Poly- And Oligosacharid Ulva Sp. Frakcie z extrakcie za pomoci enzýmov modulujú metabolizmus 2

Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPre viac informácií

3. Diskusia

Naším hlavným cieľom je zhodnotiť potenciálne biologické aktivity poly- a oligosacharidových frakcií z Ulon sp. získané po inovatívnom procese extrakcie pomocou enzýmov (EAE), o ktorom je známe, že zlepšuje výťažok extrakcie [5] a umožňuje významné obohatenie frakcií v ulvánoch v porovnaní s maceráciou [36] na metabolizmus dermálnych fibroblastov ľudskej kože v kultúra.

Ak chcete vedieť viac, kliknite sem

Zameralo sa na expresiu zložiek extracelulárnej matrice kože (ECM), ktoré sa podieľajú na anabolickej dráhe (najmä kolagény typu I a Ⅲ, GAG a TIMP-1) a na katabolickej dráhe (MMP-1). na proteomickej a transkriptomickej úrovni. V tejto práci sme predpokladali, že vzhľadom na vysoké zloženie frakcií v sacharidoch a urónových kyselinách, aktivita súvisí s ulvanovým (poly- a oligosacharidovým) zložením. Napriek tomu by autori nemali zanedbávať, že polysacharidové ulvany z Uloa sp. bunková stena sú úzko spojené s proteínmi, o ktorých je tiež známe, že podporujú in vitro produkciu celkového kolagénu a kyseliny hyalurónovej v ľudských dermálnych fibroblastoch [39]. Autori teda naznačujú, že tieto aktivity by mohli súvisieť so synergiou medzi ulvanmi a proteínmi, aj keď sa tento rukopis zameriava na ulvanov. 3.1. Účinok poly- a oligosacharidových frakcií Uloa z EAE na metabolizmus fibroblastov ECM

Predchádzajúce štúdie ukázali, že frakcie z Uloa sp.Cistanche Extract Anti Radiation(hrubé ulvany a ulvany s nízkou molekulovou hmotnosťou) majú schopnosť modulovať normálnu proliferáciu ľudských dermálnych fibroblastov [36-38]. Naše výsledky ukázali, že polysacharidové aj oligosacharidové frakcie z EAE vyvolali významné zvýšenie metabolickej aktivity fibroblastov (až do plus 68 percent). Tieto výsledky potvrdili predchádzajúce predbežne publikované údaje autorov [36] a predchádzajúcu prácu o hydrolyzovanom extrakte Uloa pertusa pri 250 ug/ml, ktorý vyvolal významnú pre- a senescentnú proliferáciu fibroblastov [38]. Zvýšenie metabolickej aktivity nebolo sprevádzané cytotoxickým účinkom frakcií (vyhodnotené testom LDH), čo znamená, že výsledky bioaktivity poly- a oligosacharidových frakcií Uloa z EAE nie sú ovplyvnené cytotoxickým účinkom v rozsahu testovaných koncentrácií. Náš výsledok je v súlade s predchádzajúcimi štúdiami, ktoré zdôrazňujú ulvany ako necytotoxické zlúčeniny na rôznych typoch buniek (makrofágové bunkové línie, črevné bunky, fibroblasty, bunky z myší a bunky Vero)[13,14,4].

cistanche môže proti starnutiu

Ako bolo uvedené v úvode, kolagény typu I a III a GAG spolu interagujú, aby vytvorili molekulárnu sieť na zostavenie ECM v derme. V tejto štúdii sa teda skúmala syntéza proteínov a expresia na úrovni mRNA hlavných zložiek dermis ECM (typ I a Ⅲ kolagény a GAG buď sulfátované alebo nesulfátované) v prítomnosti poly- a oligosacharidu Ullon sp. frakcie z EAE. Okrem toho MMP-1, kľúčový enzým podieľajúci sa na degradácii kolagénu typu I (katabolická dráha ECM) a jeho tkanivový inhibítor TIMP-1 podieľajúci sa na jeho regulácii, boli tiež hodnotené na úrovni proteínu a mRNA.

