Konzervovaný sekrečný proteín bohatý na cysteín MaCFEM85 interaguje s MsWAK16 a aktivuje obranyschopnosť rastlín
Oct 26, 2023
Abstrakt: Metarhizium anisopliaeje entomopatogénna huba, ktorá môže zvýšiť rast a odolnosť rastlín, keď pôsobí ako endofyt v hostiteľských rastlinách. O proteínových interakciách alebo ich aktivačných mechanizmoch je však známe len málo. Bežné v proteínoch fungálnej extracelulárnej membrány (CFEM) boli identifikované ako rastlinné imunitné regulátory, ktoré potláčajú alebo aktivujú reakcie rezistencie rastlín. Tu sme identifikovali proteín obsahujúci doménu CFEM, MaCFEM85, ktorý bol lokalizovaný hlavne v plazmatickej membráne. Kvasinkové dvojhybridné (Y2H), sťahovanie glutatión-S-transferázy (GST) a bimolekulárne fluorescenčné komplementačné testy preukázali, že MaCFEM85 interagoval s extracelulárnou doménouMedicago sativa(alfalfa) membránový proteín, MsWAK16. Analýzy génovej expresie ukázali, že MaCFEM85 a MsWAK16 boli významne upregulovanéM. anisopliaeaM. sativaod 12 do 60 hodín po spoločnej inokulácii. Ďalšie kvasinkové dvojhybridné testy a aminokyselinová miestne špecifická mutácia ukázali, že doména CFEM a 52. cysteín boli špecificky potrebné na interakciu MaCFEM85 s MsWAK16. Testy obrannej funkcie ukázali, že JA bola up-regulovaná, ale veľkosť lézie Botrytis cinerea a reprodukcia Myzus persicae boli potlačené prechodnou expresiou MaCFEM85 a MsWAK16 v modelovej hostiteľskej rastline Nicotiana benthamiana. Súhrnne tieto výsledky poskytujú nový pohľad na molekulárne mechanizmy, ktoré sú základom interakcií M. anisopliae s hostiteľskými rastlinami.
výhody doplnku cistanche-zvýšenie imunity
Kľúčové slová: wall-associated kinase; CFEM; Metahizium anisopliae; imunita rastlín; Medicago sativa
1. Úvod
Interakcie medzi rastlinami a mikróbmi sú rozšírené a sú výsledkom minulej a prebiehajúcej spoločnej evolúcie. Tieto interakcie môžu mať pre každého účastníka buď prospešné, neutrálne alebo nepriaznivé výsledky [1–3]. Užitočná rizosférická mikroflóra môže zvýšiť rast rastlín a zlepšiť celkové zdravie tým, že chráni pred chorobami prenášanými pôdou alebo zvyšuje príjem živín [4,5]. Široká škála prospešných mikróbov môže zlepšiť schopnosti rastlín, ako je príjem živín, rast a ochrana proti patogénom a hmyzu [6,7]. Metarhizium Sorok¯ın je dôležitý rod entomopatogénnych húb so schopnosťou kolonizovať rastliny [8], existujú však dôkazy, ktoré naznačujú, že členovia tohto rodu môžu zvyšovať odolnosť rastlín voči patogénom. Napríklad laboratórna štúdia zistila 60 % inhibíciu Fusarium solani (Mart.) Sacc. v prítomnosti Metarhizium robertsii (predtým známeho ako M. anisopliae) v porovnaní s kontrolami bez M. robertsii [9]. Niektoré kmene Metarhizium majú potenciál zlepšiť odolnosť rastlín voči hmyzím škodcom a chorobám zmenou expresie rastlinných obranných génov. Endofytická kolonizácia s M. Robertsom aktivuje expresiu oboch obranných dráh kyseliny jazmónovej (JA) a kyseliny salicylovej (SA) v listoch kukurice; okrem toho je takáto kolonizácia spojená s podporou rastu rastlín a potlačením vývoja lariev Agrotis epsilon (Hufnagel) [10]. Metarhizium guizhouense aktivovalo -1,3-glukanázu a chitinázu v šupke ovocia Lansium parasiticum, čo viedlo k inhibícii rastu Botrytis sp. a Fusarium sp. na plodoch Aglaia dookkoo Griff [11]. Navyše, keď bola M. anisopliae aplikovaná na sadenice arašidov, aktivovali sa rôzne transkripčné faktory vrátane WRKY, MYC, TGA a transkripčných faktorov reagujúcich na etylén, zatiaľ čo transportéry dusičnanov a proteíny viažuce prvky reagujúce na dehydratáciu boli tiež rozdielne exprimované [12]. . To naznačuje, že M. anisopliae reguluje rastlinné obranné gény, keď kolonizuje rastlinu. Relatívne málo je však známe o mechanizmoch, ktoré sú základom obranných reakcií rastlín po infekcii Metarhizium. Efektory sú bežným prostriedkom, ktorým mikroorganizmy regulujú odolnosť rastlín [13]. Aktivácia rezistencie rastlín je zvyčajne charakterizovaná oxidačným vzplanutím a indukciou hormónov, metabolitov a iných signálov [13]. Rastlinné hormóny SA a JA hrajú dôležitú úlohu pri indukcii rezistencie rastlín, pričom sprostredkujú dve samostatné obranné signálne dráhy [14]. SA signálna dráha primárne funguje pri alergickej reakcii rastlín a pri systémovej získanej rezistencii voči patogénom, ale môže sa podieľať aj na nepriamych obranných reakciách rastlín vyvolaných kŕmením bodavým hmyzom [15]. Akumulácia SA je spojená so zvýšenou expresiou génov kódujúcich proteíny prenosu lipidov (LTP) a fenylalanín amonia-lyázu (PAL) [16], ktoré sprostredkovávajú syntézu a akumuláciu následných špecializovaných metabolitov, ako sú flavonoidy a lignín [17]. Signálna dráha JA funguje v priamych a nepriamych reakciách na mechanické poškodenie, plesňové patogény a hmyzích škodcov. Štúdie ukázali, že JA signalizácia má regulačný účinok na syntézu špecializovaných metabolitov, ako sú terpenoidy, fenylpropanoidy a alkaloidy, ktoré majú široké spektrum biologických funkcií [18]. Ukázalo sa, že niektoré špecializované metabolity sa po ošetrení metylJA (MeJA) akumulujú v rastlinných bunkách, vrátane paklitaxelu v druhoch Taxus [19,20], terpenoidov v Centella Asiatica (L.) Urban [21] a saponínov v ženšene [22]. . Aplikácia SA a chitosanu (CHT) ako elicitorov vyvolala akumuláciu lignínu a obranné enzýmové reakcie v paradajkách, čo znížilo výskyt infekcie Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi [23]. Okrem toho sa hladiny JA a SA v pšenici významne akumulovali aplikáciou elicitoru PeaT, čím sa zosilnila obranná odpoveď na vošku ovsenú Sitobion avenae (Fabricius) [24]. To naznačuje, že imunita rastlín by mohla byť regulovaná týmito efektormi prostredníctvom rastlinných hormónov a metabolitov.
cistanche tubulosa - zlepšenie imunitného systému
Bežné proteíny v extracelulárnej membráne húb (CFEM) sú prítomné v širokom spektre húb. Kódujú domény, ktoré sú zvyčajne dlhé 60 aminokyselín (aa) a obsahujú osem charakteristicky rozmiestnených cysteínov [25]. Domény CFEM sú podobné doménam podobným epidermálnemu rastovému faktoru (EGF), ktoré fungujú ako extracelulárne receptory, prevodníky signálu alebo adhézne molekuly pri interakciách medzi hostiteľom a patogénom [26]. Proteíny obsahujúce domény CFEM môžu manipulovať s reakciou rezistencie rastlín tým, že pôsobia ako efektory. V hube hrdze pšeničnej Puccinia triticina Erikas kandidát CFEM efektora PTTG_08198 urýchlil postup bunkovej smrti a podporil akumuláciu reaktívnych foriem kyslíka (ROS) [27]. Antraknózová huba Colletotrichum graminicola (Ces.) GW Wils obsahuje päť efektorov (CgCFEM6, 7, 8, 9 a 15), u ktorých bolo preukázané, že potláčajú BAX-indukovanú programovanú bunkovú smrť u Nicotiana benthamiana Domin [28]. Uvádza sa, že fytosymbiotická mykorízna huba Laccaria bicolor (Maire) PDOrton vylučuje niekoľko proteínov CFEM, ako napríklad Lac310796, Lac296573 a Lac296572, v symbiotických tkanivách [29]. Hoci komplexné funkcie týchto proteínov neboli ďalej študované v mykorhizálnej symbióze, predchádzajúce výsledky naznačujú, že proteíny CFEM môžu fungovať pri signalizácii medzi hubami a rastlinami. M. anisopliae môže v hostiteľskej rastline fungovať ako entomopatogénna alebo endofytická huba [30]. Úloha proteínov CFEM však ešte nebola opísaná. Predtým sme identifikovali proteín obsahujúci doménu CFEM v M. anisopliae, MaCFEM85 (GenBank ID: MZ682609) [31]. Tu uvádzame vzťah medzi MaCFEM85 a kinázou MsWAK16 spojenou so stenou Medicago sativa. Analyzovali sme sekvenciu MaCFEM85 a uskutočnili sme experimenty, aby sme určili, ktoré zvyšky sú kritické pre interakciu s MsWAK16. Nakoniec sme pomocou N. benthamiana ako našej modelovej rastliny vyhodnotili obranné reakcie rastlín na Botrytis cinerea a vošku Myzus persicae s prechodnou expresiou MaCFEM85 a MsWAK16 a bez nej.
