Ďalšie hodnotenie šalvie Haenkei ako inovatívnej stratégie na boj proti fotostarnutiu pokožky a obnovenie integrity bariéry

Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPre viac informácií

abstrakt:Koža je základnou bariérou ľudského tela, ktorá plní viacero funkcií. Endogénne faktory v zhode s vonkajšími vplyvmi neustále ovplyvňujú integritu pokožky, čo vedie k výrazným štrukturálnym zmenám, ktoré ovplyvňujú nielen vzhľad pokožky, ale aj jej rôzne fyziologické funkcie. Zmeny bariérových funkcií vedú k zvýšenému riziku vzniku ochorení a vedľajších reakcií, preto je evidentný význam zachovania integrity epidermálnej bariéry a spomalenia procesu starnutia pokožky.rast penisu cistancheSalvia hankie (SH) bola nedávno identifikovaná ako potenciálne činidlo proti starnutiu; jeho extrakt je schopný znížiť úroveň starnúcich buniek ovplyvnením uvoľňovania ll.1a a znížením tvorby reaktívnych foriem kyslíka (ROS). V tejto štúdii bol extrakt SH testovaný na bunkovej línii ľudských keratinocytov (HaCaT) vystavených stresovým faktorom súvisiacim s predčasným starnutím buniek, ako sú voľné radikály a ultrafialové B žiarenie. Potvrdili sme, že SH pôsobí ako zachytávač ROS a zistili sme jeho schopnosť obnoviť integritu kožnej bariéry posilnením štruktúry cytoskeletu, utesnením tesných spojení a zvýšením rýchlosti migrácie buniek. Vzhľadom na tieto výsledky sa táto práca stáva relevantnou a identifikuje Salvia hankie ako zlúčeninu užitočnú na ošetrenie pokožky proti starnutiu pri klinickom výkone.

Ak chcete vedieť viac, kliknite sem

Úvod

Zdravá a fungujúca pokožka je nevyhnutná na ochranu pred dehydratáciou a prenikaním rôznych druhov proti 100 percentám, mikroorganizmom, alergénom, dráždivým látkam a žiareniu. Každodenná expozícia vonkajším faktorom v kombinácii s niektorými vnútornými faktormi, ako je genetika, bunkový metabolizmus, hormóny a metabolické procesy, vedie k prirodzenému starnutiu pokožky [1]. Fenomén starnutia kože vo veľkej miere súvisí s ultrafialovým žiarením, znečistením, opakovaným namáhaním svalov a gravitáciou [2, 3]. Starnutie kože je preto výsledkom kumulatívnych štrukturálnych a fyziologických zmien a progresívnej modulácie vrstiev kože [2, 4, 5]. Aj keď starnutie nie je považované za patologický stav, ale skôr za biologický a nevyhnutný proces, jeho korelácia s rôznymi kožnými ochoreniami je teraz dobre známa. Vzhľadom na to, že najrelevantnejšími kožnými chorobami súvisiacimi s vekom sú degeneratívne poruchy, benígne a malígne novotvary atď., dôležitosť starostlivosti o pleť pri liečbe alebo prevencii určitých kožných porúch je evidentná.[6-8]. V súčasnosti pôsobia stratégie proti starnutiu pleti na zvrátenie dermálnych a epidermálnych príznakov foto/chronologického starnutia. Na základe ich prístupov ich možno klasifikovať nasledovne: kozmetologická starostlivosť, lokálne prostriedky, invazívne zákroky, systémové prostriedky, vyhýbanie sa exogénnym faktorom starnutia, úprava životného štýlu a návykov a preventívna medicína [9]. Existujú dve hlavné skupiny látok, ktoré možno použiť ako zložky prípravkov proti starnutiu: 1. Regulátory buniek, ako je retinol, peptidy a rastové faktory, priamo pôsobiace na metabolizmus a produkciu kolagénu; 2. Antioxidanty, ako vitamíny, polyfenoly a flavonoidy, sú schopné znižovať degradáciu kolagénu [9].

Podstatné dôkazy podporujú myšlienku, že starnutie kože je poháňané najmä ROS, ktorý vzniká počas endogénneho oxidačného bunkového metabolizmu [10,11]. Je známe, že akumulácia ROS je zodpovedná za poškodenie buniek vrátane peroxidácie lipidov, poškodenia membránových proteínov a mutácie DNA, ktoré vedú k štrukturálnym a funkčným zmenám kože. V priebehu času ľudské bunky podporujú prirodzený nárast hladín ROS, spojený s čiastočnou stratou antioxidačnej obranyschopnosti. Tento nevyhnutný stav je ďalej podporovaný denným ultrafialovým ožiarením (UVR), ktoré indukuje syntézu matricových metaloproteináz (MMP) a následne deštrukciu kolagénu sprostredkovanú MMP [12, 13]. Štúdie in vivo preukázali kauzálny vzťah medzi mitochondriálnym oxidačným poškodením, bunkovou senescenciou a fenotypmi starnutia [10, 14].