Výsledky odhalili, že polysacharidové aj oligosacharidové frakcie Ulva z EAE zvýšili celkovú syntézu kolagénu pri 1000 ug/ml (až o plus 2 percentá hodnotené testom Red sirius a významnými výsledkami okrem DEP-AD PP-UE). Tieto výsledky sa líšia od predchádzajúcej štúdie, kde surové van a ulvany s nízkou molekulovou hmotnosťou nemajú významný vplyv na celkovú syntézu kolagénu [37]. Naše výsledky sú však v súlade s predchádzajúcou prácou, ktorá ukázala, že polysacharidové prípravky bohaté na L-ramnózu (ROP) z kmeňov Klebsiella pneumonia stimulujú syntézu kolagénu[45]. Ľudské dermálne fibroblasty skutočne obsahujú lektínové miesto, ktoré je schopné rozpoznať -L-ramnózu [46]. Týmto spôsobom môže byť ramnózová časť ulvanovej frakcie rozpoznaná ľudským dermálnym fibroblastom a potom podporovať syntézu kolagénu. Najmä syntéza kolagénu typu I bola zvýšená pre všetky frakcie v ELISA (významné pre UE a DS-UE) a v testoch Western blot (NS). Tento výsledok je v súlade s predchádzajúcou literatúrou o hydrolyzovaných extraktoch Ulva pertusa [38] a depolymerizovaných galaktofukánoch (<10kda)from saccharina="" longicruris[47]="" which="" respectively="" increased="" the="" synthesis="" of="" type="" i="" pro="" and="" mature="" collagen.="" in="" our="" study,="" steady-state="" levels="" of="" col1al="" and="" col1a2="" were="" reduced="" after="" exposure="" to="" poly-and="" oligosaccharide="" ulva="" fractions(significant="" for="" col1a1="" at="" 1000="" ug/nnl="" for="" all="" fractions).expression="" in="" coordinated="" manner="" of="" col1al="" and="" col1a2="" genes="" complies="" with="" the="" fact="" they="" are="" both="" subunits="" of="" type="" i="" collagen="" protein="" [48].="" regulation="" between="" type="" i="" collagen="" protein="" production="" and="" mrna="" are="" different="" at="" the="" same="" observation="" time="" of="" 48="" h,="" which="" suggests="" a="" different="" potential="" time="" response="" regulation="" between="" protein="" and="" mrna[49].="" nevertheless,="" protein="" is="" the="" functional="" unit="" in="" ecm="" and="" exhibits="" an="" important="" increase="" after="" treatment="" with="" ulvans-derived="" eae="" fractions.="" col3a1="" mrna="" level="" expression="" was="" increased="" (significantly="" for="" ue="" and="" ds-ue="" at="" 1000="" ug/ml)="" and="" correlated="" to="" an="" ns="" increase="" of="" type="" iii="" collagen="" synthesis="" evaluated="" by="" wb.="" moreover,="" the="" results="" showed="" that="" polysaccharide="" uloa="" fractions="" from="" eae="" (ue="" and="" ds-ue)="" boosted="" significantly="" gags(sulfated="" and="" non-sulfated)="" synthesis="" at="" 1000="" ug/ml,="" while="" both="" oligosaccharide="" fractions="" had="" no="" effect.="" our="" observations="" are="" in="" partial="" accordance="" with="" the="" work="" of="" adrien="" etal.="" (2017)="" in="" which="" the="" increase="" in="" hyaluronic="" acid="" production="" in="" fibroblasts="" occurred="" with="" both="" ulvans="" extracts="" (crude="" and="" low="" molecular="" weight="" ulvans)="" [37].="">cistanche herbaV našej štúdii ulvany s nízkou molekulovou hmotnosťou skutočne nemali žiadny vplyv na produkciu GAG (vrátane nesulfátovaných GAG kyseliny hyalurónovej).

Keďže starnutie pokožky je charakterizované nerovnováhou zložiek ECM (znížené hladiny kolagénu typu I a II a GAG), poly- a oligosacharidové frakcie získané z Uloa sp. po liečbe EAE sú zaujímavé v stratégiách proti starnutiu, pretože stimulujú kolagény typu I a III a syntézu GAG.

Naše výsledky však poukázali aj na zvýšenie syntézy, aktivity a génovej expresie MP-1 v prítomnosti frakcií odvodených od poly- a oligosacharidu Uloa EAE. Nárast hladín MMP-1 mRNA koreloval so zvýšením syntézy MMP-1 v prítomnosti frakcií EAE odvodených od Ulonu a významne pre polysacharidové frakcie (UE a DS-UE). Nárast MMP Syntéza enzýmu -1 tiež súvisí s nevýznamným zvýšením aktivity MMP-1 v prítomnosti frakcií. Náš výsledok sa líši od predchádzajúcej literatúry, pretože hydrolyzované extrakty Uloa pertusa inhibovali expresiu a sekréciu MMP-1 v senescentných fibroblastoch[38] alebo polysacharidy obsahujúce fukózu (nazývané fukoidany) inhibovali UVB-indukovanú expresiu MMP-1 vo fibroblastoch ľudskej kože [50]. Náš výsledok je však v súlade so štúdiou FRioux et al. (2013), keďže surové galaktofukány (638-1529 kDa) zvýšili celkovú katalytickú aktivitu MMP (vrátane MMP-1) fibroblastov liečených počas 6 dní[47]. Naše údaje o zvýšení hladiny MMP sú tiež v súlade s prácou Andresa et al. (2006), keďže RROP (oligo- a polysacharidové prípravky bohaté na ramnózu z kmeňov Klebsiella pneumonia a K. planticola) upregulujú expresiu MMP-9 [45]Zvýšená syntéza MMP-1 normálne vedie k zníženiu ECM množstvo zložiek, ako je kolagén typu I, v dôsledku degradačnej aktivity MMP-1, ale v našej štúdii to nebolo zdôraznené, pretože došlo k zvýšeniu kolagénu typu I. Okrem toho frakcie odvodené od Uloa EAE nemali žiadny vplyv (zvýšenie alebo zníženie NS) na úroveň expresie mRNA a produkciu proteínu TIMP-1, tkanivového inhibítora MP-1 (okrem DEP-HD PP- UE s výrazným zvýšením bielkovín, s<0.05,at 1000="" μg/ml）.it="" appears="" that="" the="" anabolic/catabolic="" balance="" of="" ecm="" could="" be="" in="" favor="" of="" collagen="" synthesis="" despite="" mmp-1="" synthesis="" stimulation="" and="" activity.="" in="" this="" study,="" the="" authors="" thus="" showed="" that="" both="" poly-="" and="" oligosaccharide="" fractions="" derived="" from="" ulloa="" sp.="" after="" eae="" treatment="" are="" promoting="" fibroblast="" metabolism="" activity,="" ecm="" protein="" synthesis,="" and="" skin="" matrix="" renewal="" and="" remodeling,="" which="" is="" of="" interest="" for="" dermo-cosmetic="" applications="" in="" anti-aging="">

