Poškodenie podocytov v dôsledku interakcie medzi Tlr8 a jeho endogénnym ligandom MiR-21 v upchatej a jej kolaterálnej obličke

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

cistanche erektilná dysfunkcia súvisiaci s obličkami

Zatiaľ čo chronické ochorenie obličiek prevláda u dospelých, obštrukčná nefropatia (ON) bola hlásená u mladých aj starých pacientov. Pri ON sa široko skúmali tubulointersticiálne lézie (TIL), ale glomerulárne lézie (GL) boli do značnej miery zanedbávané. Tu ukazujeme nový mechanizmus, ktorý je základom vývoja GL v ON u mladých a starých myší. TIL sa vyvíjajú skôr ako GL v dôsledku infiltrácie zápalových buniek v tubulointerstíciu, ale GL sa vyvíjajú po aktivácii Toll-like receptora 8 (Tlr8), aj keď neprítomnosť zápalových buniek infiltrujúcich glomerulus. Proteíny TLR8 a interleukín 1 beta (IL1b) sa kolokalizujú s redukujúcimi markermi funkcie podocytov (PFM), čo naznačuje aktiváciu signalizácie TLR8 v poškodených podocytoch. Okrem toho, glomerulárne a sérové ​​hladiny miR-21, endogénneho ligandu pre Tlr8, boli vyššie v modeli ON myší ako v simulovanej kontrole. Glomerulárna expresia Tlr8 pozitívne koreluje s miR-21 a downstream cytokínmi Il1b a Il6 a negatívne koreluje s PFM (Nphs1 a Synpo). Ukazujeme tiež kolokalizáciu proteínov TLR8 a IL1b s redukciou PFM v obštrukčných ajkolaterálobličkymladých a starých myší. Okrem toho výsledky štúdie in vitro odhalili vyššiu expresiu Tlr8 a jeho downstream cytokínov v glomerulách z obštrukčnýchobličkypo liečbe miR- 21 mimikom ako v kontrole. Záverom možno povedať, že nadmerná expresia Tlr8 môže slúžiť ako pravdepodobný mechanizmus, ktorý je základom vývoja GL v ON prostredníctvom poškodenia podocytov.

Kľúčové slová: chronické ochorenie obličiek,obštrukčná nefropatia, podocyt, TLR8, obštrukčná a kolaterálna oblička

ÚVOD

Chronické ochorenie obličiek (CKD), hlavný problém verejného zdravia, prevláda u 8 až 13 percent celkovej populácie (1). V dôsledku starnutia spoločnosti je častý u starších ľudí. Obštrukčná nefropatia (ON) je veľmi zaujímavá pre lekárov, pretože bola hlásená u pacientov z rôznych vekových skupín. ON je liečiteľná a reverzibilná, na rozdiel od iných CKD (2, 3). U detí sa vyskytuje u jedného z 1500 mladých jedincov a jeho prevalencia je v rozvinutých krajinách až 1 až 5 percent (4, 5). U dospelých sa prevalencia ON pohybuje od 5 z 1 000 do 5 z 10 000 jedincov. Okrem toho prevalencia chronickej unilaterálnej ON je približne 0,5 percenta, zatiaľ čo prevalencia akútnej jednostrannej a chronickej bilaterálnej ON je približne 0,1 percenta (4–7).

ON môže viesť k akútnemu poškodeniu obličiek alebo CKD, ktoré zahŕňa progresívny pokles renálnych funkcií a zmeny renálnych štruktúr trvajúce dlhšie ako 3 mesiace (8, 9). Jednostranná ureterálna obštrukcia (UUO) je široko používaná stratégia na štúdium chronickej ON. ON v obličke UUO je charakterizovaná hypertrofiou, hydronefrózou, náborom zápalových buniek v intersticiálnej oblasti, smrťou tubulárnych buniek z hypoxie a ukladaním kolagénu v tubulointerstíciu, po ktorom nasleduje rozvoj tubulointersticiálnej fibrózy (TF) (10).

