI) živé/mŕtve farbenie buniek 4T1 ošetrených COS-BA/Ce6 (Ce6: 1,6 mg/ml) po inkubácii počas ďalších 10 hodín, ako aj neožiarené COS- BA/Ce6 NP (Ce6: 3,2 mg/ml). Mierka Z 50 mm. (I) Kombinačný index (CI) COS-BA/Ce6 NP na bunkách 4T1, MCF-7 a HepG2, ako je určené výpočtom Chou Talalayovej vety. (J) Mechanizmy PDT (Typ I a Typ II) indukované ožiarením COS-BA/Ce6 NP a hodnotené špecifickým 102 a $OH zhášačom azidom sodným (SA) a D-manitolom (DM). (K) Percento hemolýzy červených krviniek po inkubácii s COS-BA/Ce6 NP počas 4 hodín. Údaje sú vyjadrené ako priemer SD (nZ3). *P ˂ 0,05, **P ˂ 0,01 a ***P ˂ 0,001 vykazujú významné rozdiely.

Obrázok 6 Krvný obeh in vivo a biodistribúcia COS-BA/Ce6 NP. (A) Časové profily koncentrácie Ce6 v krvi po iv injekciách ekvivalentných Ce6 alebo spoločne zostavených COS-BA/Ce6 NP (n Z 3). (B) Celotelové fluorescenčné obrazy myší s nádorom 4T1 po iv injekciách uvedených liekov v rôznych časových bodoch. (C) Priemerná intenzita fluorescencie získaná z nádorových miest v (B). (D) Ex vivo fluorescenčné snímky nádorov a hlavných orgánov vyrezaných z vyššie uvedených myší po 24 hodinách a zodpovedajúci kvantitatívny výsledok (E) intenzity fluorescencie (n Z 3). (F) Ex vivo fluorescenčné obrazy nádorov a hlavných orgánov v rôznych časoch po iv injekciách Ce6 alebo COS-BA/Ce6 NP a (G) zodpovedajúca analýza intenzity fluorescencie nádorov. Údaje sú vyjadrené ako priemer SD (nZ3).

3.7. In vivo chemoterapia/PDT kombinatorická protinádorová liečba 

Motivovaná jedinečnou charakteristikou dormancie, dobrou biologickou odbúrateľnosťou a aktivitou PDT bola skúmaná in vivo protinádorová terapia kombinovaná chemoterapia/PDT. Myši s nádorom 4T1 boli náhodne rozdelené do 6 skupín a intravenózne im bol injikovaný ekvivalentný Ce6 (3,5 mg/kg tela) každé 2 dni v celkovom počte troch dávok. 4 hodiny po injekcii sa nádorové miesta myší vo svetelných skupinách ožarovali 15 minút (obr. 7A). Medzitým sa každý druhý deň zaznamenávali zodpovedajúce objemy nádorov alebo telesné hmotnosti. Po 14 dňoch liečby (obr. 7B) bol voľný Ce6 s ožiarením a voľný COS-BA neúčinný pri potlačovaní nádoru, pravdepodobne v dôsledku obmedzenej akumulácie liečiva v nádorovom tkanive. Na rozdiel od toho, po ožiarení COS-BA / Ce6 NP bola pozorovaná najvýznamnejšia inhibícia nádoru, čo potvrdzuje vynikajúcu účinnosť kombinácie chemoterapia / PDT. Priemerná hmotnosť nádoru (obr. 7D) a zodpovedajúce fotografie vyrezaných nádorov (obr. 7E) preukázali najlepšiu protinádorovú účinnosť COS-BA/Ce6 NP pri ožiarení, pretože liečené myši vykazovali najmenšie veľkosti nádorov ako iné skupiny. Priemerný pomer nádorovej inhibície COS-BA/Ce6 NPs liečených PDT dosiahol 80,3 %, čo je viac ako u voľného Ce6 PDT (42,4 %) a voľného COS-BA (38,5 %). Pozoruhodné je, že hoci predchádzajúce štúdie in vitro ukázali, že COS-BA/Ce6 NP bez svetla vykazovali spiacu funkciu chemoterapeutickej aktivity, stále majú zvýšenú protinádorovú účinnosť (49,5 %) v porovnaní s voľným COS-BA (obr. 7D). Špekulovali sme, že k tomuto výsledku prispievajú dva možné dôvody, jedným je vyššia akumulácia COS-BA / Ce6 NP v nádore v dôsledku široko uvádzaného účinku EPR. Ďalším faktorom je slabo kyslé nádorové mikroprostredie, ktoré stimulovalo uvoľňovanie vysoko toxického COS-BA. Kvôli vyššej kritickej koncentrácii miciel (CMC, 187 mg/ml) COS-BA (podporná informácia obr. S21) by mohla existovať v monomérnom stave v prostredí nádoru, čím by sa podporila zlepšená chemoterapia neožiarených COS- BA/Ce6 NP. Okrem toho sa na ďalšie overenie vynikajúcej protirakovinovej účinnosti COS-BA/Ce6 NP uskutočnilo farbenie nádorov hematoxylínom a eozínom (H&E) (obr. 7G).