Bunková senescencia je definovaná ako stabilné zastavenie bunkového rastu, ku ktorému dochádza vo všetkých ľudských bunkách počas starnutia [15-17]. V dôsledku stresujúcich udalostí, ako je nadmerná expresia onkogénu, tvorba ROS a poškodenie DNA (napríklad indukované UVR, najmä UVB svetlom), môžu bunky predčasne zostarnúť [18].výhody cistanche salsaV tomto scenári sa zdá zrejmá dôležitosť vývoja inovatívnych stratégií schopných zabrániť akumulácii starnúcich buniek alebo ich selektívne zabíjať, a tak pôsobiť proti starnutiu a poruchám súvisiacim so starnutím. Nedávno sme identifikovali Salvia hankie (SH), bolívijskú rastlinu bohatú na vitamín B a antioxidačné vlastnosti, ako potenciálne činidlo proti starnutiu [18].

Je dobre známe, že akumulácia starnúcich buniek v priebehu času je jedným z najdôležitejších mechanizmov, prostredníctvom ktorých tkanivá podstupujú proces starnutia, ktorý sa zdá byť v zásade spúšťaný pretrvávaním typického zápalového stavu. V skutočnosti, napriek tomu, že starnúce bunky nie sú schopné proliferovať, majú vysokú metabolickú aktivitu a účinne produkujú niekoľko prozápalových molekúl [19]. Použitím modelu ľudskej pokožky (EpiSkin) sa skutočne preukázalo, že extrakt SH znižuje hladiny starnúcich buniek ovplyvnením uvoľňovania ILla a znížením tvorby ROS [18].

V homeostatických podmienkach je pokožka účinnou bariérou, ktorá chráni pred vonkajšími vplyvmi a endogénnymi faktormi a reguluje stratu tekutín, elektrolytov a bielkovín. Táto dôležitá úloha sa pripisuje najmä epiderme, dynamickému, vysoko vrstvenému epitelu. Dve hlavné zložky epidermis sú stratum corneum, vonkajšia vrstva a tesné spojenia (TJ), medzibunkové spojenia, ktoré utesňujú priľahlé keratinocyty v stratum granulosum [20]. Bunkové adhézie sú nevyhnutné na udržanie integrity epidermálnej bariéry.cistanche tubulosa dávkovanie redditTúto dôležitú funkciu plnia špecializované bunkové spojenia: adherentné spojenia (AJ), desmozómy a tesné spojenia. Tieto štruktúry umožňujú nielen fyzické spojenie medzi bunkami, ale celkovo organizujú cytoskeletálne prvky a modulujú signálne dráhy zapojené do vývoja tkaniva, štruktúry a fyziológie. Nedávne genetické štúdie neočakávane odhalili nekanonickú úlohu junkčných proteínov, čím poukázali na dôležitosť junctional crosstalk, vzájomných závislostí a kompenzácie na umožnenie robustnosti tkaniva [21].

Tu sme študovali aktivitu extraktu zo šalvie haenkei, aby sme pochopili molekulárny mechanizmus zodpovedný za jeho ochranné účinky na foto/chronologické starnutie pokožky. Z tohto hľadiska boli ľudské spontánne imortalizované keratinocyty (HaCaT) použité ako in vitro model a mechanizmus účinku SH bol analyzovaný v základnom režime, ako aj v stresových podmienkach vyvolaných žiarením H202 a / alebo UVB.

VÝSLEDKY

Bezpečný profil SH extraktu a vlastnosti proti starnutiu Oxidačný stres v koži hrá hlavnú úlohu v procese starnutia a v patogenéze niekoľkých kožných porúch [22]. Matic a spol. už preukázali anti-senescenčnú aktivitu Salvia haenkei, ktorá tiež korelovala s jej zachytávacími vlastnosťami [18]. Tieto ochranné účinky by sa mohli využiť na vývoj nového ošetrenia na opravu pokožky schopného zachovať integritu bariéry. S cieľom hĺbkovo preskúmať vlastnosti SH bola najprv overená aktivita extraktu na životaschopnosť buniek a tvorbu ROS v bunkovom modeli HaCaT.