3.2. Úloha ulvanovej abundancie, sulfátového zloženia a molekulovej hmotnosti v modulácii ECM fibroblastov

Je známe, že štrukturálny znak ulvanov, ktorý zahŕňa stupeň sulfatácie, sulfatačný vzor, ​​zloženie monosacharidov, glykozidické väzby, stupeň vetvenia, ako aj jeho molekulová hmotnosť, ovplyvňuje jeho biologickú aktivitu [10,1,37,40,44,51 ].

Predchádzajúce štúdie ukázali, že molekulová hmotnosť bioaktívnych zlúčenín, ako sú polysacharidy alebo proteín, sa javí ako kľúčový faktor pre ich účinok na proliferáciu fibroblastov a moduláciu ECM [37,39,47]. V našej štúdii polysacharidové frakcie, UE a DS-UE, s vysokou molekulovou hmotnosťou (Mw > 670 kDa) zvýšili proliferáciu fibroblastov. Hoci oligosacharidové frakcie (Mw<10 kda)="" also="" raise="" fibroblast="" proliferation,="" a="" dep-ad="" pp-ue="" fraction="" with="" lower="" molecular="" weight="" (mw="" of="" 1.5="" kda)="" has="" lower="" activity="" than="" dep-hd="" pp-ue="" (mw="" of="" 8="" kda).="" similar="" results="" were="" obtained="" on="" fibroblasts="" treated="" with="" rrops,="" since="" lower="" rrops="" exhibited="" similar="" or="" lower="" proliferation="" activity="" compared="" to="" higher="" mw="" rrops[45].="" polysaccharide="" fractions="" treatment="" also="" enhanced="" gags="" synthesis,="" total="" and="" especially="" type="" i="" and="" iii="" collagen="" synthesis,="" mp-1="" synthesis="" by="" human="" skin="" fibroblasts,="" whereas="" oligosaccharide="" fractions="" (low="" molecular=""><10 kda)="" and="" in="" particular="" dep-ad="" pp-ue="" (1.5="" kda)="" have="" lower="" capacities.="" only="" dep-hdpp-ue="" stimulated="" significatively="" total="" collagen="" synthesis="" and="" mp-1="" synthesis,="" while="" dep-ad="" pp-ue="" with="" lower="" molecular="" weight="" had="" no="" significant="" boost="" effect.="" these="" results="" are="" in="" accordance="" with="" work="" of="" kidgell="" et="" al.="" (2020)="" where="" higher="" molecular="" weight="" ulvan="" fractions="" elicited="" a="" greater="" biological="" activity="" (immunomodulatory="" response)="" compared="" to="" lower="" mw="" van="" fractions[44].="" these="" results="" are="" also="" in="" agreement="" with="" work="" of="" bodin="" et="" al.="" (20),="" since="" enzymatic="" hydrolyzed="" proteins="" from="" uloa="" intestinalis="" did="" not="" stimulate="" ecm="" material="" biosynthesis="" (collagen="" and="" hyaluronic="">

Autori poukázali na to, že lepšia bioaktivita pri syntéze GAG ​​sa pripisuje frakciám sulfátovaných polysacharidov s vysokou molekulovou hmotnosťou obohatenou o surové ulvany. To by mohlo súvisieť s vnútorným zložením ulvanov v síranoch a ich molekulovou hmotnosťou, pretože oligosacharid Ulva sp. frakcie, čiastočne úplne bez sulfátov, nemajú schopnosť stimulovať syntézu GAG.rast penisu cistancheĎalšia štúdia o Ulku sp. ukázali dôležitosť stupňa ulvanovej sulfatácie na biologickú aktivitu, pretože chemicky sulfátovaná Alvanova frakcia, zdvojnásobený obsah sulfátu z natívneho polysacharidu, silne zvýšená antikoagulačná aktivita [10]Okrem toho DS-UE zvýšilo viac modulácie ECM, pokiaľ ide o GAG, celkový a typ I a Ⅲ kolagén syntéza v porovnaní s UE. Táto lepšia bioaktivita by mohla súvisieť s vyšším výskytom ulvanov a vyšším obsahom sulfátových skupín v dialyzovanej frakcii v porovnaní s inými frakciami.