Obrázok 7 Štúdia účinnosti s modelom subkutánneho xenoštepu 4T1. (A) Schematické znázornenie liečby in vivo PDT. (B) Profily rastu nádorov, (C) zmeny telesnej hmotnosti a (D) hmotnosti vyrezaných nádorov obsahujúce pomery inhibície nádoru 4T1-myší nesúcich po rôznych ošetreniach v uvedených skupinách (n Z 5 pre každú skupinu). (E) Obrázky vyrezaných nádorov z reprezentatívnych myší po liečbe. (F) Biochemická analýza séra po ošetrení COS-BA/Ce6 NP počas 14 dní. (G) Reprezentatívne farbenie H&E rezov vyrezaných nádorov po rôznych ošetreniach. Mierka Z 50 mm. (H) TUNEL farbenie voľných Ce6 a COS-BA/Ce6 NPs PDT-ošetrených nádorových rezov. Mierka Z 20 mm **P < 0,01 označuje významné rozdiely.

Výsledky ukázali, že rezy nádoru ošetrené COS-BA/Ce6 NPs-PDT vykazovali vážne poškodenie tkaniva a nedostatok jadier, zatiaľ čo v ostatných skupinách bola pozorovaná mierna nekróza tkaniva. Súčasne, v porovnaní s voľným svetlom Ce6, COS-BA/Ce6 NP pod ožiarením výrazne zvýšili počet buniek pozitívnych na TUNEL, ktoré vykazovali silnejšie hnedé jadrové farbenie (obr. 7H), čo ďalej potvrdilo vynikajúcu kombinovanú terapiu chemoterapia/PDT. Okrem toho neboli pozorované žiadne zjavné zmeny telesnej hmotnosti vo všetkých skupinách (obr. 7C). Aj keď skupiny COSBA/Ce6 NP alebo ľahké skupiny Ce6 mali mierny úbytok telesnej hmotnosti počas podávania, telesné hmotnosti sa po niekoľkých dňoch vrátili do normálu. V hlavných orgánoch zozbieraných na konci liečby nebolo možné nájsť žiadne zjavné poškodenie alebo zápalové lézie (podporné informácie obr. S22), čo naznačuje nízku/žiadnu systémovú toxicitu a dobrú biologickú bezpečnosť COS-BA/Ce6 NP. Okrem toho, hoci COS-BA/Ce6 NP sa hromadia hlavne v pečeňovom tkanive, zodpovedajúce markery pečeňových funkcií (ALT, AST a ALP) nevykazujú významné zmeny v porovnaní s normálnymi zdravými myšami (obr. 7F), čo naznačuje lepšiu biokompatibilitu. Okrem toho sa zdalo, že markery funkcie obličiek (BUN, CRE a UA) a biochemické parametre (ALB a TBIL) sú podobné ako u normálnych myší, čo ďalej naznačuje lepšiu biologickú bezpečnosť. Je zrejmé, že tieto kozostavy COS-BA/Ce6 NP sprostredkované organickou malou molekulou COS-BA majú viacero priaznivých terapeutických vlastností, ktoré otvárajú atraktívne možnosti pre aplikácie v klinickej medicíne.