Cistanche môže proti starnutiu

Test životaschopnosti buniek sa uskutočnil na riešenie možných cytotoxických účinkov extraktu zo Salvia haenkei na keratinocyty. HaCaT bunky boli ošetrené SH extraktom （0.01-10 ug/ml） počas 24 a 48 hodín. Životaschopnosť buniek bola hodnotená vylučovacím testom s trypánovou modrou. Obrázok 1A a 1B ukazuje, že ošetrenie SH extraktom neovplyvňuje životaschopnosť buniek, čo potvrdzuje bezpečnostný profil extraktu na HaCaT bunkách za použitých experimentálnych podmienok.

Aktivita extraktu Salvia haenkei na tvorbu ROS bola testovaná v HaCaT bunkách po 3-24 hodinách liečby a pred a po expozícii H2O2.

Výsledky na obrázku 2A ukazujú, že SH je schopný znížiť bazálne hladiny ROS v bunkách, najmä počas 3-hodinovej doby liečby. Okrem významného zvýšenia hladín ROS po stimulácii H-Oz (obrázok 2C) je SH schopný zabrániť produkcii ROS. Extrakt SH (0,01 ug/ml) významne znížil (-25 percent) tvorbu ROS vyvolanú oxidačným stimulom (obrázok 2B), čo ukazuje účinok porovnateľný s NAC po 3 hodinách liečby. 24-hodinová liečba SH sa javí ako účinnejšia proti prírastku ROS pri výraznom znížení hladín ROS pri 1 a 10 ug/ml (obrázok 2B). Tieto výsledky potvrdzujú Salvia haenkei

antioxidačné účinky, ako už bolo pozorované [18], vykazujú antioxidačný bazálny účinok už od krátkych ošetrení; účinok pri prevencii zvýšenia vyvolaného oxidačným stimulom je najrelevantnejší pre dlhšie doby liečby.

Uvádza sa, že ultrafialové žiarenie vyvoláva zvýšenie intracelulárnych hladín ROS v ľudskej koži, čo spôsobuje poškodenie a predčasné starnutie a iné patológie [23-25]. Preto sa hodnotil účinok SH extraktu na produkciu ROS sprostredkovanú UVB. Ako sa očakávalo, výsledky na obrázku 3C ukazujú významné zvýšenie intracelulárnych hladín ROS po stimulácii UVB. Liečba SH, ktorá vyvoláva tendenciu znižovať bazálne hladiny ROS v bunkách (obrázok 3A), je schopná zabrániť zvýšeniu indukovanému stimuláciou UVB (obrázok 3B). 3 hodiny liečby SH vyvolávajú tendenciu znižovať hladiny ROS; dlhšie ošetrenie SH je účinnejšie v boji proti oxidačnému stresu, pričom vykazuje významný pokles, ako je uvedené na obrázku 3A. Tieto údaje podčiarkujú antioxidačnú aktivitu šalvie haenkei aj pri oxidačnom strese sprostredkovanom UVB.

Ako už bolo spomenuté, stále viac dôkazov naznačuje, že starnúce bunky sa hromadia v chronologicky a fotostarnutej koži, čo prispieva k kožným zmenám a patologickým stavom súvisiacim s vekom [26]. Účinok Salvia hankie bol preto hodnotený na markeroch starnutia p21 a p27 (ktoré zabraňujú fosforylácii proteínu retinoblastómu (Rb) a s inhibičnou aktivitou na CDK2-cyklín E, v tomto poradí [27]) po fotostrese vyvolanom ultrafialové žiarenie. Výsledky na obrázku 4 ukazujú, že UVB ožarovanie indukuje významné zvýšenie hladín p21 a p27 mRNA v porovnaní s nestimulovanou kontrolou.cistanche แอ ม เว ย์Podobný trend v prevencii zvýšenia sa pozoruje v bunkách ošetrených SH. SH 1 ug/ml vyvoláva významné zníženie hladín p21 v porovnaní s kontrolou stimulovanou UVB, zatiaľ čo ostatné koncentrácie vyvolávajú tendenciu k zníženiu (obrázok 4A). Hladiny P27 sú významne znížené predliečením SH 0.01, 0,1 a 10 ug/ml (obrázok 4B).