TF je dôležitým znakom konečného štádia renálneho ochorenia a hlavným determinantom progresívneho renálneho poškodenia (11). TF bola rozsiahlo skúmaná v modeloch ON, ale údaje týkajúce sa poškodenia glomerulov, najmä abnormalít krvno-močovej bariéry (BUB), sú vzácne (8, 9, 12). Štúdie ďalej skúmali tubulointersticiálne lézie (TIL) v kolaterálnej obličke pri unilaterálnej ON, ale glomerulárne lézie (GL) boli do značnej miery zanedbávané (12). Niekoľko správ odhalilo zapojenie peritubulárnych kapilár do progresie TIL pri experimentálnom ON (13, 14). Glomerulus a glomerulárna kapilára však odvádzajú do tubulárnych segmentov nefrónu a peritubulárnych kapilár. Preto sa domnievame, že glomerulonefritída môže postihnúť aj tubulointerstitium. Naše predchádzajúce štúdie zdôraznili príspevok poškodenia glomerulárnych vnútorných buniek, najmä podocytov, ku GL a následnému vývoju TIL v myšom modeli s autoimunitným ochorením v dôsledku nadmernej expresie rôznych Toll-like receptorov (TLR) (15–18).

Glomerulárny kapilárny endotel a podocyty sú dôležitými vrátnikmi obsahujúcimi BUB. Medzi týmito dvoma epitelmi sú podocyty nepretržite vystavené nebezpečným signálom, vrátane ligandov TLR, ako sú molekulárne vzory spojené s nebezpečenstvom (DAMP) alebo molekulárne vzory spojené s patogénmi (PAMP), vďaka ich jedinečnej lokalizácii v glomeruloch (15). Preto sa predpokladá, že interakcia medzi TLR v podocytoch a ich endogénnymi ligandami prispieva k poškodeniu podocytov v neinfekčných podmienkach. V tejto štúdii sme sa zamerali na vývoj GL v obštrukčných aj kolaterálnych obličkách mladých a starých myší, pretože ON sa často vyskytuje u mladých aj starších ľudí. Objasnili sme, že GL sa vyvinul v ON v dôsledku poškodenia podocytov prostredníctvom nadmernej expresie Tlr8 v podocytoch z obštrukcie aj kolaterálnych obličiek mladých a starých myší.

MATERIÁLY A METÓDY

Etické vyhlásenie a experimentálne umiestnenie zvierat Všetky experimenty s laboratórnymi zvieratami boli schválené Inštitucionálnym výborom pre starostlivosť o zvieratá a ich používanie Fakulty veterinárneho lekárstva Univerzity Hokkaido (číslo schválenia 16- 0124). Autori postupovali podľa schválenej príručky pre starostlivosť a používanie laboratórnych zvierat Univerzity Hokkaido, Fakulty veterinárneho lekárstva (schválenej Asociáciou pre hodnotenie a akreditáciu Laboratory Animal Care International). Šesťtýždňové myši C57BL/6N boli zakúpené od Japan SLC Inc. (Hamamatsu, Japonsko) a udržiavané v špecifických podmienkach bez patogénov v prostredí 1:1 svetlo-tma. Experimentálnym zvieratám bola poskytnutá ad libitná potrava a pitná voda.

Experimentálny dizajn Použili sme mladé (9 týždňov) aj staré (12 mesiacov) myši. Myši z každej vekovej skupiny (n=4) boli podrobené buď falošnej operácii (kontrolná skupina) alebo UUO (2, 7, 11 a 21 dní), aby sa vytvorila oblička modelu ON, ako je opísané v našej predchádzajúcej štúdii (13).

Príprava vzorky Myši boli hlboko anestetizované zmesou anestetických činidiel, ako už bolo opísané (16) a usmrtené cervikálnou dislokáciou. Vzorky krvi sa odoberali cez femorálnu artériu na analýzu sérových markerov. UUO aj kolaterálne obličky sa odobrali a nakrájali na tenké plátky. Rezy obličiek boli fixované 10 percentami neutrálneho pufrového formalínu (NBF), 4 percentami paraformaldehydu (PFA) a 2,5 percentami glutaraldehydu (GTA) pre histopatologické, imunohistochemické a elektrónové mikroskopické štúdie, v danom poradí.

Imunohistochémia a imunofluorescencia Parafínové bloky fixované NBF boli narezané na hrúbku 2 mm a zafarbené kyselinou jodistou Schiff-hematoxylínom (PAS-H), aby sa preskúmala histopatológia obličiek. Imunodetekcia bunkových markerov sa uskutočnila, ako už bolo uvedené (16) pre B bunky (B220), T bunky (CD3), kapilárny endotel (CD31), IL1b, makrofágy (Ibal), podocyty (podocin a synaptopodin) a TLR8. Podmienky farbenia sú uvedené v tabuľke 1.