3.8. Protinádorová imunita kombinovanej chemoterapie/PDT a blokády anti-PD-L1

Nedávno početné inovatívne štúdie ukázali, že kombinácia imunoterapie rakoviny s inými spôsobmi liečby by mohla účinne podnietiť nádorovo špecifické imunitné reakcie na elimináciu primárnych alebo vzdialených nádorov1. Povzbudení jedinečnou funkciou dormancie pri chemoterapii a vynikajúcou protinádorovou účinnosťou chemoterapie/PDT COS-BA/Ce6 NP sme teda zvedaví, či by to mohlo spustiť aj imunologické reakcie s pomocou imunitného adjuvans anti-PD-L1, čo by spôsobilo vysoko účinnú protinádorovú terapiu . Mohlo by to liečiť vzdialené nádory, ktoré nemožno liečiť priamo pomocou liečby PDT, a tým poskytnúť alternatívnu stratégiu pre klinické protirakovinové aplikácie? Na testovanie tejto hypotézy bol v tejto štúdii vytvorený model "dvoch nádorov" a podrobné experimentálne postupy boli znázornené na obr. 8A. Typicky boli dva nádory 4T1 naočkované do ľavého aj pravého boku každej myši. Vzhľadom na to, že anti-PD-L1 samotná nemá výrazný imunoterapeutický účinok50, boli experimenty rozdelené do 5 skupín vrátane neošetrenej skupiny, COS-BA/Ce6 NP, COS-BA/Ce6 NP s anti-PD-L1, COS- BA/Ce6 NP so svetlom, COS-BA/Ce6 NP so svetlom a anti-PD-L1. Po jedinej iv injekcii NP (Ce6: 3,5 mg/kg) sa pravé nádory (primárny nádor) v ľahkých skupinách ožarovali 15 minút, aby sa vyhodnotili imunologické účinky PDT/chemoterapie, zatiaľ čo ľavé nádory (vzdialené nádory) vo všetkých skupinách bez akejkoľvek liečby boli vybraní na individuálnu chemoterapiu. Následne v dňoch 2, 4 a 6 sa myšiam v imunitných skupinách iv injikovala protilátka anti-PD-L1 (15 mg na myš na injekciu) v celkovom počte troch dávok. Je významné, že bez ohľadu na liečbu PDT alebo nie, COS-BA/Ce6 NP plus anti-PD-L1 by mohli účinne inhibovať progresiu primárneho nádoru (obr. 8B). A zodpovedajúce priemerné pomery inhibície nádoru samostatne dosiahli 86,7 % (ožarovanie) a 76,5 % (žiadne ožarovanie), čo je oveľa viac ako pri individuálnej chemoterapii (5,7 %) alebo liečbe chemoterapiou/PDT (27,4 %) (obr. 8C) . Fotografie vypreparovaných nádorov (obr. 8D) a myší s 4T1-(podporné informácie obr. S23) po 14 dňoch liečby tiež vizuálne podporili vyššie uvedený záver. Tieto výsledky naznačujú, že chemoterapia založená na NP aj chemoterapia / PDT by mohli účinne aktivovať protinádorovú imunitu. Medzitým, čo je najpozoruhodnejšie, anti-PD-L1 blokáda plus NP tiež ponúkali pozoruhodný nádorový inhibičný účinok na neožiarené vzdialené (ľavé) nádory (obr. 8E a F), vo všeobecnosti silnejšie ako samotné COS-BA/Ce6 NP, ktoré boli Potvrdili to aj zodpovedajúce vyrezané nádory a obrázky myší po liečbe (obr. 8D a obr. S23), čo ďalej dokazuje účinnú protinádorovú imunitnú odpoveď vyvolanú COS-BA/Ce6 NP.

Na úplné preskúmanie tejto účinnej protinádorovej imunitnej odpovede sa ďalej hodnotili CD8+ cytotoxické T lymfocyty (CTL), kritický imunocyt pre imunoterapiu rakoviny4, a to analýzou imunitných buniek v nádoroch vpravo alebo vľavo po 14 dňoch liečby. Zistilo sa, že COS-BA/Ce6 NP plus anti-PD-L1 s alebo bez liečby PDT indukovali silnú CD8+ CTL infiltráciu v primárnych nádoroch (obr. 8H a J). Infiltrácia CD8+ CTL bola až 11,3 % po chemoterapii na báze COS-BA/Ce6 NP/PDT plus anti-PD-L1 liečbe, o niečo vyššia ako COS-BA/Ce6 NP plus anti-PD-L1 (9,63 %), a oveľa vyššia ako v iných skupinách bez anti-PD-L1, vrátane liečby chemoterapiou založenou na COS-BA/Ce6 NP (5,12 %) alebo chemoterapiou/PDT samotnou (4,07 %). Podobne, v porovnaní s neimunitnými skupinami, významne zvýšená CTL infiltrácia bola pozorovaná aj v ľavých (vzdialených) nádoroch u myší po COS-BA/Ce6 NP plus antiPD-L1 s alebo bez liečby PDT (obr. 8I a K), ďalej čo znamená vysoko účinné imunitné reakcie vyvolané chemoterapiou alebo kombinovanou terapiou chemoterapia/PDT. Medzitým, po zavedení anti-PD-L1, chemoterapia založená na COS-BA/Ce{46}} aj chemoterapia/PDT viedli k silnej produkcii viacerých cytokínov, ktoré zohrávajú kľúčovú úlohu pri regulácii cytotoxických funkcií CTL8, vrátane nádorových nekrotický faktor-alfa (TNF-a) (obr. 8L) a interferón-gama (IFN-g) (obr. 8M) vo vzorkách séra myší po 14 dňoch liečby, čo ďalej podporuje, že existovali účinné protinádorové imunitné odpovede. Okrem toho neboli pozorované žiadne zjavné zmeny v telesnej hmotnosti v rôznych liečebných skupinách (obr. 8N), čo naznačuje priaznivú biologickú bezpečnosť tejto kombinovanej chemoterapie/PDT/imunoterapie. Celkovo sme zistili, že hoci anti-PD-L1 plus COSBA/Ce6 NP so svetlom vykazovali mierne vyšší pomer inhibície nádoru (86,7 %) ako neožiarená skupina (76,5 %) proti pravým nádorom v dôsledku vplyvu PDT (obr. 8B‒D) neboli pozorované žiadne významné rozdiely v terapeutických účinkoch na ľavé nádory v prítomnosti (77,8 %) alebo neprítomnosti (78,4 %) PDT (obr. 8E‒G). Predpokladáme, že k tomuto javu vedú nasledujúce možné dôvody. Po prvé, pokiaľ ide o mechanizmus chemoterapie alebo PDT zosilňujúci imunologické účinky blokády kontrolného bodu anti-PD-L1, hromadiace sa štúdie preukázali, že tieto liečebné modality môžu spustiť akútny zápal v oblasti nádoru, čím sa zvýši prezentácia antigénov spojených s nádorom T bunky, čím sa indukujú rakovinové bunky, aby podstúpili ICD8,9. Nádorové bunky, ktoré podstupujú ICD, by zvýšili reguláciu signálov „zjedz ma“ vystavením kalretikulínu (CRT) na povrchoch imunogénne umierajúcich nádorových buniek a „nebezpečné“ signály uvoľnením skupinového boxu 1 s vysokou mobilitou (HMGB1), čo podporuje aktiváciu dendritických buniek na aktiváciu CTL, ktorých aktivita by mohla byť zvýšená anti-PD-L1, čo má za následok výrazne zlepšenú protirakovinovú imunoterapiu51.