Výhody cistanche tubulosa-posilnenie imunitného systému
Kliknite sem pre zobrazenie produktov Cistanche Enhance Immunity
【Požiadať o viac】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
2. Výsledky
2.1. MaCFEM85 bol najužšie spojený s nepatogénnymi hubovými CFEM a lokalizovaný v plazmovej membráne
Fylogenetický strom bol vytvorený na analýzu vzťahov medzi MaCFEM85 a inými CFEM proteínmi z patogénnych a nepatogénnych modelových húb. Patrili sem Magnaporthe oryzae, Fusarium oxysporum (Schl)., Neurospora crassa Shear & BODodge a Beauveria bassiana (Bals.) (pozri časť 4). MaCFEM85 bol najužšie príbuzný s CFEM proteínmi v B. bassiana, a preto bol evolučne bližšie k nepatogénnym ako k patogénnym hubám (obrázok 1a).
Obrázok 1a
2.2. MaCFEM85 bol upregulovaný počas interakcií s M. sativa
Receptorové kinázy spojené so stenou (WAK) predstavujú podskupinu v rámci nadrodiny receptorových proteínových kináz (RLK) a zahŕňajú extracelulárnu doménu, transmembránový helix a intracelulárnu kinázovú doménu. Hrajú dôležitú úlohu pri regulácii rastu, vývoja rastlín, stresovej reakcie a signálnych dráh rezistencie patogénov [32]. RNA sa extrahovala z hýf M. anisopliae a koreňov M. sativa po spoločnej inkubácii, aby sa preskúmali vzorce expresie MaCFEM85 a MsWAK16. MaCFEM85 aj MsWAK16 boli exprimované vo výrazne vyšších hladinách počas spoločnej inkubácie od 12 do 6 0} h (obrázok 1c, d). Od 0 do 36 hodín sa expresia MaCFEM85 postupne zvyšovala, pričom vrchol dosiahla po 36 hodinách. Bol x 593-krát viac exprimovaný v kombinácii M. anisopliae a M. sativa v porovnaní s M. anisopliae pestovanými samostatne. Hoci expresia MaCFEM85 bola mierne znížená v období 48–60 hodín, stále bola exprimovaná na výrazne vyšších úrovniach ako v M. anisopliae pestovanej samostatne. MsWAK16 bol tiež významne upregulovaný, pričom expresia vrcholila po 36 hodinách. V M. sativa infikovanej M. anisopliae bola MsWAK16 x 89,06-krát viac exprimovaná ako v M. sativa bez M. anisopliae. Od 36 do 60 hodín sa hladiny MsWAK16 mierne znížili, ale jeho expresia bola stále výrazne vyššia ako v nenaočkovaných rastlinách.
2.3. MaCFEM85 interaguje s MsWAK16 in vitro a in vivo
Aby sa preskúmal potenciálny funkčný mechanizmus MaCFEM85 v reakcii na ošetrenie M. anisopliae, uskutočnil sa kvasinkový dvojhybridný (Y2H) skríning, aby sa predbežne identifikovali hostiteľské proteíny, ktoré interagujú s MaCFEM85. Interakcia medzi extracelulárnou doménou MsWAK16 (MsWAK{5}}ED) a MaCFEM85 sa skúmala kvasinkovým dvojhybridným testom jedna ku jednej s použitím MaCFEM85 v pGBKT7 ako BD vektora a MsWAK16 v pGADT7 ako AD vektora. Všetky transformované kvasinky dobre rástli na SD-T/L deficientnom médiu a pozitívna kontrolná skupina a experimentálna skupina rástli úspešne na SD-T/L/H/A + X- -gal deficientnom médiu. To naznačuje, že MaCFEM85 môže interagovať s MsWAK16-ED (obrázok 2a).
Obrázok 2. Validácia interakcie medzi MaCFEM85 a MsWAK16.
Na overenie in vitro sa do pGEX6-P2 vložil glutatión-S-transferázou (GST) označený MsWAK16-ED (kódujúci produkt s veľkosťou 60 kDa) a polyhistidínový (His) označený MaCFEM85 ( kódujúci produkt s veľkosťou 17 kDa) bol vložený do pET-21b. Imunoblotting s protilátkami His a GST ukázal, že rekombinantný proteín MaCFEM85-His interagoval s korisťou GST-MsWAK16-ED, ale nie so samotnou GST, a že GST-MsWAK16- ED interagoval s His -MaCFEM85 (obrázok 2b). Na ďalšie potvrdenie interakcie medzi MaCFEM85 a MsWAK16 sme vykonali bimolekulárny fluorescenčný komplementačný test (BiFC) s konštruktmi MaCFEM85-YFPN a MsWAK16-YFPC. Spoločná expresia MaCFEM85-YFPN a MsWAK16-YFPC v tabakových listoch generovala žltý fluorescenčný signál, čo naznačuje, že MaCFEM85 interagoval s MsWAK16 (obrázok 2c).
2.4. Kľúčové stránky pre interakcie MaCFEM85 a MsWAK16
Na definovanie oblasti MaCFEM85, ktorá je potrebná na interakciu s MsWAK16-ED, boli proteínové domény predpovedané pomocou online softvéru SMART (obrázok 3a). MaCFEM85 obsahoval doménu CFEM v oblasti 19-86 aa. Bola tiež predpovedaná terciárna štruktúra (obrázok 3b). Osem cysteínov v tejto doméne viedlo k štyrom disulfidovým väzbám (CYS26 a CYS69, CYS30 a CYS64, CYS43 a CYS50 a CYS52 a CYS85), čím sa zachovala stabilita proteínu (obrázok 3b). Na overenie predpokladaného interakčného miesta (miest) v MaCFEM85 sa vytvorilo sedem mutovaných verzií proteínu a vložilo sa do pGBKT7 ako návnadové proteíny. Každý rekombinantný vektor bol kotransfekovaný s AD-MsWAK16-ED v kmeni Y2H Gold. Kmeň s mutovaným CYS52 nerástol na selektívnych médiách (obrázok 3c, vyznačený červenou), čo naznačuje, že CYS52 je potrebný na interakciu MaCFEM85 s MsWAK16-ED.
2.5. Interakcia MaCFEM85 s MsWAK16 aktivuje rastlinnú imunitnú odpoveď
2.5.1. Hodnotenie úlohy MaCFEM85 a MsWAK16 v odolnosti voči chorobám proti B. cinerea
Aby sme preskúmali možné zapojenie MaCFEM85 a MsWAK16 do obranných reakcií patogénov, skúmali sme, či nadmerná expresia MaCFEM85, MsWAK16 alebo MaCFEM85 a MsWAK16 môže poskytnúť zvýšenú odolnosť voči B. cinerea. Tieto vektory sme prechodne exprimovali v listoch N. benthamiana. Test Western blot ukázal, že MaCFEM85 a MsWAK16 boli exprimované v porovnateľných hladinách, keď boli exprimované samostatne alebo spoločne, čo ukazuje, že MaCFEM85 a MsWAK16 boli úspešne exprimované v tabaku (obrázok 4a). Testy choroby sa uskutočňovali aj s použitím N. benthamiana infiltrovaného MaCFEM85, MsWAK16, MaCFEM85+MsWAK16 alebo kontrolou GFP. Lézie boli významne menšie (o ~ 30 % 2 dni po inokulácii) na listoch infiltrovaných MaCFEM85, MsWAK16 alebo MaCFEM85+MsWAK16 v porovnaní s kontrolnými rastlinami (obrázok 4b). Tieto údaje ukazujú, že prechodná expresia MaCFEM85 v N. benthamiana poskytla zvýšenú rezistenciu voči B. cinerea a že MaCFEM85 a MsWAK16 pozitívne regulovali obrannú odpoveď proti B. cinerea.