Zistilo sa tiež, že senescentné bunky negatívne ovplyvňujú mikroprostredie vylučovaním prozápalovej zmesi chemokínov, cytokínov, rastových hormónov a proteáz, známych ako senescenčný sekrečný fenotyp (SASP) [28]. Výsledky na obrázku 5 ukazujú, že UVB stimulácia indukuje významné zvýšenie hladín ILla (A), IL6(B) a IL18(C) mRNA vzhľadom na nestimulovanú kontrolu. Predbežná liečba SH predstavuje silnú aktivitu v boji proti zvýšeniu hladín cytokínov. Ako je znázornené na obrázku 5A, SH 10 ug/ml významne znížilo hladiny ILla; zvýšenie IL6 je významne ovplyvnené SH 0 0,01, 0,1 a 10 ug/ml (obrázok 5B), zatiaľ čo všetky testované koncentrácie sú schopné významne znížiť hladiny IL18 (obrázok 5C). Udržiavanie kožnej bariéry Vzhľadom na vyššie uvedené výsledky na epitelovej bunkovej línii sa hodnotil účinok SH extraktu na niekoľko proteínov a procesov zapojených do udržiavania kožnej bariéry a opravy poškodenia tkaniva.

Sirtuin{0}} výraz

Niekoľko štúdií in vitro uvádza, že UVB žiarenie indukuje zníženie hladín proteínu Sirtuinl (SIRT1) v ľudských fibroblastoch, čo naznačuje zapojenie SIRT1 do poškodenia sprostredkovaného UVB [29]. Účinok extraktu zo Salvia haenkei na expresiu proteínu Sirtuinl bol teda hodnotený testom western blot (obrázok 6). Ako sa očakávalo, UVB stimulácia vyvolala významný pokles expresie proteínu SIRTI v HaCaT bunkách. Preto sa skúmala aktivita SH extraktu na hladiny SIRT1. Je zaujímavé, že výsledky ukazujú, že 1 ug/ml SH extraktu v porovnaní s kontrolou vyvolalo zvýšenie expresie SIRTl (plus 40 percent) za bazálnych podmienok, čo naznačuje potenciálny stimulačný účinok na hladiny SIRT1. Ako sa očakávalo, UVB stimulácia vyvoláva významné zníženie hladín SIRT1. Výsledky ukazujú, že predbežné ošetrenie 0,01 ug/ml SH extraktu vykazuje zlepšujúci účinok na hladiny sirtuínu 1 v porovnaní s kontrolou ošetrenou UVB.

Test hojenia rán

Keratinocyty sú hlavnými zložkami epidermis, ktoré tvoria bariéru medzi organizmom a prostredím. Preto ich proliferácia a migrácia zohrávajú kľúčovú úlohu pri udržiavaní účinnej bariéry a pri hojení rán po úrazoch [30, 31]. Hodnotil sa teda účinok SH na migráciu HaCaT buniek. Obrázky na obrázku 7A ukazujú, že ošetrenie SH vedie k zníženiu hrúbky škrabanca, čo naznačuje účinok na migráciu HaCaT buniek. Obrázok 7B uvádza konštrukciu kymogramu rýchlosti migrácie HaCaT buniek; obrázky ukazujú zvýšenie bunkovej migrácie závislé od koncentrácie. Graf na obrázku 7C ukazuje významné zvýšenie rýchlosti migrácie buniek po 4-8 hodinách ošetrenia 0,01 ug/ml SH extraktu. Maximálny nárast sa dosiahne v intervale 8-12 hodín, kde je rýchlosť migrácie buniek približne 165 percent v porovnaní s kontrolou. Tieto údaje, ako aj výsledky získané o bunkovej proliferácii, naznačujú, že najnižšia koncentrácia SH extraktu je schopná vyvolať zvýšenie rýchlosti bunkovej migrácie nesúvisiace s hyperproliferatívnym fenotypom.

Údržba tesných spojov

Rovnako ako stratum corneum, tesné spojenia (TJ) hrajú dôležitú úlohu v integrite kože, pôsobia ako bariéra pre vodu a rozpustené látky a podieľajú sa na diferenciácii, proliferácii, bunkovej polarite a procesoch prenosu signálu buniek. Nedávne štúdie ukázali, že UV svetlo mení expresiu a lokalizáciu jednotlivých proteínov štruktúry TJ, čo následne narúša bariérovú funkciu kože [32].

Aby sa vyhodnotil účinok extraktu zo Salvia haenkei ako možného ochranného činidla proti narušeniu TJs, expresia okludínu sa merala imunocytochémiou po vystavení UVB žiareniu. Obrázky na obrázkoch 8A a 8B ukazujú, že ošetrenie oboma koncentráciami SH indukuje zvýšenie expresie okludínového proteínu, čo podporuje tvorbu spojenia užitočných na udržanie integrity epidermálnej bariéry. Ako sa očakávalo, po vystavení UVB žiareniu bunky vykazujú nepravidelný a nedefinovaný membránový prstenec (obrázok 8A). Ošetrenie SH, najmä pri vyššej koncentrácii, zachováva morfológiu membrány so zachovaním štruktúry porovnateľnej s nestimulovanou kontrolou. SH extrakt podporuje spevnenie spojov a zabraňuje poškodeniu spôsobenému UVB žiarením, pričom zachováva funkčnosť kožnej bariéry.