Histoplanimetrická PAS-H a imunofarbené rezy obličiek boli prevedené na virtuálne sklíčka pomocou Nano Zoomer 2.0 RS (Hamamatsu Photonics Co., Ltd.; Hamamatsu, Japonsko). Pozitívne bunky sa spočítali z náhodne vybraných 20 glomerulov alebo 20 ložísk z tubulointerstícia pri 400-násobnom zväčšení pomocou softvéru NDP.view2 (Hamamatsu Photonics Co., Ltd.). Snímky 20 glomerulov z rezov zafarbených PAS-H boli tiež zachytené pri 400x z každej myši pomocou fluorescenčného mikroskopu All-in-One BZ-X710 (Keyence, Osaka, Japonsko). Glomerulárna mezangiálna oblasť a veľkosť sa merali zo zachytených obrázkov pomocou analyzátora BZ-X (Keyence).

Izolácia Glomerulus na extrakciu RNA a kultiváciu Glomeruli z falošne operovaných a UUO obličiek sa izolovali, ako už bolo opísané (16). Stručne povedané, myši boli hlboko anestetizované a perfundované cez ľavú komoru 40 ml Hankovho vyváženého soľného roztoku (HBSS) obsahujúceho Dynabeads (8 x 107; Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Oblička bola vyrezaná

a nakrájame na malé kúsky. Bunky sa potom štiepili kolagenázou A (1 mg/ml; Roche, Basel, Švajčiarsko) a deoxyribonukleázou I (100 U/ml; Life Technologies) v HBSS pri 37 stupňoch počas 30 minút. Suspenzia obsahujúca natrávené tkanivo bola jemne pretlačená cez 100-mm bunkové sitko (BD Falcon, Franklin Lakes, NJ, USA) pomocou splošteného tĺčika. Výsledná bunková suspenzia sa centrifugovala pri 200 x g počas 5 minút a bunková peleta sa resuspendovala v 2 ml HBSS. Glomeruli obsahujúce Dynabeads sa zhromaždili pomocou magnetického koncentrátora častíc (Life Technologies) a použili sa na izoláciu RNA.

Reverzná transkripcia a real-time PCRCelková RNA bola izolovaná z glomerulov pomocou súpravy RNeasy (Qiagen, Hilden, Nemecko). cDNA bola syntetizovaná z celkovej RNA reverznou transkripciou s použitím enzýmu reverznej transkriptázy ReverTra Ace (Toyobo, Osaka, Japonsko) a náhodných primérov dT (Promega). cDNA bola použitá v real-time PCR s Brilliant III SYBR Green QPCR master mix a Mx3000P (Agilent Technologies, La Jolla, CA, USA). Glomerulárna génová expresia bola normalizovaná na expresiu Actb. Použité páry primérov sú uvedené v tabuľke 2.

Reverzná transkripcia a TaqMan-Based Real-Time PCRCelková RNA vrátane mikroRNA (miRNA) v izolovaných glomeruloch bola izolovaná pomocou súpravy miRNeasy (Qiagen). Na reverznú transkripciu celkovej RNA podľa inštrukcií výrobcu (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) boli použité miRNA-špecifické kmeňové RT primery, reverzná transkriptáza, reverzný transkripčný pufor, dNTP a inhibítor RNázy. PCR v reálnom čase sa uskutočnila s výslednou cDNA s použitím miR-21- špecifických TaqMan primerov a špecifických sond (Applied Biosystems), TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) a Mx3000P (Agilent Technologies).

In vitro liečba izolovaných glomerulov s mimikmiGlomeruli boli izolované z falošne operovaných a UUOobličkypo 11 dňoch obštrukcie. Médium Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI{2}}) (Fujifilm Wako, Japonsko) obsahujúce 300 glomerulov bolo rozdelené do každej jamky 96-jamkovej kultivačnej platne (TPP, Trasadingen, Švajčiarsko) a liečených PBS, negatívnou kontrolou a miR{5}} mimikom (UAG CUU AUC AGA CUG AUG UUG A) (Bioneer, Daejeon, Južná Kórea) pri 1 pmol/ul počas 4 hodín pri 37 stupňoch v 5 percentách CO2. Expresia Tlr8 a jeho downstream cytokínov sa merala tak, ako je opísané v predchádzajúcej časti.