Obrázok 3. Identifikácia miesta interakcie medzi MaCFEM5 a MsWAK16.
Obrázok 4. Vyvolanie rezistencie rastlín prechodnou expresiou MaCFEM85 a MsWAK16.
2.5.2. Hodnotenie úlohy MaCFEM85 a MsWAK16 pri ochrane proti voškám u N. benthamiana
Na ďalšie skúmanie úlohy MaCFEM85 a MsWAK16 boli rastliny N. benthamiana prechodne exprimujúce MaCFEM85 a MsWAK16 zamorené M. persicae a populácie boli hodnotené. Pre tento experiment bola veľká plocha každého listu N. benthamiana agroinfiltrovaná rekombinantným binárnym vektorom pYBA1132 obsahujúcim MaCFEM85 a MsWAK16. Ako kontrola sa použil GFP. 12 hodín po infiltrácii boli 20 dospelé jedince M. persicae v klietkach na každý list, čím bola infiltrovaná oblasť vystavená voškám. V nasledujúcich troch dňoch bola zaznamenaná mortalita dospelých vošiek a počet nýmf; nymfy boli potom odstránené. Medzi populáciami M. persicae živiacimi sa rastlinami exprimujúcimi MaCFEM85, MsWAK16 alebo MaCFEM85+MsWAK16 (χ2=3.65827, DF=3, p < 0,30081) nebol žiadny významný rozdiel v riziku úmrtnosti ) (obrázok 4c). Avšak po 24, 48 a 72 hodinách bol priemerný počet potomstva produkovaného každou dospelou voškou významne vyšší na N. benthamiana exprimujúcej kontrolu GFP v porovnaní s tými, ktoré exprimovali MaCFEM85, MsWAK16 alebo MaCFEM85+MsWAK16 (obrázok 4d).
2.5.3. Hodnotenie úlohy MaCFEM85 a MsWAK16 pri akumulácii hormónov a expresii génov súvisiacich s hormónmi
Aby sme analyzovali rozdiely medzi obrannými odpoveďami rastlín N. benthamiana exprimujúcich eGFP, MaCFEM85, MsWAK16 a MaCFEM85+MsWAK16, merali sme hladiny JA, SA a celkových flavonoidov a expresiu súvisiacich génov. Výsledky ukázali, že hladiny JA a SA sa líšili medzi rastlinami exprimujúcimi eGFP, MaCFEM85, MsWAK16 a MaCFEM85+MsWAK16 (obrázok 5a). V porovnaní s tými, ktoré exprimujú eGFP, boli hladiny JA významne nižšie v rastlinách exprimujúcich MaCFEM85; Hladiny SA boli mierne zvýšené, ale rozdiely neboli významné. Na rozdiel od toho rastliny exprimujúce MsWAK16 nevykazovali žiadne významné rozdiely v hladinách JA v porovnaní s kontrolou eGFP, zatiaľ čo hladiny SA boli významne nižšie ako v kontrole (obrázok 5a). Hladiny JA a SA sa významne zvýšili a znížili v rastlinách exprimujúcich MaCFEM85+MsWAK16 v porovnaní s eGFP.
Obrázok 5. Hladiny hormónov a expresia génu hormonálnej odozvy
Celkový obsah flavonoidov bol významne vyšší v rastlinách exprimujúcich MaCFEM85+MsWAK16 v porovnaní so všetkými ostatnými liečenými skupinami (obrázok 5a). Úrovne expresie biosyntetických génov boli podobné v rastlinách exprimujúcich MsWAK16 a MaCFEM85+MsWAK16. Napríklad gény súvisiace s odpoveďou JA, menovite COI1, MYC2 a PDF1.2, boli významne upregulované v porovnaní s rastlinami exprimujúcimi GFP (obrázok 5b). Podobne gény NPR1, WRKY70 a PR1 súvisiace so SA boli významne rozdielne exprimované v rastlinách exprimujúcich MsWAK16 a MaCFEM85+MsWAK16; NPR1 bol upregulovaný, zatiaľ čo WRKY70 a PR1 boli downregulované v porovnaní s kontrolou (obrázok 5b). Tiež sme skúmali expresiu kľúčových génov v dráhach syntézy kyseliny šikimovej a fenylpropanoidov, ktoré obe súvisia so syntézou flavonoidov. Vo všeobecnosti expresia samotného MaCFEM85 neindukovala významne vyššiu expresiu týchto génov v tabaku. Tieto gény však boli upregulované v tabaku exprimujúcom MsWAK16 alebo MsWAK16+MaCFEM85 v porovnaní s kontrolou GFP (obrázok 5c).
cistanche tubulosa - zlepšenie imunitného systému
3. Diskusia
3.1. Konzervovaný proteínový motív CFEM plní viaceré funkcie u druhov húb
Doména CFEM je jedinečná pre huby a bežne sa vyskytuje v proteínoch extracelulárnej membrány húb. Doména pochádza z najnovšieho spoločného predka Ascomycota a Basidiomycota [33]. Nedávny výskum ukázal, že CFEM proteíny v hubových patogénoch môžu pôsobiť ako rastlinné imunitné regulátory, čo spôsobuje potlačenie alebo aktiváciu imunity hostiteľskej rastliny v závislosti od typu infekcie [28,34,35]. Existuje len málo správ o proteínoch obsahujúcich doménu CFEM v M. anisopliae, iba v kontexte evolučného porovnania s inými hubami [36]. V tejto štúdii sme porovnávali CFEM proteíny M. anisopliae s inými známymi CFEM proteínmi v patogénnych aj nepatogénnych hubách. Potvrdili sme, že najbližší homológ MaCFEM85 je Cfem5 nájdený v Beauveria bassiana, jeden z 12 proteínov CFEM v tomto druhu (doplnkový obrázok S1). BbCfem5 je nevyhnutný na získavanie železa [37]. Navyše, na základe predpovedanej terciárnej štruktúry je doména CFEM v MaCFEM85 veľmi podobná proteínu povrchového antigénu 2 (CSA2) nájdenému v Candida albicans (CPRobin) Berkhout, v ktorom bolo 65 zvyškov (96 % sekvencie) modelovaných s 99,8 % spoľahlivosti [31]. Candida albicans je živočíšny patogén; CSA2 hrá dôležitú úlohu v raste a patogenite extrakciou hému z hemoglobínu a transportom hému z bunkovej steny do plazmy [38–40]. Predpokladáme, že MaCFEM85 sa môže podieľať na virulencii M. anisopliae hmyzích hostiteľov. Tieto kombinované funkcie MaCFEM85 pri patogénnej infekcii zvierat a aktivácii imunity rastlín robia z proteínu vzrušujúce budúce výskumné zameranie.
3.2. Disulfidové väzby sú dôležité štruktúry pre funkciu proteínov
Konformačná integrita proteínovej štruktúry priamo súvisí s jej schopnosťou fungovať. Disulfidové väzby tvorené cysteínovými pármi podporujú skladanie proteínov a konformačnú stabilitu a považujú sa za kľúčové miesta pre rozpoznávanie a väzbu špecifických receptorov alebo ligandov [41]. Napríklad prerušenie ktorejkoľvek z troch konzervovaných disulfidových väzieb v rastlinnom patogéne Cladosporium fulvum efektorového proteínu AVR4 vedie k citlivosti na proteázy a zníženej schopnosti viazať chitín [42]. V troch ďalších proteínoch C. fulvum (ECP1, ECP2 a ECP5) jednotlivé substitúcie alanínov za cysteíny tlmia hypersenzitívnu reakciu paradajok, čo naznačuje, že cysteíny sú rozhodujúce pre udržanie stability a aktivitu vyvolávajúcu hypersenzitívnu reakciu [43]. Navyše v zrelom proteíne MC69 Magnaporthe oryzae môže mutagenéza dvoch konzervovaných cysteínových zvyškov (Cys36 a Cys46) narušiť funkciu MC69 bez ovplyvnenia sekrécie, čo naznačuje dôležitosť disulfidovej väzby špecificky v patogenite MC69 [44]. Zdá sa, že doména CFEM je svojou veľkosťou a vzorom cysteínových zvyškov podobná doménam podobným EGF, ktoré obsahujú tri alebo štyri páry disulfidových väzieb. Proteíny EGF môžu fungovať ako receptory na bunkovom povrchu, prevodníky signálu alebo adhézne molekuly pri interakciách medzi hostiteľom a patogénom [45]. V tejto štúdii sme nielen zistili, že doména CFEM MaCFEM85 obsahovala osem konzervovaných cysteínov, ktoré tvorili štyri páry disulfidových väzieb (obrázok 3b), ale tiež sme potvrdili, že CFEM bola kritickou doménou pre interakciu medzi MaCFEM85 a MsWAK16. Okrem toho sme prostredníctvom miestne cielenej mutácie cysteínových zvyškov na alanín zistili, že cysteínový zvyšok v polohe 52 bol hlavným miestom potrebným na interakciu (obrázok 3c). Tieto výsledky poskytujú základ pre ďalšie štúdie fyziologických funkcií interakcie CFEM85 – WAK16.