Filagrínový výraz

Účinok extraktu zo Salvia haenkei na expresiu proteínu filagrínu (FLG) bol hodnotený imunocytochémiou. Filaggrín je štrukturálny proteín, ktorý je základom pre vývoj a udržiavanie kožnej bariéry. Výsledky na obrázkoch 9A a 9B ukazujú koncentračne závislé zvýšenie expresie filagrínového proteínu po 24-hodinovom ošetrení SH extraktom. Okrem toho expresia F-aktínového proteínu indikuje pravidelnú distribúciu buniek po ošetrení SH, čo vedie k dobre organizovanej štruktúrnej kontinuite epiteliálnej bariéry. Tieto údaje naznačujú, že SH má priaznivý vplyv na kožnú bariéru, zlepšuje expresiu filagrínu, ktorý je nevyhnutný pre správnu tvorbu a funkciu pokožky.

Expresia metaloproteinázy

Vystavenie kože ultrafialovému žiareniu vyvoláva poškodenie extracelulárnej matrice (ECM), čo spôsobuje zvrásnenie, ochabnutie a ochabnutosť kože, čo sú hlavné charakteristiky starnutia pokožky. Matrixové metaloproteinázy (MMP) sú hlavné zodpovedné za degradáciu zložiek ECM, ako sú kolagén, elastín, fibronektín a proteoglykány [33].koľko cistanche vziaťVeľký počet štúdií zdôrazňuje, že vystavenie kože UV žiareniu vyvoláva zvýšenú reguláciu rôznych MMP, čo ovplyvňuje vzhľad a zdravie pokožky [34-37].

Výsledky na obrázku 10 ukazujú, že UVB žiarenie zvyšuje expresiu mRNA želatinázy MMP-2, ktorá degraduje kolagény bazálnej membrány a denaturované štrukturálne kolagény [38]. Liečba SH je schopná významne znížiť hladiny MMP-2 mRNA (SH 0.01-0.1-10 ug/ml） čo naznačuje aktivitu extraktu SH pri udržiavaní štrukturálnej integrity bunky koža, poškodená fotostresom.

DISKUSIA

Starnutie pokožky je kumulatívny účinok vnútorných a vonkajších faktorov, ktoré vedú k ochabovaniu pokožky, vyvolávajú rednutie, stuhnutie a stratu pružnosti. Koža je prvou bariérou medzi organizmom a prostredím, preto je nevyhnutné zachovať jej funkčnú a anatomickú integritu. Okrem prirodzených procesov starnutia a stavov súvisiacich so starnutím, ako je cukrovka, menopauza atď., môžu na štruktúru pokožky pôsobiť aj vonkajšie faktory; najmä fotopoškodenie, znečistenie alebo faktory životného štýlu (fajčenie, strava, emočný stres atď.) môžu narušiť štruktúru a funkcie kože [39,40]. Keratinocyty sú hlavnými zložkami epidermis, poskytujúce bunkový základ pre vonkajšiu bariéru; v tejto práci bola bunková línia ľudských keratinocytov HaCaT vystavená stresovým faktorom, ako sú voľné radikály a ultrafialové žiarenie B, aby sa napodobnilo prirodzené starnutie pokožky, čím sa zmenila bariérová funkcia. Salvia hankie bola nedávno identifikovaná ako potenciálne činidlo proti starnutiu, čo naznačuje jej možné použitie pri starnutí pokožky a poruchách súvisiacich so starnutím pokožky; preto bol účinok extraktu z tejto rastliny hlboko skúmaný na parametre súvisiace so starnutím pokožky, udržiavaním integrity pokožky a fyziologickými podmienkami. Predpokladá sa, že produkcia reaktívnych foriem kyslíka alebo voľných radikálov prostredníctvom normálnych endogénnych metabolických procesov alebo UVR a znečistenia prispieva k procesom starnutia pokožky. Koža je náchylná na rôzne redoxné reakcie a redoxná rovnováha je nevyhnutná pri udržiavaní homeostázy kože. Nízke koncentrácie ROS vyvíjajú fyziologické aktivity, ale zvýšené hladiny týchto druhov sa podieľajú na aktivácii dráh, čo vedie k zvýšenej degradácii kolagénu, akumulácii elastínu, aktivácii matrix-degradujúcich metaloproteáz atď. [41]. Okrem toho ROS hrá významnú úlohu v patologických procesoch vrátane starnutia, zápalu, poranení a patogenézy niekoľkých kožných ochorení, ako je psoriáza a vitiligo [42]. Je zaujímavé, že extrakt zo Salvia haenkei znižuje hladiny ROS v bazálnych podmienkach, podmienkach oxidačného stresu a stresových podmienkach vyvolaných UVB žiarením, čo naznačuje potenciálny ochranný účinok proti zmenám sprostredkovaným ROS [22].