Naše údaje ukázali, že poly- a oligosacharid Uloa sp. frakcie vykazovali rôzne metabolické aktivity, ktoré možno pripísať množstvu ulvanu, jeho stupňu sulfatácie a chemickej štruktúre. Táto práca tiež zdôraznila lepšiu aktivitu pre dodávky s vysokou molekulovou hmotnosťou zobrazujúce sulfátové skupiny. Skutočnosť, že polysacharidové frakcie bohaté na surové ulvany (tj nedepolymerizované) mali najväčší vplyv na metabolizmus fibroblastov ECM, je ideálna pre nadchádzajúce štúdie a ich budúce potenciálne aplikácie v dermo-kozmetickej starostlivosti, pretože minimálne spracovanie znižuje výrobné náklady a čas.

4. Materiály a metódy

4.1.Makroriasový materiál

Zelené morské riasy, Ulva sp. (Chlorophyta, Ulvales, Ullvaceae), pochádzal z prílivovej pláže Landrezac (47 stupňov 30 stupňov 17,9" N stupeň 2 stupeň 42 stupňov 37,1" O) v Sarzeau (Bretónsko, Francúzsko) 28. mája 2018 počas popoludnia pri odlive. Materiál bol premytý vodou z vodovodu, rozomletý na priemer 3 mm, zmrazený na-25 stupeň, lyofilizovaný (Alpha 1-4LSC, Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Osterode am Harz, Nemecko) a uskladnený v miestnosti teplota v tme.

4.2. Výroba a charakterizácia frakcií poly- a oligosacharidov

V predchádzajúcej práci Fourniere et al. (2019), bola opísaná podrobná produkcia poly- a oligosacharidových frakcií z extrakcie pomocou enzýmov (EAE) (pozri obrázok 9 a tabuľku 3)[36].

Aby sme to stručne zhrnuli, endo-proteáza Protamex[(Novozymes, Bagsverd, Dánsko) sa použila v množstve 6 percent (w/dw) na sušený Uloa sp. morské riasy. Enzymatická hydrolýza sa uskutočňovala 3 hodiny pri 50 stupňoch. Potom sa vodný extrakt podrobil etanolovému zrážaniu (1:5, v Fisher Scientific, Illkirch, Francúzsko) pri 4 stupňoch počas 244 hodín, aby sa získala frakcia bohatá na surové ulvany (UE).

Potom sa vyrobila frakcia DS-UE po dialýze frakcie bohatej na surový Evans (10 mg/ml) počas 7 dní pri 4 stupňoch (hranica 12-14 kDa, Spectra/Por94 Dialysis Membrane, Spectrum Laboratories, Fisher Scientific ,Illkirch, Francúzsko).

Dva depolymerizačné postupy (radikálová depolymerizácia pomocou H-OZ a depolymerizácia iónomeničovej živice) sa uskutočnili na etanolovom roztoku precipitátu z frakcie bohatej na surové ulvany (25 mg/ml). Na radikálovú depolymerizáciu sa použil peroxid vodíka (8 percent, obj./obj. , Fisher Scientific, Illkirch, Francúzsko) sa k roztoku primiešaval 24 hodín pri 50 stupňoch a produkt prešiel 48 hodinovou dialýzou pri 4 stupňoch (hranica 500-1000 Da, Biotech CE Tubing , Spectra/Por@, Fisher Scientific, IIllkirch, Francúzsko). Na kyslú depolymerizáciu sa živica Amberlite" FPC23H (ekvivalent 10 ml, Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Francúzsko) primiešala k roztoku počas 24 hodín pri 80 stupňoch a produkt sa neutralizoval NaOH (0,1 a 1 M) a potom sa podrobil 48 hodinám. dialýza pri 4 stupňoch (hranica 500-100 Da, Biotech CE Tubing, Spectra/Por", Fisher Scientific, Illkirch, Francúzsko).výhody cistanche salsaTieto dva postupy viedli k oligosacharidovým frakciám nazývaným DEP-HD PP-UE a DEP-AD PP-UE pre H2OZ a postup s kyslou živicou.