3.3. Interakcia MaCFEM85 s MsWAK16 aktivovanou ochranou rastlín
Pri interakciách medzi mikroorganizmami a rastlinami sú obranné reakcie rastlín vo všeobecnosti aktivované mikrobiálnymi efektorovými proteínmi. Indukovaná obrana sa stáva dôležitým nástrojom v biologickej kontrole škodcov na podporu odolnosti. Proteíny CFEM boli identifikované ako efektory podieľajúce sa na regulácii aktivácie alebo inhibície imunity rastlín [28,46]. Existuje však nedostatok publikovaných výskumov, ktoré spájajú reguláciu týchto imunitných faktorov s ich špecifickými úlohami pri chorobách rastlín a odolnosti voči hmyzu. V tejto štúdii sme použili entomopatogénnu a endofytickú hubu, M. anisopliae, na identifikáciu interakcie medzi MaCFEM85 a kinázou spojenou s bunkovou stenou, MsWAK16, v M. sativa. Výsledky ukázali, že táto interakcia znížila pomer lézií po inokulácii B. cinerea (obrázok 4b) a znížila rýchlosť rastu populácie M. persicae (obrázok 4d), čo naznačuje, že interakcia medzi MaCFEM85 a MsWAK16 zvýšila odolnosť M. sativa voči voškám. Zmeny v hladinách JA, SA a etylénu (ET) možno použiť ako markery na vyhodnotenie indukcie rezistencie rastlín [47,48]. Tu sme demonštrovali, že MaCFEM85 interagoval s MsWAK16, aby ovplyvnil rezistenciu rastlín prostredníctvom hormonálnej regulácie a inhiboval rýchlosť reprodukcie M. persicae (obrázok 4d). Podobné štúdie boli hlásené už skôr. Napríklad sa ukázalo, že efektorový proteín Brevibacillus laterosporus PeBL1 indukuje akumuláciu JA a SA v paradajkách a znižuje rýchlosť rastu druhej a tretej generácie populácií M. persicae, ktoré sa živili týmito rastlinami. Okrem toho rastliny rajčiaka postriekané efektormi majú repelentný účinok na M. persicae [49]. Aplikácia elicitorového proteínu PeBC1 na fazuľu obyčajnú (Phaseolus vulgaris L.) vedie k výrazným a významným subletálnym účinkom na vošky broskyňové. Rastliny ošetrené PeBC1 vykazujú významnú upreguláciu génov súvisiacich s JA a SA [50]. Beauveria bassiana elicitor PeBb1 znižuje plodnosť M. persicae na tabaku a indukuje expresiu génov súvisiacich s JA a ET [51]. V tejto štúdii prechodná expresia MaCFEM85 a MsWAK16 v tabaku významne upregulovala gény COI1, MYC2 a PDF1.2 súvisiace s JA reakciou (obrázok 5b) a zvýšila obsah JA a celkového obsahu flavonoidov (obrázok 5a), čo bolo porovnateľné s výsledkami. v literatúre, ako je opísané vyššie. Nezistili sme však vysoké hladiny SA v tabaku 12 hodín po infiltrácii a rastliny prechodne exprimujúce MsWAK16 alebo MaCFEM85+MsWAK16 vykazovali významne znížené hladiny SA a downreguláciu génov zapojených do SA odpovede (obrázok 5a,b) . To ukázalo, že stimulácia rôznych rastlinných hormónov môže viesť nielen k synergickým aktivitám, ale aj k presluchom a spätnej väzbe, čo umožňuje rastlinám primerane reagovať na rôzne stimuly. V rastlinách boli predtým hlásené zvýšené hladiny JA, ale nízke hladiny SA. Napríklad v A. thaliana s defektom na akumuláciu SA boli hladiny JA 25-krát vyššie ako u divokého typu A. thaliana a aktivovali sa gény reagujúce na JA [52]. Bolo tiež hlásené, že niektoré baktérie môžu zvýšiť hladiny JA v rastlinách, aby inhibovali akumuláciu SA, čím sa zabráni škodám spôsobeným SA. Napríklad Pseudomonas syringae cieli na receptor COI1 prostredníctvom toxínu, koronatínu, ktorý negatívne reguluje dráhu JA [53]. To podporuje MYC2-indukovanú upreguláciu transkripčných faktorov ANAC019, ANAC055 a ANAC072 [54], inhibuje transkripciu ICS1 (kľúčový gén pre syntézu SA) a tým znižuje produkciu SA a signálnu transdukciu. V tejto štúdii interakcia medzi MaCFEM85 a MsWAK16 viedla k zvýšenej akumulácii JA a upregulácii génov reagujúcich na JA, ale k inhibícii akumulácie SA a transkripcie génov súvisiacich s SA. To naznačuje, že interakcia medzi MaCFEM85 a MsWAK16 indukovala JA, čím sa zlepšila odolnosť rastlín voči voškám.
U N. benthamiana prechodne exprimujúcich MaCFEM85 a MsWAK16 sa hladiny JA zvýšili a veľkosť lézií B. cinerea sa znížila (obrázok 4b), čo je v súlade s predchádzajúcimi štúdiami. JA sa podieľa na rezistencii rastlín voči hmyzu a nekrotrofným patogénom [52,55]. Ako nekrotrofický patogén bol B. cinerea inhibovaný akumuláciou JA a ET [56]. V A. thaliana ET-deficientnom mutante ein2-1 a JA-response mutant coi1-1 boli hladiny downstream obranného génu PDF1.2 významne znížené a citlivosť na B. cinerea bola zvýšená [ 57]. Zistili sme, že akumulácia JA a transkripcia génov súvisiacich s JA sa významne zvýšila u N. benthamiana prechodne exprimujúcich MaCFEM85 a MsWAK16, zatiaľ čo akumulácia SA a transkripcia génov súvisiacich so SA boli inhibované. Expresia MaCFEM85 a MsWAK16 tiež ukázala inhibičný účinok na B. cinerea. To naznačuje, že JA bola aktivovaná pomocou MaCFEM85 a MsWAK16 a zohrávala vedúcu úlohu v rezistencii rastlín voči B. cinerea.
4. Materiály a metódy
4.1. Plesňové kmene, rastlinné materiály a kultivačné metódy
Kmene izolátu Metarhizium anisopliae Ma 9 sa kultivovali na médiu zemiakovo-cukrový agar (PSA) (200 g extraktu zo lúpaných zemiakov uvareného vo vode, 20 g sacharózy a 15 g agaru/l). Čerstvý prášok sporangia sa zozbieral po 10 dňoch. Rastliny Nicotiana benthamiana boli pestované v umelej klimatickej komore s cyklom 14/10 h svetlo/tma (27/25 ◦C). Pre prechodnú génovú expresiu prostredníctvom transformácie sprostredkovanej Agrobacterium sa Agrobacterium tumefaciens kmeň GV3101 kultivoval v médiu Luria Broth (LB) (10 g tryptónu, 5 g kvasinkového extraktu a 10 g NaCl/l). Kvasinkový kmeň Gold (OE Biotech Co., Ltd., Shanghai, Čína) sa kultivoval na médiu s kvasinkovým extraktom peptón-dextróza (YPDA) (10 g kvasinkového extraktu, 20 g peptónu, 20 g glukózy a 0,03 g adenín hemisulfátu/1). Pre každý vektor a kmeň sa použili vhodné antibiotiká, menovite rifampín, kanamycín alebo ampicilín (25, 50 alebo 50 ug/ml). Kmene a plazmidy použité v tejto štúdii sú uvedené v doplnkovej tabuľke S1. Semená Medicago sativa sa povrchovo sterilizovali 75% etanolom počas 1 minúty, potom 50% NaClO (5,5%) počas 15 minút. Semená boli dôkladne premiešané a potom premyté v sterilnej vode trikrát po dobu 5 minút. Semená sa inkubovali pri 4 °C v tme počas 24 hodín, potom sa vyklíčili na platniach s 1% vodným agarom pri teplote miestnosti cez noc. Tri dni po vyklíčení sa vyvíjajúce sa semenáčiky preniesli na filtračný papier na 9- cm sterilné Petriho misky, s 20 semenáčkami na misku. Ošetrenia a kontrola boli pridelené do 15 misiek, v tomto poradí. Sadenice sa potom zaliali 10 ml suspenzie spór M. anisopliae s obsahom 107/ml a kontrola sa zaliala 10 ml sterilnej vody. V čase 0, 12, 24, 48 a 60 hodín sa pre každý časový interval odobral náhodný výber sadeníc z troch Petriho misiek. Vzorky boli zmrazené v tekutom dusíku a skladované pri -80 ◦C.