Skenovacia elektrónová mikroskopiaPre rutinnú skenovaciu elektrónovú mikroskopiu (SEM), malýobličky plátkyboli fixované 2,5 percentami GTA počas 4 hodín a následne fixované 1 percentom oxidu osmičelého počas 1 hodiny, po čom nasledovalo ošetrenie 1 percentom kyseliny trieslovej počas 1 hodiny. Vzorky sa potom fixovali 1 percentom oxidu osmičelého počas 1 hodiny a spracovali sa s 0,5 percentami a 1 percentami kyseliny trieslovej počas 10 minút, respektíve 1 hodiny.Obličkyplátkyboli dehydratované stúpajúcimi stupňami alkoholu, prenesené do 3-metylbutylacetátu a nakoniec vysušené pomocou HCP-2 sušičky kritického bodu (Hitachi, Tokio, Japonsko). Vzorky boli podrobené iónovému rozprašovaniu a potom skúmané pod S-4100 rastrovacím elektrónovým mikroskopom pri zrýchlenom napätí 12 kV.

Štatistická analýzaHodnoty sú vyjadrené ako priemer ± štandardná chyba (se). Výsledky boli štatisticky analyzované pomocou neparametrického Mann-Whitneyho U-testu (P < 0.05).="" kruskal-wallisov="" test="" sa="" použil="" na="" porovnanie="" troch="" alebo="" viacerých="" populácií="" a="" viacnásobné="" porovnania="" sa="" uskutočnili="" pomocou="" scheffeho="" metódy,="" keď="" boli="" pozorované="" významné="" rozdiely="" (p="">< 0,05).="" korelácia="" medzi="" týmito="" dvoma="" parametrami="" bola="" analyzovaná="" pomocou="" spearmanovho="" testu="" koeficientu="" poradovej="" korelácie="" (p=""><>

VÝSLEDKY

TIL a GL v upchatých obličkách mladých myšíNajprv sme skúmali TIL a GL v falošne operovaných a UUO obličkách mladých myší vystavených obštrukcii počas rôznych časových období. Zatiaľ čo falošne operované obličky vykazovali normálne tubulointerstitium (obrázok 1A), obštrukčné obličky po 2 dňoch UUO vykazovali TIL a boli charakterizované dilatáciou tubulov; niektoré tubuly obsahovali aj močové odliatky. Takéto lézie sa zvyšovali s postupujúcou obštrukciou (obrázok 1A). GL, hlavne glomeruloskleróza, boli pozorované v neskorom štádiu 21 dní po UUO a boli charakterizované ukladaním látok pozitívnych na kyselinu periodickú – Schiff (PAS). Glomerulárna štruktúra bola normálna v simulovaných aj skorých obličkách UUO (2, 7 a 11 dní) (obrázok 1B). Počet glomerulárnych buniek mal tendenciu rásť až do dňa -11 po obštrukcii a mal tendenciu klesať v deň-21 v obličkách UUO (obrázok 1C). Glomerulárna mezangiálna akumulácia mala tendenciu zvyšovať sa od 7 dní po obštrukcii (obrázok 1D).

chýbal v strede glomerulov UUO obličiek 21 dní po obštrukcii (obrázok 1F). Polymerázová reťazová reakcia odhalila významný pokles PFM (Nphs1 a Synpo) v obličkách UUO 21 dní po obštrukcii (obrázok 1G). Okrem toho analýza SEM odhalila normálne procesy podocytovej nohy (PFP) v falošne operovaných obličkách; avšak vymazanie PFP a mikrovilózne štruktúry boli hlásené v obličkách UUO 21 dní po obštrukcii (obrázok 1H). Tieto výsledky spolu naznačujú výskyt poškodenia podocytov v upchatej obličke 21 dní po obštrukcii.

Infifiltrujúce imunitné bunky chýbajú v upchatej obličke Už sme predtým ukázali, že poškodenie podocytov koreluje s infifiltrujúcimi imunitnými bunkami v glomerulu (13, 16, 18). Preto sme skúmali infifiltráciu B- a T-buniek, ako aj makrofágov v TIL a GL falošne operovaných a UUO obličiek (obrázok 2). Početné infifiltrujúce B-, T-bunky a makrofágy boli pozorované v TIL UUO obličiek všetky dni po obštrukcii, ale takmer chýbali alebo ich bolo málo v glomeruloch falošných aj UUO obličiek (obrázky 2A–E). Počet B-, T-buniek a makrofágov bol veľmi malý v glomerule (údaje nie sú uvedené), ale výrazne vyšší v

tubulointerstitium 2-, 7-, 11- a 21-denných obličiek v porovnaní s falošnou obličkou (obrázok 2F). Preto infiltrujúce imunitné bunky môžu prispieť k rozvoju TIL v zablokovanej obličke. S rozvojom GL však môžu súvisieť aj iné faktory.