Na podporu predtým pozorovaného antiagingového účinku Salvia hankie sme v tejto práci dokázali schopnosť SH extraktu znižovať starnutie v keratinocytoch stimulovaných UVB žiarením. Výsledky ukazujú, že SH je schopný znížiť génovú expresiu markerov starnutia p21 a p27, ktoré sú stimulované UVB žiarením. Je zaujímavé, že extrakt SH vykazuje sľubnú aktivitu pri znižovaní zápalovej reakcie podporovanej fotopoškodením v bunkách znížením transkripcie interleukínov. Okrem toho sme pútavo preukázali, že extrakt zo Salvia haenkei indukoval expresiu proteínu Sirtuinl nielen po strese, ale aj za základných podmienok, čo ukazuje sľubnú aktivitu pri spomaľovaní procesov starnutia. Ukázalo sa, že rodina sirtuínov, a najmä SIRT1, hrá úlohu pri starnutí-fotostarnutí, najmä prostredníctvom inhibície MMP a následnej degradácie kolagénu; viaceré štúdie zdôraznili jeho ochrannú úlohu pri fotostarnutí sprostredkovanom UVB žiarením. Ukázalo sa, že prírodné zlúčeniny ako juglon (5-hydroxy-1,4-naftaléndión) obnovujú SIRT1 na normálnu úroveň po liečbe UVB, čo naznačuje, že SIRTI môže hrať úlohu pri prevencii karcinogenézy vyvolanej UVB žiarením. [29]. Naše výsledky tiež naznačujú možné zapojenie sirtuínov do procesu reparácie po UVB strese a ich úlohu pri udržiavaní homeostázy epidermis.

Bežné zápalové kožné poruchy, ako je atopická dermatitída a psoriáza, ako aj procesy starnutia vykazujú zníženú bariérovú funkciu a odpoveď epidermálnych buniek na narušenie bariéry môže zhoršiť, udržať alebo dokonca spustiť takéto stavy. Výsledky tejto práce odhalili silnú schopnosť SH obnoviť integritu kožnej bariéry moduláciou niekoľkých proteínov zapojených do týchto procesov. Najmä bolo pozorované, že stimulácia transkripcie okludínu a filagrínu indikovala zosilňujúci účinok na adhézie medzi bunkami. Dedičný a získaný nedostatok filagrínu ovplyvňuje epidermálnu bariéru a mení organizáciu

cytoskeleton keratínové filamenty a štruktúra zrohovateného obalu kože [43]. Okrem toho defekty v expresii FLG vyvolávajú pokles počtu keratohyalínových granúl, výrazný pokles koncentrácie prirodzeného zvlhčujúceho faktora (NMF) a alkalizáciu pH kože [44]. Okrem toho sú v súvislosti s procesmi starnutia dobre opísané zmeny v klaudínoch a okludínových proteínoch, ktoré patria medzi proteíny tesných spojení (Tight junctions, TJ). TJ sú zodpovedné za utesnenie medzibunkového priestoru medzi epitelovými bunkami, vytvárajú funkčnú bariéru a podieľajú sa na bunkovej proliferácii a diferenciácii [45]. Ukázalo sa, že extrakt zo šalvie haenkei zlepšuje expresiu filagrínu a zachováva okludínovú lokalizáciu na bunkových membránach, narušenú UVB žiarením. Dodatočná aktivita extraktu SH pri udržiavaní zdravej pokožky bola preukázaná jeho schopnosťou znižovať transkripciu matrixových metaloproteináz 2 (MMP-2), stimulovanú UVB žiarením. Zvýšená regulácia MMP uľahčuje starnutie a kožné patológie tým, že degraduje kolagén a elastín, čo spôsobuje poškodenie extracelulárnej matrice (ECM) [33, 38], takže zníženie týchto proteináz je v kontexte starnutia kože cenné.