4.2. qRT-PCR a konštrukcia plazmidu
Celková RNA sa extrahovala z M. anisopliae (hýfy) a M. sativa (korene) pomocou činidla TRIzol (Invitrogen, CA, USA) podľa pokynov výrobcu. Kvalita a množstvo výslednej RNA sa merali pomocou NanoPhotometer® (Implen, Münich, Nemecko). Syntéza prvého vlákna cDNA (až 2 ug RNA) sa uskutočnila s použitím 5x All-In-One RT Master Mix (Applied Biological Materials Inc., Vancouver, BC, Kanada) podľa pokynov výrobcu. qRT-PCR sa uskutočnilo s použitím 2×SYBR Green qPCR Master Mix od US EVER BRIGHT ® INC. a systému ABI QuantStudio 5 podľa pokynov výrobcu. Priméry použité pre každý gén sú uvedené v doplnkovej tabuľke S2. Maury [58], Msactin [59] a Nbactin [60] boli použité ako interné referenčné gény na normalizáciu údajov o expresii. Reakcia sa uskutočnila za nasledujúcich podmienok: 5 minút pri 95 °C, nasledovalo 40 cyklov pri 95 °C počas 15 s a pri 60 °C počas 40 s. Pre každú vzorku boli tri technické replikáty. Relatívna expresia bola vypočítaná pomocou metódy 2−∆∆Ct [61]. Štatistická významnosť bola stanovená pomocou jednosmernej analýzy rozptylu (ANOVA) a Duncanovho viacrozsahového testu v SPSS v20.0 (SPSS).
4.3. Prechodná expresia proteínov v N. benthamiana
MaCFEM85 kódujúca sekvencia (CDS) bola amplifikovaná ultra-vernou DNA polymerázou s použitím cDNA ako templátu. Pre subcelulárne lokalizačné testy boli produkty PCR obsahujúce CDS pre MaCFEM85 klonované do pYBA1132-eGFP (štiepený EcoRI a SalI) a pcambia1300-čerešňa (EcoRI a SacI). Všetky konštrukty boli validované sekvenovaním (Tsingke Biotechnology Co., Ltd. Beijing, Čína). Priméry použité v tejto štúdii sú uvedené v doplnkovej tabuľke S2. Na prechodnú expresiu MaCFEM85-eGFP a MaCFEM85-mCherry v N. benthamiana bol kmeň A. tumefaciens GV31{20}}1 transformovaný každým plazmidom a overený pomocou PCR. Agrobacterium sa kultivovalo cez noc pri 28 °C za trepania. Bunky sa zhromaždili 5 minútovou centrifugáciou pri 5000 otáčkach za minútu pri teplote miestnosti, premyli sa trikrát sterilnou dvakrát destilovanou vodou a resuspendovali sa v 10 mM MgCl2 pufri (obsahujúcom 10 mM MES a 10 mM acetosyringónu, pH 5,7). Bunková suspenzia sa upravila na OD600 0,5, potom sa infiltrovala do spodnej strany 4- až 5-týždňových listov N. benthamiana pomocou 1-ml injekčnej striekačky. Každý list bol infiltrovaný 50 ul A. tumefaciens; boli ošetrené tri listy na rastlinu a tri rastliny boli v každej ošetrenej skupine. Ošetrené listy sa odobrali po 30 hodinách a vizualizovali sa konfokálnym mikroskopom Zeiss LSM980 (Carl Zeiss, Nemecko), aby sa určila subcelulárna lokalizácia.
cistanche výhody pre mužov-posilnenie imunitného systému
4.4. Fylogenetická analýza
Fylogenetický strom bol skonštruovaný pomocou metódy susedného spájania v MEGA X. 1000 bootstrap replikátov bolo s použitím P-dištančného modelu. Aminokyselinové sekvencie použité na vytvorenie stromu boli získané pomocou BLASTP prehľadávania v databáze NCBI príbuzných húb (napr. Magnaporthe oryzae, Botrytis cinerea, Fusarium graminearum, Colletotrichum graminicola, Fusarium oxysporum, Neurospora crassa, Aspergillus fumigaum theobrliomaplodae , Trichoderma harzianum, Beauveria bassiana a Paecilomyces lilacinus) pomocou MaCFEM85 ako dotazu.
4.5. Kvasinkové dvojhybridné testy
Na overenie interakcie medzi MaCFEM85 a MsWAK16 sa použil Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System (Clontech Laboratories, Inc.; teraz Takara Bio USA, Inc.). MaCFEM85 bez signálneho peptidu bol zavedený do pGBKT7 ako návnada a extracelulárna doména MsWAK16 (MsWAK16-ED) bola vložená do pGADT7 ako korisť. Príprava a transformácie buniek kompetentných pre kvasinky sa uskutočnili pomocou súpravy Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit™ (ZYMO Research, CA, USA) podľa pokynov výrobcu. Plazmidy návnady a koristi boli kotransformované do kvasinkového kmeňa Gold. Interakcie proteín-proteín sa analyzovali na základe rastu na platniach SD s dvojitým odpadovým médiom (DDO, SD/-Trp-Leu) a SD štvornásobným odpadovým médiom (QDO, SD/-Trp-Leu-His-Ade).
4.6. BiFC test
Na vytvorenie konštruktov BiFC boli vektory pUC-SPYNE a pUC-SPYCE linearizované štiepením s BamHI. CDS plnej dĺžky MaCFEM85 a MsWAK16 boli klonované a vložené do linearizovaných plazmidov pomocou rekombinantného enzýmu, aby sa získali konštrukty MaCFEM85-YFPN a MsWAK16-YFPC. Plazmidy obsahujúce MaCFEM85 a MsWAK16 boli kotransformované s prázdnymi vektormi ako negatívnymi kontrolami (MaCFEM85-YFPN + pUC-SPYCE, MsWAK16-YFPC + pUC-SPYNE a pUC-SPYNE + pUC-SPYCE) . Všetky vektory boli zavedené do N. benthamiana prostredníctvom transformácie sprostredkovanej Agrobacterium, ako je opísané vyššie. Fluorescenčné signály sa pozorovali v epidermálnych bunkách listov pomocou konfokálneho mikroskopu Zeiss LSM980 (Carl Zeiss, Nemecko). Priméry použité na konštrukciu vektora sú uvedené v doplnkovej tabuľke S2.
4.7. GST Pull-Down Assay
Pre GST pull-down testy sa MsWAK16-ED vložil do pGEX-6P-2 vektora a MaCFEM85 sa vložil do pET-21b. Purifikované fúzne proteíny (GST-MsWAK16- ED) a pGEX-6P-2 proteín bez zaťaženia (GST) sa použili ako návnadový proteín a purifikovaný pET-21 Ako korisť sa použil fúzny proteín b-MaCFEM85 (His-MaCFEM85). GST pulldown testy sa uskutočnili s Mag-Beads GST Fusion proteínovým purifikačným systémom (Sangon Biotech, Shanghai, Čína) podľa inštrukcií výrobcu. Stručne, Mag-Beads sa päťkrát premyli 1 x fyziologickým roztokom pufrovaným fosfátom (PBS, pH 7,4), aby sa uvoľnil alkoholový chránič, a potom sa pridalo 10 ml GST alebo GST-MsWAK{24}}ED. Guľôčky sa miešali prevracaním pri teplote miestnosti počas 30 minút. Po odstránení supernatantu boli Mag-Beads päťkrát premyté 1 x PBS. His-MaCFEM85 sa pridal k Mag-Beads už naviazaným GST a zmes sa inkubovala cez noc pri 4 °C s rotáciou. Guľôčky sa potom päťkrát premyli 1 x PBS, aby sa odstránili nenaviazané proteíny. Následne boli proteíny imobilizované na guľôčkach oddelené pomocou SDS-PAGE, prenesené na nitrocelulózovú membránu (100 V, 1 h) a analyzované pomocou Western blotu. Membrány sa premyli trikrát počas 10 minút s PBS + Tween (PBST). Membrány sa blokovali 2 hodiny pri teplote miestnosti 5 % odstredeným mliekom, potom sa inkubovali s myšou monoklonálnou protilátkou ProteinFind anti-His (TransGen Biotech, Peking, Čína) (zriedená 1:3000) alebo myšou monoklonálnou protilátkou ProteinFind anti-GST počas 2 rokov. h pri 4 ◦C. Membrány sa potom ponorili do ProteinFind kozej anti-králičej IgG(H+L) (HRP) protilátky (TransGen Biotech, Peking, Čína) (zriedené 1:5000) na 1 hodinu pri teplote miestnosti. Membrány sa vizualizovali pomocou súpravy EasySee® Western Blot Kit (TransGen Biotech, Peking, Čína) podľa pokynov výrobcu.