Obrázok 8 Protinádorový účinok chemoterapie na báze COS-BA/Ce6 NP/PDT plus blokáda kontrolného bodu anti-PD-L1 imunoterapie. (A) Schematické znázornenie chemoterapie/PDT na báze CNP s anti-PD-L1 terapiou. (BeD) (B) Profily rastu nádorov, (C) priemerné hmotnosti nádorov a (D) obrázky vyrezaných nádorov z reprezentatívnych myší pre primárne (pravé) nádory po rôznych liečeniach počas 14 dní, ako je uvedené. (EeG) (E) Krivky rastu nádorov, (F) priemerné hmotnosti nádorov a (G) snímky vyrezaných nádorov pre neožiarené vzdialené (ľavé) nádory po rôznych liečeniach, ako je uvedené. (H) Populácie CD8+ T buniek v pravých nádoroch a (J) percentá infiltrácie CTL boli kvantitatívne detegované prietokovou cytometriou po 14 dňoch liečby. (I, K) Populácie CD8+ T buniek v ľavých nádoroch v deň 14 boli kvantitatívne detegované prietokovou cytometriou (n Z 3). Sekrécia cytokínov v sére po 14 dňoch liečby vrátane (L) IFN-g a (M) TNF-a meraná testom ELISA (n Z 3). (N) Zmeny telesnej hmotnosti myší počas rôznych ošetrení. *P < 0.05, **P < 0,01 a ***P < 0,001 ukazujú významné rozdiely.

Po druhé, v tejto práci by sa COS-BA / Ce6 NP mohli distribuovať na ľavý a pravý nádor súčasne, ľavá chemoterapia aj pravá chemoterapia / PDT majú obrovský potenciál indukovať nádorové bunky podstupujúce ICD. Medzitým sa COS-BA/Ce6 NP podávajú iba v jednej dávke, imunoterapia závisí hlavne od troch dávok anti-PD-L1, či už ide o chemoterapiu alebo chemoterapiu/PDT, sú to len priméry. Terapeutické rozdiely v indukcii ICD nádorových buniek medzi individuálnou chemoterapiou a kombinovanou chemoterapiou/PDT nemusia byť veľmi výrazné. Percento CD8+ CTL na ľavom (obr. 8I a K) a pravom nádore (obr. 8H a J) tiež podporilo vyššie uvedené špekulácie, žiadny významný rozdiel v CD8+ CTL nebol pozorovaný v prítomnosti alebo neprítomnosti PDT. Preto COS-BA/Ce6 NP plus anti-PD-L1 s ožiarením alebo bez neho dosiahli podobnú protirakovinovú účinnosť proti ľavým nádorom. Okrem toho, pretože bunky 4T1 exprimujú nízke hladiny PD-L152, bolo dokázané, že samotná anti-PD-L1 má akýkoľvek výrazný imunoterapeutický účinok na 4T1 rakoviny prsníka53,54. Napriek účinkom ICD sprostredkovaným NP COS-BA / Ce6 si vyžadujú ďalšie skúmanie, prezentované výsledky ukázali, že NP COS-BA / Ce6 dosahujú pozoruhodne zvýšené imunitné reakcie pomocou anti-PD-L1. Súhrnne sa zdá, že COS-BA / Ce6 NP skutočne zosilnili imunoterapiu rakoviny anti-PD-L1, nielen kombinovanú terapiu. Hoci anti-PD-L1 plus COS-BA/Ce6 NP s alebo bez liečby PDT nepreukázali významné rozdiely v terapeutických účinkoch, obidva vykazovali zjavne zvýšenú protinádorovú účinnosť v porovnaní s jednou dávkou COS-BA/Ce6 NP. To znamená, že aj keď bez liečby svetlom, po zavedení imunitného adjuvans antiPD-L1 môže byť imunogenicita nádorových zvyškov po chemoterapii COS-BA/Ce6 NPs posilnená, čo vedie k pozoruhodným systémovým protinádorovým imunitným odpovediam, čo vedie k účinnej supresii primárnych alebo vzdialených nádorov. Preto by malo byť možné eliminovať primárne a metastatické nádory počas klinickej protirakovinovej imunoterapie opakovanou liečbou NP. Je zrejmé, že tieto výsledky súhrnne poskytujú dôkazy o vysoko účinných a synergických protinádorových imunitných odpovediach indukovaných COS-BA/Ce6 NP v kombinácii s anti-PD-L1 blokádou, buď s chemoterapiou samotnou, alebo v kombinácii s chemoterapiou/PDT.