Všetky frakcie boli lyofilizované (Alpha 1-4LSC, Martin Christ Gefriertrocknungsanla-gen GmbH, Osterode am Harz, Nemecko) a pred analýzou uložené pri 4 stupňoch. Charakterizácia týchto frakcií: distribúcia molekulovej hmotnosti polysacharidu pomocou vysokotlakovej vylučovacej chromatografie (HPSEC, UHPLC Ultimate 300, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), biochemické zloženie, zloženie monosacharidov pomocou vysokoúčinnej aniónovo-výmennej chromatografie s pulznou amperometriou detekcia (HPAEC-PAD, Dionex" ICS-5000* DC, Thermo Fisher Scientific, Illkirch, Francúzsko) a hmotnostná spektrometria letu s laserovou desorpciou za pomoci matrice (MALDI-TOF, Bruker, Billerica, Waltham, MA , USA) boli tiež vykonané v predchádzajúcej štúdii [36].

4.3. Bunková kultúra

Vzorky ľudských dermálnych fibroblastov boli poskytnuté "Laboratoire Interactions Ep-itheliums Neurones" (LIEN, EA 4685), Brest, Francúzsko. Ľudské dermálne vzorky boli získané z biopsií kože zdravých darcov podstupujúcich abdominoplastiku. Štúdia bola vykonaná v súlade s Helsinskou deklaráciou a všetci pacienti podpísali formulár dohody o informovanom súhlase. Zbierky vzoriek sa riadili miestnou dohodou ("Comite de protection des personnes" Ouest VI) a sú uvedené pod DC 2016-2833.

Normálne ľudské dermálne fibroblasty (NHDF) boli kultivované v Dulbeccovom modifikovanom eagle médiu (DMEM, Lonza, Bazilej, Švajčiarsko) s 10 percentami (v/v) fetálnym hovädzím sérom (FBS, Gibco, Fisher Scientific, Illkirch, Francúzsko ), 1-percentný roztok antibiotika (v/v) (penicilín, streptomycín 10, 000 U/ml, Gibco, Fisher Scientific, Illkirch, Francúzsko) a 1-percentný antimykotikum (v/v) (Fungizone, amfotericín B, Gibco, Fisher Scientific, Illkirch, Francúzsko), v inkubátore s kontrolovanou teplotou s 5 percentami CO2 pri 37 stupňoch (Forma Steri-Cyclei160, Thermo Fisher Scientific Langenselbold, Nemecko). Bunky sa subkultivovali trypsinizáciou (0,05 percenta) a roztokom EDTA (kyselina etyléndiamíntetraoctová) ((Gibco, Fisher Scientific, Illkirch, Francúzsko) po dosiahnutí konfluencie. Všetky experimenty sa uskutočnili medzi 3. a 8. pasážou.

Bunky boli nasadené na 96-jamkové mikrodoštičky v hustote 400 buniek/jamku pre testy WST-1 a LDH (laktátdehydrogenáza) na 12-jamkové platne, v hustote 5{{8 }} buniek/jamku na farbenie Red sirius a Blue Alcian a test RT-qPCR a na 6-jamkové platne v hustote 200 000 buniek/jamku pre testy ELISA a Western blot.

Vo všetkých experimentoch sa po dosiahnutí 80 percent konfluencie bunky inkubovali v DMEM s 2 percentami FBS v neprítomnosti alebo prítomnosti poly- a oligosacharidových frakcií počas 48 hodín pri 50 a 1000 ug/ml.

4.4. Test bunkovej proliferácie WST-1

WST-1, in vitro, test je založený na konverzii tetrazóliovej soli WST-1 (4-[3-(4-lodofenyl){{5 }}(4-nitrofenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzéndisulfonát) na formazán (oranžové farbivo) bunkovými mitochondriálnymi dehydrogenázami. Zmena farby je priamo úmerná životaschopnosti a proliferácii buniek v kultúre.

Po 48 hodinách inkubácie sa médium odstránilo a pridalo sa 100 ul činidla WST-1 (súprava na proliferáciu buniek WST-1, Roche Diagnostics, Meylan, Francúzsko; riedenie 1:40 v DMEM s 2 percentami FBS). pridávaný do každej jamky. Po 45 minútach inkubácie pri 37 stupňoch s 5 percentami CO2 sa merala absorbancia pri 450 proti 630 nm pomocou čítačky mikrodoštičiek (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Fínsko). 4.5. Test cytotoxicity LDH

Test LDH cytotoxicity je založený na meraní laktátdehydrogenázy (LDH), čo je stabilný cytosolický enzým, ktorý sa uvoľňuje pri lýze buniek. Uvoľnený LDH v kultivačných supernatantoch sa meria konverziou tetrazóliovej soli (jódnitrotetrazóliová fialová) na červený formazanový produkt.cistanche tubulosa dávkovanie redditNamerané množstvo červeného formazanu je úmerné počtu lyzovaných buniek.