Expresia rôznych členov rodiny TLR a downstream cytokínov v falošne operovaných a upchatých obličkách mladých myší Predchádzajúce štúdie odhalili vyššiu expresiu rôznych TLR v podocytoch chorých obličiek (15, 16, 19, 20). Je zaujímavé, že naše údaje odhalili výrazne vyššiu expresiu Tlr8 a Tlr9 v glomeruloch izolovaných zo skupiny UUO 21- dní ako v glomeruloch falošnej skupiny (obrázok 3A). Okrem toho sme skúmali expresiu downstream cytokínov členov rodiny TLR v glomeruloch zo simulovaných a UUO 21-dňových skupín a zistili sme významnú upreguláciu v expresii génov kódujúcich interleukín 1 beta (Il1b) aj interleukín 6 (Il6) v skupine UUO v porovnaní so skupinou v simulovanej skupine (obrázok 3B).

TLR8 spolulokalizovaný s PFM Pretože expresia Tlr8 a Tlr9 bola vysoká v glomeruloch izolovaných z obštrukcie obličiek, skúmali sme ich lokalizáciu imunofluorescenčným farbením. Proteín TLR8 nebol detegovaný v falošne operovaných obličkách (obrázok 4A), ale bol kolokalizovaný so synaptopodínom PFM v obličke UUO (obrázok 4B). Ďalej sa nám nepodarilo detegovať expresiu proteínu TLR9 v obličkách buď z falošne operovaných alebo UUO myší (údaje nie sú uvedené).

Produkcia IL1b z podocytov v upchatej obličke mladých myší Ako je znázornené na obrázku 3B, expresia glomerulárneho Il1b (podradený cytokín rodiny TLR) bola významne vyššia v obličkách UUO po 21 dňoch ako v falošnej obličke. Preto sme skúmali zdroj IL1b v glomerulách obličiek UUO imunofluorescenčným farbením. Expresia proteínu IL1b sa nezistila v glomeruloch falošných obličiek, ale bola pozorovaná v glomeruloch obličiek UUO (obrázky 4C, D). Okrem toho sa IL1b kolokalizoval s PFM podocínom (obrázok 4D).

v UUOobličkyo 21 dní ako v simuláciiobličky.Preto sme skúmali zdroj IL1b v glomerulách obličiek UUO imunofluorescenčným farbením. Expresia proteínu IL1b nebola detegovaná v glomeruloch simulácieobličkyale bol pozorovaný v glomerulách UUOobličky(Obrázky 4C, D). Okrem toho sa IL1b kolokalizoval s PFM podocínom (obrázok 4D).

Zvýšená hladina domnelého endogénneho ligandu Tlr8 v modeli myší ON Predchádzajúca štúdia ukázala, že miR-21 slúži ako ligand pre TLR8 (21). Preto sme porovnávali glomerulárne aj sérové ​​hladiny miR-21 medzi skupinami s falošným pokusom a skupinou UUO 21-dňa. Je zaujímavé, že skupina UUO 21-deň vykazovala výrazne vyššie hladiny glomerulárnej miR-21 ako v skupine s falošným pokusom (P < 0="" 0,05),="" avšak="" stúpajúca="" tendencia="" mir="" v="" sére{="" {10}}="" bol="" pozorovaný="" v="" prvej="" skupine="" ako="" v="" druhej="" skupine="" (p="0.06)" (obrázok="">

Korelácia expresie Tlr8 s jeho ligandom miR-21 a PFM v obštrukčnomObličkyAko je uvedené v tabuľke 3, pozorovali sme významnú pozitívnu koreláciu medzi glomerulárnou expresiou Tlr8 mRNA a jej endogénnym ligandom (miR-21), ako aj downstream cytokínmi Il1b a Il6. Na druhej strane bola zrejmá negatívna korelácia medzi mRNA Tlr8 a PFMs Nphs1 a Synpo.