cistanche tubulosa - zlepšenie imunitného systému

4. Závery

V súhrne sme zámerne navrhli, syntetizovali a vyvinuli biokompatibilný, biodegradovateľný, nízko toxický, ale vysoko účinný a klinicky dostupný transformovaný fotochemoterapeutický nano-proliečivo COS-BA/Ce6 NP kombináciou troch multifunkčných komponentov samostatne zostavenej prírodnej kyseliny betulínovej s malou molekulou. (BA), vo vode rozpustný COS a nízkotoxický fotosenzibilizátor Ce6 pre kombinovanú chemoterapiu/PDT. Následne spúšťa vysoko účinné a synergické protinádorové imunitné reakcie v kombinácii s anti-PD-L1 blokádou, buď s chemoterapiou samotnou alebo v kombinácii s chemoterapiou/PDT. Konkrétne sme ukázali, že molekulárne usporiadanie dutej siete môže uľahčiť tvorbu nanočastíc so štruktúrou obalu. Modifikácie vo vode rozpustného COS by mohli výrazne zvýšiť protirakovinovú aktivitu lipofilných prírodných malých molekúl vytvorením amfifilného proliečiva. Ukazujeme tiež, že výsledné nanoliečivá vykazovali viacero priaznivých terapeutických vlastností, najmä inteligentnú funkciu „dormance“ so zákernými účinkami chemoterapie. V kombinácii s výraznou citlivosťou na pH majú tieto spoločné zostavy nízku toxicitu a biologickú bezpečnosť s normálnym tkanivom, ale sú vysoko toxické pre nádorové tkanivá. Spolu so zlepšenou 1 generáciou O2, dobrou biologickou odbúrateľnosťou a biokompatibilitou, to všetko prispelo k vysoko účinnej, synergickej a bezpečnej protirakovinovej chemoterapii/PDT/imunoterapii. Najmä individuálna chemoterapia bez liečby PDT môže aktivovať systémové protinádorové imunitné reakcie, čím sa otvárajú atraktívne možnosti pre klinicky synergickú imunoterapiu protirakovinovou chemoterapiou. Celkovo táto práca poskytuje sľubný pohľad na vývoj prírodných multifunkčných vysoko bioaktívnych a nízko toxických nanoimunostimulantov pre klinickú imunoterapiu.

Referencie

1. Sang W, Zhang Z, Dai YL, Chen XY. Nedávne pokroky v synergickej kombinovanej imunoterapii rakoviny na báze nanomateriálov. Chem Soc Rev 2019;48:3771e810.

2. Li XY, Guo XM, Ling JB, Tang Z, Huang GN, He LZ a kol. Imunoterapie rakoviny založené na nanomedicíne vyvinuté preprogramovaním makrofágov spojených s nádorom. Nanoškála 2021;13:4705e27.

3. Chao Y, Xu LG, Liang C, Feng LZ, Xu J, Dong ZL a kol. Kombinovaná lokálna imunostimulačná rádioizotopová terapia a systémová blokáda imunitných kontrolných bodov poskytujú silné protinádorové reakcie. Nat Biomed Eng 2018; 2: 611e21.

4. Wen YY, Chen X, Zhu XF, Gong YC, Yuan GL, Qin XY a kol. Fototermálno-chemoterapeutické integrované nanočastice s reakciou mikroprostredia nádoru zvýšili indukciu imunogénnej bunkovej smrti pre účinnú liečbu kolorektálneho karcinómu. ACS Appl Mater Interfaces 2019;11:43393e408.

5. Peng JR, Xiao Y, Yang Q, Liu QY, Chen Y, Shi K a kol. Intracelulárna agregácia peptidovo preprogramovaných nanozostáv malých molekúl zvyšuje chemoterapiu rakoviny a kombinatorickú imunoterapiu. Acta Pharm Sin B 2021;11:1069e82.