Test LDH (CytoTox96@, Promega, Madison, WI, USA) sa uskutočnil podľa pokynov dodávateľa. Pozitívna kontrola (maximálne uvoľnenie LDH) sa uskutočnila pridaním 10 ul lyzačného roztoku 10x (Triton X-100 pri 0,8 percentách) počas 45 minút pred pridaním činidla CytoTox969. Po inkubácii sa 50 μl supernatantu bunkovej kultúry prenieslo na novú 96-jamkovú mikroplatničku （nesterilnú）. Potom sa pridalo 50 ul činidla CytoTox96 stupňa. Mikroplatnička sa inkubovala 30 minút pri teplote miestnosti v tme. Potom sa reakcia zastavila pridaním 50 ul "Stop roztoku". Uvoľňovanie LDH sa meralo kvantifikáciou absorbancie pomocou čítačky mikrodoštičiek pri 490 nm (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Fínsko).

4.6. Farbenie alciánovou modrou na kvantifikáciu glykozaminoglykánov

Farbenie alciánovou modrou je metóda farbenia, ktorá umožňuje kvantifikovať dva typy glykozaminoglykánov (GAG): sulfátované (heparán sulfát, keratán sulfát, chondroitín sulfát a dermatan sulfát) a nesulfátované (kyselina hyalurónová). Roztok alciánovej modrej pri pH 1 farbí sulfátované GAG, zatiaľ čo roztok pri pH 2,5 farbí nesulfátované GAG.

Na konci inkubácie sa kultivačné médium odstránilo a bunky sa dvakrát premyli PBS IX (Fisher Scientific, Illkirch, Irance). Potom sa bunky premývali 5 minút 0,1N HCl (pH1, Fisher Scientific, Illkirch, Francúzsko) alebo 3M kyselinou octovou (pH 2,5, Fisher Scientific, Illkirch, Francúzsko), aby sa znížilo pH a odhalia sulfátované a nesulfátované glykozaminoglykány. Potom boli bunky zafarbené 1% alciánovou modrou (8GX, Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Francúzsko) v roztoku HC10,1 N (pH 1) alebo v 3% roztoku kyseliny octovej (pH 2,5) počas 30 minút. Bunky sa dvakrát premyli vodou z vodovodu počas 5 minút, vysušili sa pod kapotou a prepláchli sa destilovanou vodou počas 5 minút. Potom sa viazané farbivo solubilizovalo s roztokom guanidín hydrochloridu 6M (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Francúzsko) počas 5 minút za miešania pri teplote miestnosti. Farebný roztok bol prenesený na novú 96-jamkovú mikroplatničku a meranie absorbancie bolo uskutočnené pri 600 nm (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Fínsko).

4.7. Farbenie červeným Siriusom na kvantifikáciu celkového kolagénu

Postup farbenia Red Sirius umožňuje kvantifikáciu celkového kolagénu. Picrosirius red, silné lineárne aniónové farbivo obsahujúce šesť sulfonátových skupín, sa spája pozdĺž katiónových kolagénových vlákien.

Po inkubácii sa kultivačné médium odstránilo a bunky sa dvakrát premyli PBS IX (Fisher Scientific, Illkirch, Francúzsko). Potom sa do každej jamky pridal 1 ml Bouinovho roztoku Gigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Francúzsko) a bunky sa farbili 1 hodinu pri teplote miestnosti. Potom boli bunky dvakrát premyté destilovanou vodou a vysušené pod kapotou. Bunky boli zafarbené 1 ml roztoku Red Sirius (Sirius Red 80 vo vodnom nasýtenom roztoku kyseliny pikrovej, Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Francúzsko) počas 1 hodiny. Po zafarbení sa roztok odstránil a bunky sa postupne premyli destilovanou vodou a HC10,01 N, aby sa odstránilo nenaviazané farbivo. Naviazané farbivo sa solubilizovalo s NaOH0,1N počas 30 minút. Farebný roztok sa preniesol na novú 96-jamkovú mikroplatničku a vykonalo sa odčítanie absorbancie pri 550 nm (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Fínsko). 4.8. Kolagén typu I a MMP{17}} ELISA

Po inkubácii sa bunky dvakrát premyli PBS IX (Fisher Scientific, Illkirch, Francúzsko). Fibroblasty boli lyzované v pufri RIPA (rádioimunoprecipitačný test) (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Francúzsko) doplnenom kokteilom inhibítorov proteázy (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Francúzsko) pri 4 stupňoch počas 1 hodiny. Bunky sa zoškrabali a vzorky sa vortexovali 30 minút a centrifugovali sa (12,00xg počas 30 minút pri 4 stupňoch). Supernatanty obsahujúce intracelulárne proteíny sa zhromaždili a potom sa skladovali pri -80 stupni až do analýzy na stanovenie proteínu a analýzu Western blot. Koncentrácia proteínu bola stanovená pomocou Pierce BCA Protein Assay (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) s použitím bovinného sérového albumínu (BSA) ako štandardu.