In vitro stimulácia glomerulov pomocou miR{0}} mimika aktivuje expresiu Tlr8 a jeho downstream cytokínov Expresia Tlr8 mala tendenciu sa zvyšovať (P=0.06), ale jeho downstream cytokíny (Ifng a Il1b) boli významne (P < 0,05 a 0,01) zvýšené v glomerulách falošných myší po

liečbe miR{0}} napodobeninou v porovnaní s glomerulami myší liečených PBS a negatívnou kontrolnou napodobeninou (obrázok 5A). Nebola však pozorovaná žiadna významná korelácia medzi expresiou Tlr8 a jeho downstream cytokínmi v glomeruloch falošných myší po liečbe napodobňovačmi (tabuľka 4). Expresia Tlr8 a jeho downstream cytokínov bola významne vyššia v glomerulách UUOobličkypo liečbe miR-21 napodobňovaním ako tie v glomerulách UUOobličkyošetrené PBS a negatívna kontrola napodobenina (obrázok 5B). Bola zistená významná korelácia medzi expresiou Tlr8 a jeho downstream cytokínmi v glomerulách obličiek UUO po liečbe napodobňovaním, čo svedčí o vyššej aktivácii dráhy jadrového faktora kapa B (NF-kB) sprostredkovaného Tlr{2}} a sekrécia prozápalových cytokínov v zablokovanej obličke (tabuľka 4).

Lokalizácia TLR8 a poškodenie podocytov v kolaterálnych obličkách mladých myšíFalošne operované obličky vykazovali normálny glomerulus, zatiaľ čo kolaterálne obličky mali glomerulárnu hypertrofiu, zvýšený počet glomerulárnych buniek a dilatáciu glomerulárnych kapilár (obrázok 6A). Glomeruly z falošne operovaných obličiek boli pozitívne na expresiu synaptopodínu a chýbala im expresia TLR8 (obrázok 6B). Na druhej strane, kolaterálne obličky stratili expresiu synaptopodínu v strede glomerulov, ale vykazovali expresiu TLR8 pozdĺž glomerulárnej rýchlosti (obrázok 6C). Okrem toho bol proteín TLR8 lokalizovaný spolu so synaptopodínom (obrázok 6C). Falošne operované obličky vykazovali normálnu expresiu podocínu, ale žiadnu expresiu IL1b v glomeruloch (obrázok 6D). Avšak glomeruly v kolaterálnej obličke stratili expresiu podocínu v strede, ale mali expresiu IL1b pozdĺž glomerulárnej rýchlosti (obrázok 6E). Okrem toho bol proteín IL1b kolokalizovaný s podocínom (obrázok 6E). Analýza SEM odhalila normálne PFP v falošne operovaných obličkách myší, ale vymazanie PFP a mikrovilózne štruktúry boli viditeľné v kolaterálnych obličkách (obrázok 6F).

Lokalizácia TLR8 a poškodenie podocytov v upchatých a kolaterálnych obličkách starých myšíFalošne operované obličky vykazovali normálnu expresiu synaptopodínu, ale neodhalili žiadne farbenie proteínu TLR8 v ich glomerulách (obrázok 7A). Je zaujímavé, že kolaterálne aj UUO obličky vykazovali stratu expresie synaptopodínu v strede glomerulov, ale zachovali si expresiu TLR8 pozdĺž glomerulárnej siete (obrázky 7B, C). Proteín TLR8 bol kolokalizovaný so synaptopodínom v kolateráli a obličkách UUO (obrázky 7B, C). Falošne operované obličky podobne vykazovali normálnu expresiu podocínu, ale nemali žiadnu expresiu IL1b vo svojich glomerulách (obrázok 7D). Na druhej strane, kolaterálne aj UUO obličky stratili expresiu podocínu v strede glomerulov, ale vykazovali expresiu IL1b pozdĺž glomerulárnej siete (obrázky 7E, F). Zistilo sa, že pozitívne farbenie je kolokalizované s podocínom v glomerulách kolaterály a UUO obličiek (obrázky 7E, F). SEM vyšetrenie odhalilo normálne PFP v falošne operovaných obličkách myší, vymazanie PFP a mikrovilózne štruktúry v kolaterálnych aj UUO obličkách starých myší (obrázok 7G).