Pozitívne účinky liečby SH pozorované v tejto štúdii na najbežnejšie molekulárne parametre kože potvrdila aj nedávna klinická štúdia vykonaná na kohorte päťdesiatich belošských žien vo veku 45 až 60 rokov [46]. Salvia hankie bola podávaná v krémovej formulácii a niekoľko parametrov, ako je začervenanie a elasticita pokožky, hĺbka vrások a antioxidačný potenciál, boli hodnotené klinickým a inštrumentálnym hodnotením, ako aj sebahodnotením subjektmi. Výsledky tejto štúdie odhaľujú účinnosť SH pri zmierňovaní poklesu kože pri každodennej aplikácii v kontexte stredného starnutia pokožky. V skutočnosti po 84 dňoch aplikácie bola pokožka žien pružnejšia a vykazovala nižší počet červených oblastí a plytších vrások. Okrem toho štúdia demonštruje progresívny nárast antioxidačnej schopnosti pokožky po každodennej aplikácii krému [46].

Ako ochranný úkryt tela pred vonkajším prostredím je koža neustále vystavená potenciálnemu poraneniu, a preto je hojenie rán nevyhnutným procesom pre prežitie všetkých organizmov. Vzhľadom na preukázanú schopnosť SH udržiavať zdravú a nepoškodenú pokožku sme predpokladali, že tento extrakt by mohol pomôcť aj pri zlepšovaní regenerácie pokožky tým, že je užitočný pri oprave kožných lézií. Nakoniec sa teda zvážila aktivita SH pri migrácii keratinocytov, ktorá je kľúčovým krokom pri obnove kožnej bariéry po poraneniach. Liečba extraktom SH odhalila zaujímavú aktivitu, ktorá je schopná zvýšiť rýchlosť migrácie HaCaT, čo demonštruje silný účinok na obnovenie epitelového poškodenia po léziách. Keďže migrácia je kritickým prvkom v procese hojenia rán, naše údaje, berúc do úvahy aj nehyperproliferatívnu aktivitu extraktu, naznačujú potenciálny účinok SH extraktov pri rýchlejšom pôsobení proti účinku poranenia v kožnej bariére, čím sa znižuje riziko vzniku infekcií.

Naše údaje poukazujú na to, že extrakt zo šalvie haenkei je užitočnou zlúčeninou buď na pomoc pri obnove bariéry, alebo na tlmenie reakcie epidermálneho stresu. Súčasne s nedávnym testom na ľuďoch táto práca poskytuje ďalšie poznatky o mechanizmoch podieľajúcich sa na pozitívnom účinku extraktu na starnutie pokožky.

Táto práca na podporu predchádzajúcich prác [18, 46] identifikuje zvláštnejším spôsobom molekulárny mechanizmus spojený s účinnosťou šalvie hankie pri modulácii kožných parametrov, čo podčiarkuje význam šalvie ako príťažlivého činidla užitočného v boji proti starnutiu. a kožné poruchy súvisiace so starnutím.

MATERIÁLY A METÓDY Bunková kultúra a UVB ožarovanie

HaCaT bunky (ľudské spontánne imortalizované keratinocyty) sa kultivovali v Dulbeccovom modifikovanom Eaglovom médiu s vysokým obsahom glukózy (DMEM) doplnenom 10 percentami fetálneho bovinného séra (Life-Technologies, Waltham, MA, USA), 2 mM glutamínu, 100 U/ml penicilínu a 100 ug/ml streptomycínu (Lonza, Basilea, Švajčiarsko). Bunky sa udržiavali vo vlhkej atmosfére s 5 percentami CO2 vo vzduchu a inkubovali sa pri 37 stupňoch.

Keď to experimentálny protokol požadoval, bunky boli vystavené 30 KJ/m² UVB žiareniu, ktoré dodávala Philips Medical Narrowband UVB PL-S lampa. Aby sa zabránilo absorpcii svetla tkanivovým kultivačným médiom, bolo toto pred ožiarením odstránené a nahradené DMEM FBS a červeným fenolom bez obsahu podľa protokolu ožarovania [47]. Po UVB ožiarení boli bunky kŕmené čerstvým rastovým médiom alebo použité na experimenty podľa protokolu.