Supernatant bunkovej kultúry sa zhromaždil a odstredil, aby sa odstránili zvyšky buniek (200 x g počas 10 minút pri 4 stupňoch) a skladovali sa pri -80 stupňoch až do analýzy.

Merania kolagénu typu I a MMP-1 boli vyhodnotené v kultivačných médiách pomocou súprav Abcam (ab210966 Human Pro-Collagen I alpha 1 SimpleStep ELISA Kit a ab215083 Human MMP1 SimpleStep ELISA Kit, Cambridge, MA, USA) podľa pokynov výrobcu . Absorbancia sa merala pri 450 nm pomocou čítačky mikrodoštičiek (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Fínsko). Výsledky boli normalizované s predtým stanovenými koncentráciami bunkových proteínov. 4.9. Western BlotExtrakcia vzoriek proteínov bola opísaná v predchádzajúcej časti 4.8. Vzorky proteínov s pufrom Laemmli (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Francúzsko) sa varili 5 minút pri 95 stupňoch a potom sa centrifugovali pri 16, 000 x g počas 1 minúty. Rovnaké množstvá proteínu (10 ug) boli naplnené do jamiek so 7,5 percentami alebo 4-15 percentami TGX Stain-Free gélu (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Francúzsko), spolu s Precision Plus Protein "Nezafarbený proteín štandard (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Francúzsko). Prenos proteínu z gélu na mini PVDF (polyvinylidénfluoridovú) membránu (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Francúzsko) sa uskutočnil pomocou Trans-Blot Turbo Transfer System (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Francúzsko ). premyté TBST. Membrána bola testovaná kolagénom typu I (Novotec, Reuver, Holandsko), kolagénom typu III (Novotec, Reuver, Holandsko), MMP-1 (EnoGene, New York, NY, USA) alebo TIMP{{43 }} (RayBiotech, Peachtree Corners, GA, USA) protilátky; potom sa niekoľkokrát premyla s TBST a inkubovala sa 1 hodinu pri teplote miestnosti so sekundárnymi protilátkami konjugovanými s peroxidázou (Jackson ImmunoResearch, Ely, UK). Potom sa použil čistý Western ECL substrát (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Francúzsko). aplikovaný na 5 minút na membrány a odhalenie sa uskutočnilo pomocou ChemiDoc XRS plus Molecular Imager (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Francúzsko). Hladina proteínu bola kvantifikovaná pomocou softvéru ImageLab v6.01.1.

4.10.Zymografia

Zymografia sa uskutočnila na analýzu aktívnej formy kolagenázy MMP-1 podľa Inanca et al. (2017) upravená metóda [52].

Gély SDS-PAGE (10 percentný polyakrylamid, Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Francúzsko) boli kopolymerizované s 1 mg/ml kolagénu typu I z potkanieho chvosta Gibco, Fisher Scientific, Illkirch, Francúzsko. ​​Proteín vzorky (5 ug) sa zmiešali s neredukujúcim vzorkovým pufrom (62,5 mM Tris HCl pH 6,8, 20 percent glycerolu, 4 percent SDS, 0,01 percenta brómfenolová modrá), centrifugovali 1 minútu pri 4 stupňoch, naplnili do jamiek gélu spolu s Precision Plus Protein" All Blue Standards (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Francúzsko) a potom elektroforézou pri 110 V pri 4 stupňoch počas 2 hodín Gél sa dvakrát premyl v 2,5 percentnom Tritone X{{26 }} (objem/objem) vždy 15 minút, aby sa odstránil SDS. Potom sa gél inkuboval v Zymogram Development Buffer (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Francúzsko) počas 48 hodín pri 37 stupňoch.Po inkubácii gél sa farbil 1 hodinu 0,5 percentným roztokom Coomassie Blue R-250 (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Francúzsko) (w/v) a potom sa odfarbil v 40 percentách metanolu a 10 percentách ľadovej kyseliny octovej Riešenie (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Francúzsko). Aktivita MMP-1 bola detekovaná ako číry pás na pozadí gélu zafarbeného Coomassie Blue. Kvantifikácia sa uskutočnila na vykonanom ChemiDoc XRS plus Molecular Imager (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Francúzsko) so softvérom Image Lab verzie 6.01.1 (Bio-Rad). 4.11. Izolácia RNA a RT-PCR v reálnom čase

Po 48 hodinách inkubácie bola celková RNA extrahovaná TRIzolom (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) a chloroformom (Acros Organics, Fisher Scientific, Illkirch, Francúzsko), vyzrážaná izopropanolom (Fisher Scientific, Illkirch, Francúzsko), premytá etanolom 75 percent, vysušené pod kapotou pred resuspendovaním vo vode upravenej DEPC (dietylpyrokarbonát) (Fisher Scientific, IIlkirch, Francúzsko). Množstvo RNA a úroveň čistoty (medzi 1,8 a 2.0) boli odhadnuté meraním absorbancie na čítačke mikrodoštičiek (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Fínsko) pri 260 a 280 nm s použitím kvapkovej TM platne (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).