DISKUSIAON

prevalencia je bežná u dojčiat, ako aj u starších jedincov (4–7). Preto sme podrobili mladé a staré myši UUO, aby napodobnili ON stav jednotlivcov rôznych vekových skupín a skúmali TIL a GL. V obštrukčnej obličke bola progresia TIL evidentná v skoršom štádiu obštrukcie (2 dni); avšak progresia GL spolu s poškodením podocytov bola pozorovaná v neskoršom štádiu. Kolaterálna oblička vykazovala súčasne poškodenie GL a podocytov. Toto pozorovanie naznačuje, že poškodenie podocytov sa vyskytuje v obštrukčných aj kolaterálnych obličkách, hoci počiatočné poškodenie sa môže líšiť. Naše predchádzajúce štúdie zdôraznili koreláciu medzi poškodením podocytov a infiltráciou imunitných buniek v glomerule (13, 16, 18). V tejto štúdii sa však nepozorovala infiltrácia imunitných buniek do glomerulov falošných alebo upchatých obličiek. Preto sme zvažovali zapojenie ďalších faktorov do poškodenia podocytov v obštrukcii obličiek. Predpokladali sme, že nebezpečné signály (DAMP alebo PAMP), buď obehového pôvodu, alebo pochádzajúce z poškodeného tubulárneho epitelu, môžu prispieť k poškodeniu podocytov v ON, vzhľadom na jeho jedinečnú polohu v glomerule. Dôležité je, že sa ukázalo, že interakcia medzi DAMP a TLR hrá dôležitú úlohu v patogenéze neinfekčných ochorení (15). Rôzni členovia rodiny TLR sú exprimovaní na bunkovej plazmatickej membráne alebo intracelulárnych vezikulách (22) a sú charakterizované ako vrodené imunitné senzory, ktoré účinne rozpoznávajú DAMP alebo PAMP. Po aktivácii zodpovedajúcimi DAMP alebo PAMP zosilnili TLR expresiu downstream cytokínov prostredníctvom NF-kB dráhy a vyvolali obranný systém hostiteľa (22). Okrem toho DAMP prenášajú prítomnosť poškodenia tkaniva na imunitné bunky alebo lokálne vnútorné bunky a následne zhoršujú poškodenie tkaniva (23–26). Dôležité je, že všetky TLR aktivujú NF-kB dráhu, ktorá riadi expresiu radu zápalových cytokínových génov (27). Okrem toho aktivácia TLR signalizuje ich downstream dráhy na aktiváciu NF-kB, ktorý je zodpovedný za zápal a súvisí s patogenézou poškodených tkanív (28). Shichita a kol. odhalili patologické interakcie medzi endogénnymi ligandami a TLR2 alebo TLR4, ktoré prispievajú k ischemickému poškodeniu mozgu (25). Predchádzajúce štúdie tiež preukázali schopnosť členov rodiny TLR indukovať TIL v obličkách (TLR2, 4, 5, 7 a 11) a GL (TLR1–6, 8 a 9) (17, 29–33 ). V tejto štúdii sme našli poškodenie podocytov v obštrukčných a kolaterálnych obličkách a objasnili sme

úlohy rôznych členov rodiny TLR, ktoré môžu prispieť k poškodeniu podocytov (15, 16, 19, 20). Ako sme predpokladali, glomerulárna expresia Tlr8 a Tlr9 bola vyššia v glomeruloch izolovaných z obličiek UUO ako v glomeruloch z falošne operovaných myší. Okrem toho glomerulárna expresia zápalových cytokínov súvisiacich s dráhou NF-kB, vrátane Il1b a Il6, bola vyššia v obličkách UUO 21 dní po obštrukcii. Preto sme dospeli k záveru, že dráha NF-kB sprostredkovaná TLR hrá dôležitú úlohu v patogenéze GL v obštrukčnej obličke. Na rozdiel od iných členov rodiny TLR sú TLR8 a TLR9 detegované v endozómoch buniek. TLR8 rozpoznáva jednovláknové RNA a krátke dvojvláknové RNA z mikroorganizmov a aktivuje produkciu niekoľkých cytokínov sprostredkovaných NF-kB (22). Na druhej strane TLR9 rozpoznáva dvojvláknové DNA a aktivuje NF-kB dráhu na produkciu downstream cytokínov (16, 34). V tejto štúdii sme rozpoznali iba kolokalizáciu proteínu TLR8 spolu so synaptopodínom PFM v glomeruloch. Naše predchádzajúce štúdie tiež ukázali, že TLR8 aj TLR9 sa kolokalizujú s PFM a aktivujú produkciu zápalových cytokínov sprostredkovanú NF-kB na vyvolanie poškodenia podocytov (15, 16). Okrem toho ďalšie štúdie ukázali patologickú koreláciu medzi dráhami sprostredkovanými TLR a poškodením podocytov in vitro (34, 35). Banáš a kol. odhalili interakciu TLR4 v podocytoch s imunitným systémom počas vývoja GL (35). Podocyty teda môžu prispievať k imunitnému dohľadu prostredníctvom dráh sprostredkovaných TLR. V tejto štúdii sme preukázali expresiu génu TLR8 a lokalizáciu proteínu v podocytoch upchatej obličky, ako aj vyššiu expresiu downstream cytokínov v glomerule. Preto sme dospeli k záveru, že dráhy sprostredkované TLR{40}} prispievajú k rozvoju GL prostredníctvom poškodenia podocytov v zablokovanej obličke.