6. Song W, Kuang J, Li CX, Zhang MK, Zheng DW, Zeng X a kol. Posilnená imunoterapia založená na fotodynamickej terapii na eradikáciu primárneho nádoru aj metastáz v pľúcach. ACS Nano 2018;12: 1978e89.

7. Wang C, Xu LG, Liang C, Xiang J, Peng R, Liu Z. Imunologické reakcie spustené fototermálnou terapiou uhlíkovými nanorúrkami v kombinácii s anti-CTLA-4 terapiou na inhibíciu metastáz rakoviny. Adv Mater 2014;26:8154e62.

8. He CB, Duan XP, Guo NN, Chan C, Poon C, Weichselbaum RR a kol. Koordinačné polyméry v nanoúrovni jadra a plášťa kombinujú chemoterapiu a fotodynamickú terapiu na zosilnenie blokády kontrolných bodov imunoterapie rakoviny. Nat Commun 2016;7:12499.

9. Galluzzi L, Buque A, Kepp O, Zitvogel L, Kroemer G. Imunogénna bunková smrť pri rakovine a infekčných chorobách. Nat Rev Immunol 2017;17: 97e111.

10. Chiang CS, Lin YJ, Lee R, Lai YH, Cheng HW, Hsieh CH a kol. Kombinácia magnetických nanočastíc na báze fukoidánu a imunomodulátorov zvyšuje imunoterapiu lokalizovanú v nádore. Nat Nanotechnol 2018;13:746e54.

11. Zheng XL, Ge JC, Wu JS, Liu WM, Guo L, Jia QY a kol. Biologicky odbúrateľné nanovezikuly hypokretínového derivátu ako teranostika poháňaná blízkym infračerveným svetlom pre duálne fotoaktívne zobrazovanie a terapiu rakoviny. Biomateriály 2018;185:133e41.

12. Spicer CD, Jumeaux C, Gupta B, Stevens MM. Peptidové a proteínové nanočastice konjugujú všestranné platformy pre biomedicínske aplikácie. Chem Soc Rev 2018;47:3574e620.

13. Mei YL, Wang RB, Jiang W, Bo Y, Zhang TF, Yu JL a kol. Nedávny pokrok v nanomateriáloch na dodávanie nukleových kyselín v imunoterapii rakoviny. Biomater Sci 2019;7:2640e51.

14. Zheng YL, Ye JX, Li ZY, Chen HJ, Gao Y. Nedávny pokrok v sono fotodynamickej terapii rakoviny: od vyvinutých nových senzibilizátorov k stratégiám zvyšovania účinnosti založeným na nanotechnológiách. Acta Pharm Sin B 2021;11:2197e219.

15. Li SK, Zou QL, Li YX, Yuan CQ, Xing RR, Yan XH. Inteligentné supramolekulárne fotodynamické metalo-nano liečivá na báze peptidov navrhnuté pomocou viaczložkového koordinačného samozostavenia. J Am Chem Soc 2018; 140:10794e802.

16. Zhi KK, Wang JC, Zhao HT, Yang X. Samozostavený gél z prírodných produktov s malými molekulami na podávanie liekov: prelom v novej aplikácii prírodných produktov s malými molekulami. Acta Pharm Sin B 2020;10: 913e27.

17. Yang X, Ma C, Chen ZM, Liu J, Liu FY, Xie RB a kol. Jedna malá molekula zostavená nanočastice sprostredkuje účinné orálne podávanie liečiva. Nano Res 2019;12:2468e76.

18. Zhi KK, Zhao HT, Yang X, Zhang H, Wang JC, Wang J a kol. Gelátory prírodných produktov a všeobecný spôsob ich získavania z organizmov. Nanoškála 2018;10:3639e43.

19. Cheng JJ, Fu SY, Qin Z, Han Y, Yang X. Samoorganizované prírodné diterpénové kyseliny s malou molekulou s priaznivou protirakovinovou aktivitou a biologickou bezpečnosťou pre synergicky posilnenú protinádorovú chemoterapiu. J Mater Chem B 2021;9:2674e87.

20. Wang JC, Zhao HT, Zhi KK, Yang X. Skúmanie prirodzeného procesu zavádzania liečiv s malou molekulou a vysoko účinnej synergickej protinádorovej účinnosti. ACS Appl Mater Interfaces 2020;12:6827e39.

21. Cheng JJ, Zhao HT, Yao L, Li Y, Qi BK, Wang J a kol. Jednoduché a multifunkčné prírodné samozostavené steroly so supramolekulárnymi fotosenzibilizátormi sprostredkovanými protirakovinovou aktivitou pre zvýšenú protinádorovú fotodynamickú terapiu. ACS Appl Mater Interfaces 2019;11: 29498e511.