Jeden mikrogram celkovej RNA bol ošetrený DNaseI (iScript Dnase Master Mix, Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Francúzsko) počas 5 minút pri 25 stupňoch, aby sa odstránili kontaminanty DNA. Enzým bol inaktivovaný počas 5 minút pri 75 stupňoch.

Reverzná transkripcia sa uskutočnila na 1 ug celkovej RNA, predtým ošetrenej DNázou I, s použitím iScript Reverse Transscription (RT) Supermix (Bio-rad, Marnes-La-Coquette, Francúzsko). Kroky pre syntézu cDNa boli 5 minút pri 25 stupňoch 20 minút pri 46 stupňoch a 1 minútu pri 95 stupňoch.

Do experimentov PCR boli zahrnuté kontroly bez šablóny. qPCR sa uskutočnila v 96-jamkových doštičkách s celkovým objemom 20 μl obsahujúcich 1 ul 1∶15 zriedených vzoriek cDNA z RT, 1 μl priméru（pozri tabuľku 4, Bio-Rad, Marnes -La-Coquette, Francúzsko), 10 μl iTaq Universal SYBR Green Supermix （Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Francúzsko） a 8 μl vody bez nukleázy. Podmienky amplifikácie boli 2 minúty pri 95 stupňoch, po ktorých nasledovalo 40 cyklov 5 s pri 95 stupňoch a 30 s pri 60 stupňoch a skončili sa 5 s pri 95 stupňoch a 5 s pri 65 stupňoch pred protokolom pre krivku topenia: zvýšenie o 0,5 stupňa zo 65 stupňov na 95 stupňov. Experimenty PCR sa uskutočnili na systéme CFX 96 (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Francúzsko) a výsledky sa získali zo softvéru Bio-Rad CFX Manager v3.1 (Marnes-La-Coquette, Francúzsko). Množstvo mRNA sa normalizovalo na mRNA RPL13A a analýza relatívnej génovej expresie sa vypočítala pomocou 2-AACt metódy.

4.12. Štatistická analýza

Všetky hodnoty boli vyjadrené ako priemer n experimentu ± štandardná chyba (SE).

Štatistické analýzy boli vykonané pomocou Addinsoft (2020). Vyhodnotenie normálnej distribúcie dát bolo hodnotené pomocou Shapiro-Wilkovho testu. Významné rozdiely medzi kontrolnými a experimentálnymi vzorkami boli analyzované Studentovým-t-testom (nezávislý, obojstranný), keď došlo k normálnej distribúcii, a Mann-Whitneyho testom, keď bola normálna distribúcia zamietnutá. Významné rozdiely v porovnaní s kontrolou podľa štatistického testu sú označené hviezdičkami (*str<><0.01 and=""><0.001). differences="" that="" are="" not="" statistically="" significant="" are="" named="" "ns"="" in="" the="" text="" and="" are="" characterized="" by="" the="" absence="" of="" asterisks="" on="" the="">

5. Závery

Táto práca ukazuje, že poly- a oligosacharidové frakcie, obohatené o ulvany, získané po zelenej novej technológii EAE zo zelených morských rias Uloa sp., ovplyvňujú proliferáciu fibroblastov, syntézu proteínov ECM, obnovu matrice a remodeláciu. Potenciálne uplatnenie v kozmetických stratégiách proti starnutiu by sa mohlo objaviť, pretože starnutie pokožky je charakterizované znížením syntézy kolagénu. Obnova matrice pokožky je teda v tomto kontexte prospešná. Tak, ulvans, z Ulva sp. frakcie získané po EAE sú biologicky aktívne na metabolizmus fibroblastov ľudskej kože. Autori naznačujú, že táto aktivita je funkciou množstva ulvanov, zloženia síranov a molekulovej hmotnosti frakcií. Autori predpokladajú, že tieto molekuly bohaté na sulfátovanú ramnózu zodpovedajú signálnym molekulám, ktoré sú rozpoznávané lektínovými miestami membránových fibroblastov a následne stimulujú ich metabolickú aktivitu z anabolického aj katabolického hľadiska. Na hlboké posúdenie molekulárneho mechanizmu aktivovaného poly- a oligosacharidom Ulou sp. frakcie na úrovni transkripčných faktorov, penetračnú kapacitu ulvanov s vysokou a nízkou molekulovou hmotnosťou v 3D modeloch kože alebo ex vivo explantátov kože a potvrdzujú tieto výsledky modulácie ECM s frakciami odvodenými od Uloa EAE v týchto modeloch ako cieľ proti starnutiu.

Tento článok je prevzatý z Mar. Drugs 2021, 19, 156. https://doi.org/10.3390/md19030156 https://www.mdpi.com/journal/marinedrugs