4.8. Identifikácia kľúčového miesta v MaCFEM85
Aby sa určila veľkosť potrebná na interakciu MaCFEM85 s MsWAK16, uskutočnila sa PCR amplifikácia na vytvorenie viacerých skrátených foriem MaCFEM85. Do vektora boli vložené doména CFEM (MaCFEM85-CFEM; aa zvyšky 19–86) a C terminál bez domény CFEM (MaCFEM85-C, aa zvyšky 87–170). pGBKT7 ako návnadový proteín (doplnková tabuľka S1). Ďalších päť variantov bolo skonštruovaných pomocou syntézy polypeptidov na mutáciu cysteínu na alanín v pozíciách 26, 30, 43, 52 a 26/30/43/50/52/64/69/85 (∆CFEM8526, ∆CFEM8530, ∆CFEM∆43, CFEM∆854 CFEM8552, respektíve ∆CFEM858). Tieto varianty sa použili na uskutočnenie experimentov Y2H s MsWAK16-ED. Transformované kvasinkové bunky sa testovali na rast na syntetických vypadnutých SD/-Trp-Leu platniach a SD/-Trp-Leu-His-Ade platniach obsahujúcich X- -galaktozidázu (X- -Gal).
4.9. Testy odolnosti rastlín
Myzus persicae sa získali od Henan Quanying Biological Co., Ltd. Týždeň pred začiatkom biologických testov sa 150 dospelých vošiek umiestnilo na tri rastliny N. benthamiana (50 vošiek na rastlinu). Po 72 hodinách boli všetci dospelí jedinci odobratí mäkkou umeleckou kefou a nymfy sa nechali kŕmiť ďalšie štyri dni predtým, ako boli prenesené do N. benthamiana na testy výkonnosti vošiek.
4.10. Testy výkonnosti vošiek
Nicotiana benthamiana Domin. (Solanales: Solanaceae) sa použil na hodnotenie výkonnosti M. persicae, odolnosti rastlín voči B. cinerea a expresie génov súvisiacich s hormónmi. Agrobaktérie nesúce buď pYBA-eGFP, pYBA-MaCFEM85, pYBA-MsWAK16 alebo pYBA-MaCFEM85+pYBA-MsWAK16 sa pestovali v LB doplnenom vhodnými antibiotikami počas 36 hodín pri 28 °C. Bunky sa trikrát premyli, potom sa resuspendovali v infiltračnom pufri (10 mM MgCl2, 10 mM MES a 100 uM acetosyringónu, pH 5,6) na OD600 0,6. Na koinfekciu sa baktérie nesúce MaCFEM85 a MsWAK16 upravili na OD600 1,2 a potom sa zmiešali v rovnakých objemoch. Úplne expandované listy boli infiltrované baktériami pomocou 1-ml injekčných striekačiek bez ihly. Na každú rastlinu boli infiltrované tri listy a každé ošetrenie bolo aplikované na tri rastliny, celkovo 12 rastlín na experiment.
Na testy výkonnosti vošiek sa 12 hodín po aplikácii Agrobacterium aplikovalo 20 dospelých vošiek na infiltrovanú oblasť každého listu. Vošky sa obmedzili pomocou klipových klietok s priemerom 5 mm. Každé ošetrenie sa opakovalo päťkrát. Mortalita dospelých vošiek a počet novoznesených nýmf sa zaznamenávali denne počas troch dní. B. cinerea sa kultivovala päť dní na PDAY. 12 hodín po infiltrácii Agrobacterium bola novo kultivovaná B. cinerea vyrazená do 5- mm hubového koláča a povrch rastu mycélia bol pripojený k infiltračnej oblasti na povrchu listu. Aby sa uľahčil vývoj choroby, rastliny boli udržiavané vlhké tak, že boli pokryté plastovou fóliou v podnosoch pri teplote 22 ◦C, aby sa uľahčila progresia choroby. Po 48 hodinách sa odhadla progresia ochorenia v naočkovaných listoch meraním veľkosti lézií. Na kvantifikáciu relatívnej expresie relevantných génov sa tri infiltrované listy odobrali z každej rastliny 12 hodín po infiltrácii, potom sa zmrazili v tekutom dusíku a skladovali pri -80 stupňoch . Celková extrakcia RNA, syntéza cDNA a qRT-PCR sa uskutočnili tak, ako je opísané v časti 3.2. Hladiny kyseliny salicylovej (SA), kyseliny jazmónovej (JA) a flavonoidov sa merali v 15 infiltrovaných listoch N. benthamiana na ošetrenie. Listy sa zozbierali, zmrazili v tekutom dusíku a potom sa skladovali pri teplote -80 stupňov. Rastlinné hormóny sa kvantifikovali pomocou súpravy Plant Salicyclic Acid a Plant Jasmonic Acid ELISA Kit (Beijing WeLab Scientific Co., Ltd.) a flavonoidy sa kvantifikovali pomocou súpravy Micro Plant Flavonoids Assay Kit (Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.) pokyny výrobcu.
4.11. Štatistická analýza
Údaje boli analyzované v SPSS v20.0. Významné rozdiely v hladinách expresie MaCFEM85 a MsWAK16 boli stanovené pomocou Studentovho t-testu. Významné rozdiely v hladinách SA, JA a flavonoidov boli stanovené pomocou jednosmernej ANOVA a Duncanovho viacrozsahového testu s prahom p < 0,05.
5. Závery
V tejto štúdii sme identifikovali a charakterizovali nový secernovaný proteín, MaCFEM85, v M. anisopliae. Zistilo sa, že ide o konzervovaný efektor, ktorý môže interagovať s MsWAK16 a aktivovať obrannú reakciu N. benthamiana. Ukázali sme, že doména CFEM a cysteínový zvyšok v polohe 52 v MaCFEM85 boli kritické pre interakciu. Táto interakcia môže aktivovať imunitné reakcie súvisiace s JA a mechanizmy odolné voči chorobám a hmyzu v rastline.