22. Cheng JJ, Zhao HT, Wang JC, Han Y, Yang X. Bioaktívne prírodné malé molekuly vyladené spoločné zostavenie fotosenzitívnych liečiv pre vysoko účinnú synergickú a posilnenú fotochemoterapiu typu I. ACS Appl Mater Interfaces 2020;12:43488e500.

23. Wang JC, Zhao HT, Qiao WS, Cheng JJ, Han Y, Yang X. Nanomedicína-cum-nosič spoločnou montážou prírodných malých produktov pre synergicky zosilnené protinádorové účinky s ochranou tkanív. ACS Appl Mater Interfaces 2020;12:42537e50.

24. Xi JC, Liu HP. Nedávne pokroky v dizajne amfifilných liekov a vakcín s vlastným podávaním. Adv Ther 2019;3:1900107.

25. Zhang RS, Qin XF, Kong FD, Chen PW, Pan GJ. Zlepšenie bunkového príjmu terapeutických entít prostredníctvom interakcie so zložkami bunkovej membrány. Drug Deliv 2019;26:328e42.

26. Pujals S, Giralt E. Amfipatické peptidy prenikajúce do buniek bohaté na prolín. Adv Drug Deliv Rev 2008;60:473e84.

27. Karimi M, Ghasemi A, Sahandi Zangabad P, Rahighi R, Moosavi Basri SM, Mirshekari H a kol. Inteligentné mikro/nanočastice v systémoch dodávania liekov/génov reagujúcich na stimuly. Chem Soc Rev 2016;45: 1457e501.

28. Cheng JJ, Li XY, Wang S, Han Y, Zhao HT, Yang X. Triterpénové proliečivá bez nosiča s glutatiónovou odpoveďou a biologickou bezpečnosťou pre synergicky posilnenú fotochemoterapiu. ACS Appl Mater Interfaces 2021;13:245e56.

29. Li XS, Lee SY, Yoon J. Supramolekulárne fotosenzibilizátory omladzujú fotodynamickú terapiu. Chem Soc Rev 2018;47:1174e88.

30. Zou P, Yuan SJ, Yang X, Guo YZ, Li LN, Xu CW a kol. Štrukturálna charakterizácia a protinádorové účinky chitosanových oligosacharidov proti ortotopickému nádoru pečene prostredníctvom NF-kB signálnej dráhy. J Funct Foods 2019;57:157e65.

31. Zhai XC, Yuan SJ, Yang X, Zou P, Li NL, Li GY a kol. Chitosanové oligosacharidy indukujú apoptózu v ľudskom renálnom karcinóme prostredníctvom stresu endoplazmatického retikula závislého od druhu reaktívneho kyslíka. J Agric Food Chem 2019;67:1691e701.

32. Deng G, Ma C, Zhao HT, Zhang SQ, Liu J, Liu FY a kol. Protiedémová a antioxidačná kombinovaná liečba ischemickej cievnej mozgovej príhody prostredníctvom nanočastíc kyseliny betulínovej s obsahom glyburidu. Teranostika 2019;9: 6991e7002.

33. Liu K, Xing RR, Zou QL, Ma GH, Mo¨hwald H, Yan XH. Jednoduché peptidovo ladené samozostavenie fotosenzibilizátorov smerom k protirakovinovej fotodynamickej terapii. Angew Chem Int Ed Engl 2016;55:3036e9.

34. Li Y, Lin JY, Wang PY, Luo Q, Lin HR, Zhang Y a kol. Nanoliečivo inšpirované vírusom na mikroprostredie reagujúce na tvar s reverzným priebehom pre fototermálnu chemoterapiu v blízkosti infračerveného žiarenia II riadenú zobrazovaním. ACS Nano 2019;13:12912e28.

35. Sawada SI, Sato YT, Kawasaki R, Yasuoka JI, Mizuta R, Sasaki Y a kol. Nanogel hybridná zostava pre exozómové intracelulárne dodávanie: účinky na endocytózu a fúziu pomocou exozómového povrchového polymérového inžinierstva. Biomater Sci 2020;8:619e30.

36. Chou TC. Teoretický základ, experimentálny dizajn a počítačová simulácia synergizmu a antagonizmu v štúdiách kombinácií liekov. Pharmacol Rev 2006;58:621e81.

37. Zhao YP, Zhao YN, Ma QS, Sun B, Wang QP, Ding Z a kol. Beznosičové, dvojfunkčné nanorúdy prostredníctvom vlastného zostavenia čistých molekúl liečiva pre synergickú chemo-fotodynamickú terapiu. Int J Nanomed 2019;14:8665e83.

38. Ma X, Zhao YL. Biomedicínske aplikácie supramolekulárnych systémov založené na interakciách hostiteľ-hosť. Chem Rev 2015;115:7794e839.