Predchádzajúca štúdia ukázala, že miR-21, endogénny ligand TLR8, môže dosiahnuť a viazať sa na TLR8 v bunkových endozómoch, pričom môže indukovať TLR8-sprostredkovanú aktiváciu NFkB dráhy a sekréciu prozápalových cytokínov (21). V tejto štúdii sme našli významne vyššie hladiny glomerulárnej miR-21, ako aj zvýšené hladiny miR{6}} v sére v obličkách UUO ako v simulovaných kontrolách a preukázali sme ich koreláciu s glomerulárnou expresiou Tlr8 . Je zaujímavé, že glomeruly z obličiek UUO liečených miR-21 mimikom vykazovali vyššiu expresiu Tlr8 a jeho downstream cytokínov v porovnaní s glomerulami z falošných myší liečených miR-21 mimikom, čo naznačuje zvýšenú dostupnosť endogénneho miR -21 z poškodených tkanív v zablokovanej obličke a aktivácia nadmernej expresie Tlr8 v obličkách UUO v porovnaní s falošnou expresiou. Spoločne sme dospeli k záveru, že vyšší objem miR-21 v zablokovanej obličke dosiahne endozómy v podocytoch a indukuje Tlr{14}}sprostredkovanú aktiváciu NF-kB dráhy a sekréciu prozápalových cytokínov. Tieto cytokíny sa zasa podieľajú na vývoji GL prostredníctvom poškodenia podocytov.

IL1b je jedným z dôležitých downstream cytokínov NF-kB dráhy, produkovaný hlavne podocytmi v glomerulus v podmienkach ochorenia. Predchádzajúce štúdie ukázali, že IL1b indukuje poškodenie podocytov znížením PFM (36, 37). V tejto štúdii sme preukázali vyššiu glomerulárnu expresiu Il1b a jeho kolokalizáciu s PFM, ktorá vykazovala zníženú expresiu. Okrem toho glomerulárna expresia Il1b korelovala s Tlr8 a mala tendenciu korelovať s expresiou PFM (Nphs1 a Synpo). Preto tieto výsledky naznačujú, že faktory po prúde od Tlr8, vrátane Il1b a Il6, môžu spôsobiť poškodenie podocytov v obštrukcii obličiek znížením expresie PFM.

Kolaterálne obličky mladých myší tiež vykazovali GL a stratu PFM. Tento výsledok bol potvrdený SEM, ktorý odhalil poškodenie podocytov v kolaterálnej obličke. Našli sme tiež vyššie hladiny miR-21 v sére v modeli myši ON. Okrem toho proteín IL1b lokalizovaný spolu s PFM. Tieto výsledky naznačujú, že sérový miR-21 interaguje s TLR8 v podocytoch kolaterálnej obličky a aktivuje produkciu downstream cytokínov, čo následne znižuje funkciu podocytov a poškodenie podocytov. Poškodenie podocytov sa pozorovalo aj v upchatých a kolaterálnych obličkách starých myší prostredníctvom mechanizmu podobného mechanizmu pozorovanému u mladých myší.

Záverom (obrázok 8), glomerulárna miR-21 expresia je zvýšená po jednostrannej ureterálnej obštrukcii, kde interaguje s TLR8 v podocytoch a indukuje produkciu downstream cytokínov (Il1b a 116), čo naznačuje aktiváciu NF-kB dráhy. Vyššie hladiny cytokínov znižujú PFM, čo vedie k poškodeniu podocytov a následnému rozvoju GL. Zvýšené hladiny miR-21 v sére aktivujú TLR8 v podocytoch kolaterálnej obličky a indukujú GL prostredníctvom poškodenia podocytov. Preto táto štúdia jasne ukazuje vývoj GL v obštrukčných a kolaterálnych obličkách prostredníctvom poškodenia podocytov po nadmernej expresii Tlr8.