Referencie
1. Paulucci, NS; Anta, GG; Gallarato, LA; Vicario, JC; Cesari, AB; Reguera, YB; Kilmurray, C.; Bueno, MA; García, MB; Dardanelli, MS Partnerstvo rastlín a mikróbov: Dôsledky pre rast a zdravie rastlín. In Plant Microbe Symbiosis: Fundamentals and Advances; Springer: Berlín/Heidelberg, Nemecko, 2013; s. 105–117. [CrossRef]
2. Schenk, PM; Carvalhais, LC; Kazan, K. Rozlúštenie interakcií medzi rastlinami a mikróbmi: Môže pomôcť viacdruhová transkriptomika? Trends Biotechnol. 2012, 30, 177–184. [CrossRef]
3. Sasse, J.; Martinoia, E.; Northen, T. Nakŕmte svojich priateľov: Formujú rastlinné exsudáty koreňový mikrobióm? Trends Plant Sci. 2018, 23, 25–41. [CrossRef]
4. Lugtenberg, B.; Kamilová, F. Rizobaktérie podporujúce rast rastlín. Annu. Microbiol. 2009, 63, 541–556. [CrossRef]
5. Shoresh, M.; Harman, GE; Mastouri, F. Indukovaná systémová rezistencia a reakcie rastlín na činidlá na biologickú kontrolu húb. Annu. Phytopathol. 2010, 48, 21–43. [CrossRef]
6. van de Mortel, JE; de Vos, RC; Dekkers, E.; Pineda, A.; Guillod, L.; Bouwmeester, KJ; van Loon, J.; Dicke, M.; Raaijmakers, JM Metabolické a transkriptomické zmeny indukované v Arabidopsis rhizobaktériou Pseudomonas fluorescens SS101. Plant Physiol. 2012, 160, 2173–2188. [CrossRef]
7. Lareen, A.; Burton, F.; Schafer, P. Komunikácia medzi koreňmi rastlín a mikróbmi pri formovaní koreňových mikrobiómov. Plant Mol. Biol. 2016, 90, 575–587. [CrossRef]
8. Sasan, RK; Bidochka, MJ Hmyz patogénna huba Metarhizium Roberts (Clavicipitaceae) je tiež endofytom, ktorý stimuluje vývoj koreňov rastlín. Am. J. Bot. 2012, 99, 101–107. [CrossRef]
9. Sasan, RK; Bidochka, MJ Antagonizmus endofytnej hmyzej patogénnej huby Metarhizium robertsii proti patogénu fazule Fusarium solanif. sp. phaseoli. Môcť. J. Plant Pathol. 2013, 35, 288–293. [CrossRef]
10. Ahmad, I.; Jiménez-Gasco, MdM; Luthe, DS; Shakeel, SN; Barbercheck, ME Endophytic Metarhizium robertsii podporuje rast kukurice, potláča rast hmyzu a mení expresiu génov na ochranu rastlín. Biol. Kontrola 2020, 144, 104167. [CrossRef]
11. Chairin, T.; Petcharat, V. Vyvolanie obranných reakcií v ovocí Hongkong (Aglaia dookkoo Griff.) proti hubám hniloby ovocia pomocou Metarhizium guizhouense. Biol. Kontrola 2017, 111, 40–44. [CrossRef]
12. Hao, K.; Wang, F.; Nong, X.; McNeill, MR; Liu, S.; Wang, G.; Cao, G.; Zhang, Z. Reakcia koreňov arašidov Arachis hypogaea na prítomnosť prospešných a patogénnych húb analýzou transkriptómu. Sci. Rep. 2017, 7, 964. [CrossRef] [PubMed]
13. Patel, ZM; Mahapatra, R.; Jampala, SSM Kapitola 11 – Úloha hubových elicitorov v obrannom mechanizme rastlín. In Molekulárne aspekty rastlinných prospešných mikróbov v poľnohospodárstve; Sharma, V., Salwan, R., Al-Ani, L., Eds.; Academic Press: Cambridge, MA, USA, 2020; s. 143–158. [CrossRef]
14. Dong, X.; Sa, JA Etylén a odolnosť rastlín voči chorobám. Curr. Opin. Plant Biol. 1998, 1, 316-323. [CrossRef] [PubMed]
15. Thomma, BP; Eggermont, K.; Penninckx, IA; Mauch-Mani, B.; Vogelsang, R.; Cammue, BP; Broekaert, WF Oddelené dráhy obrannej odozvy závislé od jasmonátu a závislé od salicylátu v Arabidopsis sú nevyhnutné pre odolnosť voči odlišným mikrobiálnym patogénom. Proc. Natl. Akad. Sci. USA 1998, 95, 15107–15111. [CrossRef] [PubMed]
16. Nohavice, SR; Irigoyen, S.; Liu, J.; Bedre, R.; Christensen, SA; Schmelz, EA; Sedbrook, JC; Scholthof, K.-BG; Mandadi, KK Brachypodium Fenylalanín amonná lyáza (PAL) Podporuje antivírusovú obranu proti vírusu Panicum mosaic a jeho satelitom. mBio 2021, 12, e03518-20. [CrossRef]
17. Liu, R.; Xu, S.; Li, J.; Hu, Y.; Lin, Z. Profil expresie génu PAL z Astragalus membranaceus var. Mongholicus a jeho kľúčová úloha pri toku do biosyntézy flavonoidov. Plant Cell Rep. 2006, 25, 705–710. [CrossRef]
18. De Geyter, N.; Gholami, A.; Goormachtig, S.; Goossens, A. Transkripčné mechanizmy v sekundárnom metabolizme rastlín vyvolanom jasmonátom. Trends Plant Sci. 2012, 17, 349–359. [CrossRef]
19. Mirjalili, N.; Linden, JC Účinky zloženia plynnej fázy na suspenzné kultúry Taxus cuspidata. Biotechnol. Bioeng. 1995, 48, 123-132. [CrossRef]
20. Li, ST; Zhang, P.; Zhang, M.; Fu, CH; Zhao, CF; Dong, YS; Guo, AY; Yu, LJ Transkripčný profil buniek taxus chinensis v reakcii na metyljasmonát. BMC Genom. 2012, 13, 295. [CrossRef]
21. Tugizimana, F.; Ncube, EN; Steenkamp, PA; Dubery, IA Metabolomics odvodené pohľady na manipuláciu syntézy terpenoidov v bunkách Centella asiatica pomocou metyljasmonátu. Rastlinná biotechnol. rep. 2015, 9, 125–136. [CrossRef]
22. Lu, M.; Wong, H.; Teng, W. Účinky elicitácie na produkciu saponínov v bunkovej kultúre Panax ginseng. Plant Cell Rep. 2001, 20, 674-677. [CrossRef]
23. Mandal, S.; Kar, I.; Mukherjee, AK; Acharya, P. Elicitorom indukované obranné reakcie v Solanum lycopersicum proti Ralstonia solanacearum. Sci. World J. 2013, 25, 561056. [CrossRef]
24. Li, L.; Wang, S.; Yang, X.; Francis, F.; Qiu, D. Proteínový elicitor PeaT1 zvýšil odolnosť proti voške (Sitobion avenae) v pšenici. Pest Manag. Sci. 2020, 76, 236–243. [CrossRef] [PubMed]
25. Bujalowski, W. Rozšírenie fyziologickej úlohy hexamérnej helikázy DnaB. Trends Biochem. Sci. 2003, 28, 116–118. [CrossRef]
26. Vaknin, Y.; Shadkchan, Y.; Levdanský, E.; Morozov, M.; Romano, J.; Osherov, N. Tri proteíny ukotvené v GPI doméne Aspergillus fumigatus (CfmA-C) ovplyvňujú stabilitu bunkovej steny, ale nehrajú úlohu pri virulencii húb. Plesňové. Genet. Biol. 2014, 63, 55–64. [CrossRef]
27. Zhao, S.; Shang, X.; Bi, W.; Yu, X.; Liu, D.; Kang, Z.; Wang, X.; Wang, X. Identifikácia celého genómu efektorových kandidátov so zachovanými motívmi z huby hrdze na listoch pšenice Puccinia triticina. Predné. Microbiol. 2020, 11, 1188. [CrossRef]
28. Gong, A.; Jing, Z.; Zhang, K.; Tan, Q.; Wang, G.; Liu, W. Bioinformatická analýza a funkčná charakterizácia proteínov CFEM v kukuričnej antraknózovej hube Colletotrichum graminicola. J. Integr. Agric. 2020, 19, 541–550. [CrossRef]
29. Martin, F.; Aerts, A.; Ahren, D.; Brun, A.; Danchin, EG; Duchaussoy, F.; Gibon, J.; Kohler, A.; Lindquist, E.; Pereda, V.; a kol. Genóm Laccaria bicolor poskytuje pohľad na mykoríznu symbiózu. Príroda 2008, 452, 88–92. [CrossRef]
30. Štefan, V.; Lara, RJ Entomopatogénne huby ako endofyty: Interakcie rastlina-endofyt-bylinožravec a vyhliadky na použitie pri biologickej kontrole. Curr. Sci. 2015, 109, 46–54.