Test životaschopnosti buniek - vylučovací test trypánovou modrou 35 x 1 0 3 buniek sa nanieslo na 12-jamkové platne a po inkubácii cez noc sa vystavili rôznym koncentráciám hydroetanolického extraktu Salvia haenkei podľa experimentálnych protokolov. Extrakt bol láskavo poskytnutý spoločnosťou IBSA Farmaceutici Italia (Lodi, Taliansko) a predstavuje obsah značkovacej kyseliny rozmarínovej 0,6 % w/w podľa HPLC. Po ošetrení boli bunky premyté, oddelené 0,25 percentami trypsínu -0, 2 percent EDTA a suspendované v trypánovej modrej (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) v pomere 1:1 v roztoku média. Bunky sa spočítali pomocou komorového Burkerovho hemocytometra.

ROS fluorescenčný test

ROS bola kvantifikovaná pomocou 2',7'-dichlórfluoresceín-diacetátu (Hz-DCF-DA, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), ako už bolo opísané [48]. V stručnosti, bunky (5x10') sa naočkovali do 96-jamkových doštičiek, nechali sa priľnúť cez noc a potom sa vystavili SH extraktu na 3 alebo 24 hodín. Ako pozitívna kontrola sa použil N-acetylcysteín 5 mM (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA).

Pre podmienky oxidačného stresu bola hladina ROS meraná po pridaní 50 μM Hz-DCF-DA v neprítomnosti alebo prítomnosti H2Oz [48]. Intenzita fluorescencie DCF bola meraná pri excitácii 485 nm - emisia 535 nm, s použitím Multilabel Plate Reader VICTOR X3 (PerkinElmer, Waltham, MA, USA).

Na vyhodnotenie hladín ROS v podmienkach stresu UVB bol protokol mierne upravený inkubáciou buniek v SH ošetrení - 50 μM Hz-DCF-DA roztoku v PBS. Po 25 minútach inkubácie pri 37 stupňoch sa platňa vystavila UVB žiareniu a intenzita fluorescencie DCF sa okamžite zmerala pri excitácii 485 nm - emisia 535 nm pomocou čítačky multilabelových platní VICTOR X3 (PerkinElmer, Waltham, MA, USA).

Imunofluorescenčná mikroskopia

10x104 buniek sa naočkovalo na sklenené krycie sklíčka vopred potiahnuté kolagénom v 24-jamkových doštičkách, nechalo sa prichytiť cez noc a ošetrilo sa SH extraktom podľa protokolu. Na detekciu -katenínových a okludínových proteínov boli bunky vystavené UVB žiareniu, ako je opísané v protokole vyššie. Po ožiarení sa bunky nakŕmili čerstvým rastovým médiom alebo sa použili na experiment podľa protokolu. Na imunofluorescenčný test boli bunky 4 hodiny po ožiarení UVB premyté, fixované 4% formaldehydom, permeabilizované 0,1% Tritonom X-100 v PBS a farbené počas 1 hodiny pri 37 stupňoch rôznymi protilátkami špecifickými pre proteín: myší monoklonálny anti-okludín (Invitrogen Life Technologies, Waltham, MA, USA), myší anti-filaggrín (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA). Po premytí PBS boli bunky inkubované so sekundárnymi protilátkami/fluoresceín izotiokyanátom (Alexa Fluor 488 anti-myší alebo Alexa Fluor 536 anti-králičí imunoglobulín G, Molecular Probes, Invitrogen Life Technologies, Waltham, MA, USA) a s faloidínom počas 1 hodiny pri izbová teplota. Po 10 minútach pôsobenia RNázy boli krycie sklíčka pripevnené na sklenené sklíčka pomocou Mowiolu 40-88 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) a bol pridaný propídiumjodid. Obrázky boli získané pomocou konfokálneho mikroskopu LSM 800, zväčšenie 60X, softvér ZN 2.1 blue Edition (Carl Zeiss, Jena, Nemecko) a kvantifikované pomocou softvéru ImageJ.

Štatistická analýza

Štatistická analýza sa uskutočnila s použitím GraphPad Prism verzie 7.02 pre Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Pokiaľ nie je uvedené inak, výsledky sú prezentované ako priemer plus SEM. Použil sa Studentov t-test a hodnoty p<0.05 were="" considered="" statistically="">

Skratky

AJ:adherens križovatka; ECM: extracelulárna matrica;FLG: filagrín; Hz-DCF-DA: 2',7'-dichlórfluoresceín-diacetát; H2Oz: peroxid vodíka; MMP: matricová metaloproteináza; NAC: N-acetylcysteín; NMF: faktor; ROS: prirodzená hydratácia s reaktívnym kyslíkom

druhy; SIRTl: Sirtuinl; SH: Kapsička zo šalvie; TJ: tesné spojenie; UVB: ultrafialové žiarenie B.

Tento článok je prevzatý z www.aging-us.com