39. Qin XH, Zhang MZ, Hu X, Du Q, Zhao ZP, Jiang Y a kol. Nanoinžinierstvo novo navrhnutého derivátu chlóru e6 pre amplifikovanú fotodynamickú terapiu prostredníctvom regulácie metabolizmu laktátu. Nanoškála 2021;13:11953e62.

40. Du Q, Qin XH, Zhang MZ, Zhao ZP, Li Q, Ren XM a kol. Mitochondriálnym metabolizmom regulovateľným nanoliečivom bez nosiča na zosilnenie citlivosti fototermálnej terapie. Chem Commun (Camb) 2021;57:8993e6.

41. Li XS, Yu S, Lee D, Kim G, Lee B, Cho Y a kol. Ľahký supramolekulárny prístup k aktivovateľnej nanoterapii riadenej nukleovými kyselinami, ktorý prekonáva nevýhody fotodynamickej terapie. ACS Nano 2018; 12:681e8.

2. Gilson RC, Black KC, Lane DD, Achilefu S. Hybridný TiO2-ruténiový nanofotosenzibilizátor synergicky produkuje reaktívne formy kyslíka v hypoxických aj normoxických podmienkach. Angew Chem Int Ed Engl 2017;56:10717e20.

43. Xu SD, Yuan YY, Cai XL, Zhang CJ, Hu F, Liang J a kol. Vyladenie singlet-tripletovej energetickej medzery: jedinečný prístup k účinným fotosenzibilizátorom s charakteristikami emisie indukovanej agregáciou (AIE). Chem Sci 2015;6:5824e30.

44. Wu WB, Mao D, Xu SD, Kenry, Hu F, Li XQ a kol. Polymerizáciou zosilnená fotosenzibilizácia. Chem 2018;4:1937e51.

45. Kundu PK, Samanta D, Leizrowice R, Margulis B, Zhao H, Bo¨rner M, et al. Svetlom riadené samozostavenie nefotoresponzívnych nanočastíc. Nat Chem 2015;7:646e52.

46. ​​Miyazaki M, Yuba E, Hayashi H, Harada A, Kono K. pH-senzitívne polymérom modifikované lipozómy na báze kyseliny hyalurónovej pre bunkovo ​​špecifické intracelulárne systémy dodávania liečiv. Bioconjug Chem 2018;29:44e55.

47. Zhang JY, Liu ZN, Lian P, Qian J, Li XW, Wang L a kol. Selektívne zobrazovanie a smrť rakovinových buniek prostredníctvom prepínateľnej pH blízkej infračervenej fluorescencie a fototermálnych účinkov. Chem Sci 2016;7:5995e6005.

48. Cheng JJ, Tan GH, Li WT, Zhang HY, Wu XD, Wang ZQ a kol. Ľahká syntéza multifunkčných magnetických Fe3O4@ SiO2@CS@pyrofeoforbid-a fluorescenčných nanočastíc za pomoci chitosanu pre fotodynamickú terapiu. New J Chem 2016;40:8522e34.

49. Cheng JJ, Wang S, Zhao HT, Liu Y, Yang X. Skúmanie mechanizmu samozostavovania a účinnej synergickej protinádorovej chemofototerapie biodegradovateľného a na glutatión reagujúceho fotosenzitívneho nanoliečiva sprostredkovaného kyselinou ursolovou. Biomater Sci 2021;9: 3762e75.

50. Yang Y, Xu J, Sun Y, Mo LT, Liu B, Pan XS a kol. Logická výpočtová reakcia založená na aptaméri na živých bunkách na umožnenie terapie blokádou imunitného kontrolného bodu bez protilátok. J Am Chem Soc 2021; 143: 8391e401.

51. Kuai R, Yuan WM, Son SJ, Nam J, Xu Y, Fan YC a kol. Eliminácia etablovaných nádorov kombinovanou chemoimunoterapiou na báze nanodiskov. Sci Adv 2018;4:eaao1736.

52. Lesniak WG, Chatterjee S, Gabrielson M, Lisok A, Wharram B, Pomper MG a kol. Detekcia PD-L1 v nádoroch pomocou [(64)Cu]atezolizumabu s PET. Bioconjug Chem 2016;27:2103e10.

53. Sagiv-Barfi I, Kohrt HEK, Czerwinski DK, Ng PP, Chang BY, Levy R. Terapeutickú protinádorovú imunitu blokádou kontrolných bodov zvyšuje ibrutinib, inhibítor BTK aj ITK. Proc Natl Acad Sci USA 2015;112:E966e72.

54. Liang C, Chao Y, Yi X, Xu J, Feng LZ, Zhao Q a kol. Vnútorná rádioizotopová terapia sprostredkovaná nanočasticami na lokálne zvýšenie priepustnosti vaskulatúry nádoru pre synergicky zlepšené terapie rakoviny. Biomateriály 2019;197:368e79.