31. Cai, N.; Liu, R.; Yan, D.; Zhang, N.; Zhu, K.; Zhang, D.; Nong, X.; Tu, X.; Zhang, Z.; Wang, G. Bioinformatická analýza a funkčná charakterizácia CFEM proteínov Metarhizium anisopliae. J. Fungi. 2022, 8, 661. [CrossRef]
32. Stephens, C.; Hammond-Kosack, KE; a Kanyuka, K. WAKsing rastlinná imunita, ustupujúce choroby. J. Exp. Bot 2022, 73, 22–37. [CrossRef]
33. Zhang, ZN; Wu, QY; Zhang, GZ; Zhu, YY; Murphy, RW; Liu, Z.; Zou, CG Systematické analýzy odhaľujú jedinečnosť a pôvod domény CFEM v hubách. Sci. Rep. 2015, 5, 13032. [CrossRef] [PubMed]
34. Fang, A.; Gao, H.; Zhang, N.; Zheng, X.; Qiu, S.; Li, Y.; Zhou, S.; Cui, F.; Sun, W. Nový efektorový gén SCRE2 prispieva k úplnej virulencii Ustilaginoidea virens na ryžu. Predné. Microbiol. 2019, 10, 845. [CrossRef] [PubMed]
35. Zhu, W.; Wei, W.; Wu, Y.; Zhou, Y.; Peng, F.; Zhang, S.; Chen, P.; Xu, X. BcCFEM1, proteín obsahujúci doménu CFEM s predpokladaným miestom ukotveným GPI, sa podieľa na patogenite, produkcii konídií a tolerancii stresu v Botrytis cinerea. Predné. Microbiol. 2017, 8, 1807. [CrossRef]
36. Xu, X.; Li, G.; Li, L.; Su, Z.; Chen, C. Porovnávacia analýza celého genómu predpokladaných receptorov spojených s G proteínom súvisiacich s Pth{2}} v hubách patriacich do Pezizomycotina. BMC Microbiol. 2017, 17, 166. [CrossRef] [PubMed]
37. Peng, YJ; Hou, J.; Zhang, H.; Lei, JH; Lin, HY; Ding, JL; Feng, MG; Ying, SH Systematické príspevky proteínov obsahujúcich CFEM doménu k získavaniu železa sú nevyhnutné pre medzidruhovú interakciu vláknitej patogénnej huby Beauveria bassiana. Environ. Microbiol. 2022, 24, 3693–3704. [CrossRef] [PubMed]
38. Roy, U.; Kornitzer, D. Akvizícia heme-železa v hubách. Curr. Opin. Microbiol. 2019, 52, 77–83. [CrossRef] [PubMed]
39. Okamoto-Shibayama, K.; Kikuchi, Y.; Kokubu, E.; Sato, Y.; Ishihara, K. Csa2, člen rodiny proteínov Rbt5, sa podieľa na využití železa z ľudského hemoglobínu počas rastu hýf Candida albicans. FEMS Yeast Res. 2014, 14, 674–677. [CrossRef]
40. Perez, A.; Pedros, B.; Murgui, A.; Casanova, M.; Lopez-Ribot, JL; Martinez, JP Tvorba biofilmu mutantmi Candida albicans pre gény kódujúce fungálne proteíny vykazujúce doménu CFEM obsahujúcu osem cysteínu. FEMS Yeast Res. 2006, 6, 1074-1084. [CrossRef]
41. Hogg, PJ Disulfidové väzby ako spínače funkcie proteínu. Trends Biochem. Sci. 2003, 28, 210-214. [CrossRef]
42. van den Burg, HA; Westerink, N.; Francoijs, KJ; Roth, R.; Woestenenk, E.; Boeren, S.; de Wit, PJ; Joosten, MH; Vervoort, J. Prírodné mutanty AVR4 patogénu Cladosporium fulvum s prerušenou disulfidovou väzbou sú citlivé na proteolýzu, obchádzajú rezistenciu sprostredkovanú Cf{3}}, ale zachovávajú si svoju schopnosť viazať chitín. J. Biol. Chem. 2003, 278, 27340–27346. [CrossRef] 43. Hu, K.; Cao, J.; Zhang, J.; Xia, F.; Ke, Y.; Zhang, H.; Xie, W.; Liu, H.; Cui, Y.; Cao, Y.; a kol. Zlepšenie viacerých agronomických vlastností génom odolnosti voči chorobám prostredníctvom posilnenia bunkovej steny. Nat. Rastliny 2017, 3, 17009. [CrossRef] [PubMed]
44. Saitoh, H.; Fujisawa, S.; Mitsuoka, C.; Ito, A.; Hirabuchi, A.; Ikeda, K.; Irieda, H.; Yoshino, K.; Yoshida, K.; Matsumura, H.; a kol. Rozsiahle narušenie génu v Magnaporthe oryzae identifikuje MC69, secernovaný proteín potrebný na infekciu jednoklíčnolistovými a dvojklíčnolistovými hubovými patogénmi. PLoS Pathog. 2012, 8, e1002711. [CrossRef] [PubMed]
45. Kulkárni, RD; Kelkar, HS; Dean, R. Doména CFEM obsahujúca osem cysteínu jedinečná pre skupinu proteínov hubovej membrány. Trends Biochem. Sci. 2013, 28, 118–121. [CrossRef] [PubMed]
46. Peng, J.; Wu, L.; Zhang, W.; Zhang, Q.; Xing, Q.; Wang, X.; Li, X.; Yan, J. Systémová identifikácia a funkčná charakterizácia bežných proteínov extracelulárnej membrány húb v Lasiodiplodia theobromae. Predné. Plant Sci. 2021, 12, 804696. [CrossRef]
47. Bari, R.; Jones, JD Úloha rastlinných hormónov v obranných reakciách rastlín. Plant Mol. Biol. 2009, 69, 473–488. [CrossRef]
48. Verma, V.; Ravindran, P.; Kumar, PP Regulácia stresových reakcií sprostredkovaná rastlinnými hormónmi. BMC Plant Biol. 2016, 16, 86. [CrossRef]
49. Javed, K.; Qiu, D. Proteínový elicitor PeBL1 z Brevibacillus laterosporus zvyšuje odolnosť proti Myzus persicae v paradajke. Patogény 2020, 9, 57. [CrossRef]
50. Basit, A.; Hanan, A.; Nazir, T.; Majeed, MZ; Qiu, D. Molekulárna a funkčná charakterizácia elicitoru PeBC1 extrahovaného z Botrytis cinerea, ktorý sa podieľa na indukcii rezistencie proti voške broskyňovej (Myzus persicae) vo fazuli obyčajnej (Phaseolus vulgaris L.). Hmyz 2019, 10, 35. [CrossRef]
51. Nazir, T.; Hanan, A.; Basit, A.; Majeed, MZ; Anwar, T.; Nawaz, I.; Qiu, D. Predpokladaná úloha zatiaľ necharakterizovaného proteínového elicitora PeBb1 odvodeného z Beauveria bassiana ARSEF 2860 Kmeň proti Myzus persicae (Homoptera: Aphididae) v Brassica rapa ssp. pekinensis. Patogény 2020, 9, 111. [CrossRef]
52. Spoel, SH; Koornneef, A.; Claessens, SM; Korzelius, JP; Van Pelt, JA; Mueller, MJ; Buchala, AJ; Metraux, JP; Brown, R.; Kazaň, K.; a kol. NPR1 moduluje krížovú komunikáciu medzi obrannými dráhami závislými od salicylátu a jasmonátu prostredníctvom novej funkcie v cytosóle. Plant Cell 2003, 15, 760–770. [CrossRef]
53. Xin, XF; On, SY Pseudomonas syringae pv. paradajka DC3000: Modelový patogén na testovanie náchylnosti k chorobám a hormonálnej signalizácie v rastlinách. Annu. Phytopathol. 2013, 51, 473–498. [CrossRef] [PubMed]
54. Zhang, X.; Wang, C.; Zhang, Y.; Sun, Y.; Mou, Z. Podjednotka mediátorového komplexu Arabidopsis16 pozitívne reguluje salicylátom sprostredkovanú systémovú získanú rezistenciu a obranné dráhy vyvolané jasmonátom/etylénom. Rastlinná bunka 2012, 24, 4294–4309. [CrossRef] [PubMed]
55. Doares, SH; Narvaez-Vasquez, J.; Conconi, A.; Ryan, CA Kyselina salicylová inhibuje syntézu inhibítorov proteináz v listoch paradajok indukovanú systemínom a kyselinou jazmónovou. Plant Physiol. 1995, 108, 1741–1746. [CrossRef] [PubMed]
56. Pieterse, CM; Leon-Reyes, A.; Van der Ent, S.; Van Wees, SC Networking pomocou hormónov s malou molekulou v imunite rastlín. Nat. Chem. Biol. 2009, 5, 308–316. [CrossRef]
57. Penninckx, IA; Thomma, BP; Buchala, A.; Métraux, JP; Broekaert, WF Na indukciu génu rastlinného defenzínu v Arabidopsis je potrebná súčasná aktivácia dráh odozvy jasmonátu a etylénu. Rastlinná bunka 1998, 10, 2103–2113. [CrossRef]
58. Fang, W.; Bidochka, MJ Expresia génov podieľajúcich sa na klíčení, konidiogenéze a patogenéze v Metarhizium anisopliae pomocou kvantitatívnej RT-PCR v reálnom čase. Mycol. Res. 2006, 110, 1165–1171. [CrossRef]
59. Guerriero, G.; Legay, S.; Hausman, JF Alfalfa Expresia génu celulózovej syntázy pri abiotickom strese: Stopárov sprievodca normalizáciou RT-qPCR. PLoS ONE 2014, 9, e103808. [CrossRef]
60. Yang, Y.; Zhang, Y.; Li, B.; Yang, X.; Dong, Y.; Qiu, D. A Verticillium dahliae pektát lyáza indukuje imunitné reakcie rastlín a prispieva k virulencii. Predné. Plant Sci. 2018, 9, 1271. [CrossRef]
61. Livák, KJ; Schmittgen, TD Analýza údajov relatívnej génovej expresie pomocou kvantitatívnej PCR v reálnom čase a metódy 2(-Delta Delta C(T)). Methods 2001, 25, 402–408. [CrossRef]
